Протокол, разработанный Лиз, позволяет определить скорость оплодотворения белой мухи. Применение этого метода улучшит наше понимание поведения и экологии белыхф. Белофли являются гаплодиплоидами, поэтому уровень оплодотворения равен соотношению полов в яйцеклетке.
Этот протокол является первым описан для белыхфы, как нам известно, и может быть завершена в течение трех часов. Для начала сделайте замыкаемое отверстие в крышке чашки Петри, чтобы вставить и удалить взрослых белофли. Настройка влажности камеры и моды зонд, вставив тонкую булавку на удобный рабочий угол в расплавленной пипетки отзыв, чтобы сделать тонкий зонд.
Дополнительно, удлиненные стеклянные советы пипетки с теплом для облегчения обработки яиц белокрылки. Затем, позвольте самке белофлиoviposit на чистом листе, вырезать, чтобы поместиться на агар в чашке Петри. Во время овипозиции белой мухи очистите слайд микроскопа с мылом и водой.
Высушите его хорошо и растянуть кусок парафина пленки на одном конце, чтобы жидкости для формирования капель и яиц, чтобы быть более легко увидеть. Для дехорионатных яиц используйте стеклянную пипетку Pasteur, чтобы добавить капли 83% раствора гипохлорита натрия в парафиновую пленку прямо перед удалением взрослых и сбором яйцеклеток. Отбеливатель и ледниковая уксусная кислота являются коррозионными.
Они должны быть обработаны с перчатками в капюшоне или хорошо проветриваемой области. DAPI также является раздражителем и должны быть обработаны с перчатками. Затем снимите взрослых белофли с листа и поместите лист под микроскоп.
Аккуратно поднимите каждое яйцо из его основания, пока pedicel удаляется из листа. Практика на многих яйцах перед выполнением этого протокола. Поднимите яйца медленно от основания и полностью снять его с листа, как только вы можете видеть, что яйцо pedicel удаляется из листа.
Перенесите два-три яйца на каждую каплю отбеливателя и оставьте их на 10 минут. Чтобы исправить яйца, используйте стеклянную пипетки, чтобы отказаться от отбеливателя. Затем добавьте капли ледниковой уксусной кислоты и подождите три минуты.
Затем удалите ледниковую уксусную кислоту и добавьте капли раствора Кларка. Затем подождите 10 минут, пока большая часть раствора не испарится. Добавить капли 70% этанола и ждать снова в течение 10 минут.
Чтобы испачкать яйца, сначала удалите остаточный этанол. Затем добавьте капли 1xPBS к яйцам, чтобы получить рН близко к семи. Поместите слайд микроскопа в камеру влажности, чтобы предотвратить высыхание.
Через 30 минут удалите 1xPBS и добавьте капли по 1 микрограмму на миллилитр DAPI. Положите слайд микроскопа в темную камеру влажности и подождите не менее 15 минут. Для мытья яиц сначала удалите раствор DAPI.
Затем добавьте капли 1xTBST к яйцам. Через пять минут удалите 1xTBST. Повторите эту стирку еще два раза в общей сложности три моет.
После окончательной стирки, тщательно пипетки все яйца из парафильма на чистую часть слайда микроскопа. Удалите избыток TBST и добавьте 20 микролитров монтажных средств массовой информации. Наконец, поместите чистую крышку слайда на верхней части яйца, печать крышки слайд с четким лаком для ногтей для долгосрочного хранения, и приступить к визуализации с помощью флуоресцентного микроскопа.
Дехорионация яйцеклеток с последующим ядерным окрашиванием DAPI позволила при назначении оплодотворения и секса эмбриона при наблюдении с помощью флуоресцентного микроскопа. Самка пронуклея находится в центре как оплодотворенной женской яйцеклетки, так и неудобренной мужской яйцеклетки, а сперма видна как яркая полоса вблизи вершины только женской яйцеклетки. Одно из применений этого метода заключается в том, чтобы определить, влияют ли бактериальные эндоизимбиенты на первичные половые соотношения белофли.
Например, первичные половые соотношения яйцеклеток, отложенных инфицированными Рикетцией и неинфицированными белофлями B.tabici, не показали существенной разницы между соотношением полов в двух лечениях. Что касается яйцеклеток, взбитых до совершеннолетия, аналогичные результаты были замечены для Рикетсия инфицированных и неинфицированных взрослых, не предоставляя никаких доказательств, по крайней мере в этом исследовании, для большего уровня оплодотворения Рикетсия инфицированных женщин. Используя этот протокол, можно определить, может ли межспецифическая сперма оплодотворять яйцеклетки.
Если оплодотворение не наблюдается, можно было бы резервное время и посмотреть, если сперма передается во время спаривания, глядя в spermatheca женщины. Если оплодотворение все же происходит, можно сравнить соотношение полов взрослых с коэффициентом оплодотворения, чтобы определить жизнеспособность развития гибридного потомства.
