Наши исследования или основные исследования сосредоточены на микробном разнообразии, филогеномике и применении ферментации, уделяя особое внимание разнообразию дрожжей, адаптации и, в частности, промышленному применению биологии дрожжей. В частности, мы изучаем эффективность брожения, производство аромата и стрессоустойчивость дрожжей. Таким образом, наши последние достижения связаны с филогеномикой дрожжей, в частности из Патагонии.
Затем мы используем их для получения новых лагерных дрожжей для брожения пива, но мы также используем новые дрожжи для пива с низким содержанием алкоголя. В целом, мы используем различные омические методы и экспериментальную эволюцию для разработки этих новых дрожжей для биогенологического применения. В настоящее время мы используем различные методы, такие как секвенирование генома, длинное секвенирование генома, а также транскриптомику.
Затем мы используем эту информацию для проведения экспериментальной эволюции различных штаммов, которые у нас есть, а затем мы пытаемся проверить некоторые геномные изменения с помощью методов CRISPR или различных методов трансформации дрожжей, и таким образом мы проникаем в молекулярные детали адаптации дрожжей к ферментативной среде. Итак, перед нами стоят две большие задачи. Один из них заключается в создании новых дрожжей для лагера с эффективным брожением пива, а другой — наоборот.
Мы хотим получить новые сорта, особенно из Патагонии, которые способны производить пиво с низким содержанием алкоголя. Я бы выделил два основных результата нашей лаборатории. Одна из них заключается в том, что мы определяем происхождение из Патагонии матери дрожжей лагера, Saccharomyces eubayanus.
И теперь мы также создали десятки новых гибридов лагера для брожения пива. Я думаю, что это два главных вывода нашего исследования. Для начала выберите образец из трансформированного участка штамма дрожжей и введите его в пептонную среду дрожжей, содержащую 5% глюкозы и 200 микромолярного гигромицина.
Инкубируйте культуру при температуре 25 градусов Цельсия без встряхивания в течение 24 часов. Обновите культуры в свежей среде в разведении от 1 до 10 перед инкубацией еще на 24 часа. Промойте клетки дрожжевой пептонной средой без сахара, затем заведите их в исследуемую среду в разведении от 1 до 10.
Дополните исследуемую среду люциферином до конечной концентрации 3 миллимоляра и 200 микромолярным гигромицином для поддержания стабильности плазмиды. Для тестирования роста смешанных сахаров используйте глюкозо-мальтозную матрицу с повышением концентрации глюкозы и мальтозы в пептонной среде дрожжей. Выдайте по 200 микролитров культуры в каждую лунку 96-луночного планшета.
Теперь с помощью люминометра можно измерять люминесценцию и оптическую плотность на глубине 620 нанометров каждые 30 минут в течение 72 часов. Установите время интеграции равной одной секунде и отключите затухание, чтобы обеспечить непрерывную активность репортера и мониторинг плотности ячеек. Для отбора проб ферментации и контроля люминесценции сначала растворяют солодовый экстракт в воде для приготовления среды солодового экстракта.
Предкультура трансформировала штаммы дрожжей в 5 миллилитрах среды YPD при температуре 20 градусов Цельсия с перемешиванием при 200 об/мин в течение 24 часов. Переложите предварительную культуру в 50 миллилитров среды солодового экстракта, затем инкубируйте при температуре 20 градусов Цельсия с перемешиванием при 200 оборотах в минуту еще 24 часа. Центрифугируйте культуру при 21, 380 G в течение одной минуты при комнатной температуре для забора клеток.
Затем ресуспендируют клетки в 12-градусной тарелке солодового экстракта среды в трех количествах для 50 миллилитровых микроферментаций. Добавьте в среду 0,3 миллиграмма на литр хлорида цинка для повышения эффективности брожения. Рассчитайте объем инокулюма, чтобы обеспечить постоянную плотность клеток среди репликатов.
Заквашивают приготовленную среду рассчитанным количеством посевного материала. Затем поместите культуры при температуре 20 градусов Цельсия без встряхивания в течение 14 дней. Отслеживайте ход ферментации, ежедневно записывая потерянный углекислый газ.
Взвешивайте сосуды каждый день, чтобы измерить совокупную потерю веса в качестве индикатора производства углекислого газа. Для контроля люминесценции периодически отбирайте по 200 микролитров от каждой микроферментации. Добавьте люциферин для достижения конечной концентрации 3 миллимоляра.
Измеряйте люминесценцию и оптическую плотность на глубине 620 нанометров с помощью люминометра без затухания и времени интегрирования в одну секунду. Эписомальная репортерная плазмида pRS426-PMAL32-LUC-HphMX была успешно сконструирована с помощью промотора PMAL32 люциферазы ORF и кассеты hphMX. Дифференциальная активность люциферазы наблюдалась среди трех трансформированных штаммов при различных концентрациях глюкозы и мальтозы.
CBS12357T и CL467.1 показали активацию без глюкозы, в то время как QC18 требовал концентрации глюкозы выше 1% для активации. В условиях микроферментации все три трансформированных штамма продемонстрировали сильную люминесценцию, достигающую пика в разное время. Люминесценция отсутствовала у штаммов дикого типа.
