Un modelo de Disturbed inducida por el flujo de Aterosclerosis en la arteria carótida del ratón por la ligadura parcial y un método sencillo para el aislamiento de ARN del endotelio carótida

Resumen

Esto describe una cirugía de ligadura de la carótida parcial, lo que provoca trastornos condiciones de flujo y posterior desarrollo de la aterosclerosis (en dos semanas) con intraplaca neovascularización (en cuatro semanas) en el ratón de la arteria carótida común. También describe un nuevo método de aislamiento de ARN de la carótida íntima, proporcionando ARN de alta pureza endoteliales.

Resumen

A pesar de la estrecha asociación conocida, evidencia la vinculación directa alteración del flujo de la aterogénesis ha estado ausente. Recientemente, hemos utilizado una versión modificada de la carótida métodos de ligadura parcial [1,2] para demostrar que forma aguda induce condiciones de flujo bajo y oscilante, dos características fundamentales de la alteración del flujo, en el ratón de la arteria carótida común. El uso de este modelo, hemos proporcionado evidencia directa de que el flujo alterado de hecho conduce a un desarrollo rápido y robusto aterosclerosis en ratones apolipoproteína E nocaut [3]. También hemos desarrollado un método de preparación de ARN endoteliales de alta pureza a partir de la íntima carotídea ratón [3]. El uso de este modelo de ratón y el método, se encontró que la ligadura parcial provoca la disfunción endotelial en una semana, seguido por la formación de ateroma robusto y rápido de dos semanas en un modelo de ratón hiperlipidémicos junto con las características de la formación de lesiones complejas, como la neovascularización intraplaca por cuatro semanas. Esta rápida

Protocolo

1. La ligadura parcial de la arteria carótida izquierda

1. Los ratones son utilizados en ~ 8 semanas de edad. El peso de los ratones se recomienda tener al menos 18 gramos.
2. Esterilizar los instrumentos durante 30 segundos en el esterilizador de instrumentos de cuentas y deje que se enfríe
3. Inducir la anestesia con ketamina (80mg/kg) y xilazina (10mg/kg) anestesia intraperitoneal (ip) o una alternativa aprobada por IACUC. Para la inyección ip, inyectar ratón en el cuadrante inferior izquierda del abdomen.
4. Coloque el ratón en una cámara de calentamiento hasta que esté completamente anestesiado. Verificar la profundidad de la anestesia con la respuesta a una pizca dedo del pie.
5. Lugar del ratón en una etapa quirúrgica, en posición supina (boca arriba vientre lado) posición. Tape las patas delanteras, las palmas hacia arriba y la única patas traseras hasta el escenario.
6. Aplicar generosa cantidad de agente depilatorio (por ejemplo, Nair) en el cuello entre la mandíbula y el esternón. Masajear suavemente hasta que todo el pelo se elimina.
7. Limpie el agente depilatorio y aplicar generosa cantidad de Betadine al área depilada.
8. Prepare una pulgada de largo secciones de sutura de seda 6-0 para ligaduras. Cada ratón se necesitan dos piezas de sutura.
9. Utilizando unas tijeras pequeñas afilado, haga una incisión vertical 4-6mm en la parte media del cuello. La piel y la fascia subyacente necesita ser cortado.
10. Mueva la glándula parótida izquierda de la línea media hacia la izquierda y comenzar la disección sin rodeos apenas a la derecha de la tráquea. Usted debe ser capaz de identificar la palpitante arteria carótida común izquierda con facilidad.
11. Siga la arteria carótida común caudalmente hasta encontrar la bifurcación.
12. Sin rodeos disecar la bifurcación para exponer los siguientes cuatro ramas distales de la arteria carótida común izquierda: arteria carótida externa, arteria carótida interna, arteria occipital y la arteria tiroidea superior. Estos vasos, tiroides, especialmente superior, puede ser frágil. Tenga mucho cuidado con su disección.
13. Ligar la carótida externa por encima de la tiroidea superior con sutura de seda 6-0. Para ello, pase una pinza por debajo de la arteria y agarrar un pedazo de sutura precortados con la ayuda de su pinza de otros. Tire suavemente de la sutura que pasan por debajo de la arteria. Ate firmemente evitando cualquier tejido circundante está atrapado en el nudo. Si te atan por debajo del despegue de la arteria tiroidea superior, al final del procedimiento de que efectivamente se ha realizado una ligadura completa que es un modelo muy diferente.
14. Ligar las arterias carótidas internas y occipital, con un nudo con la misma técnica.
15. Verificar la posición de las suturas y la permeabilidad de la arteria tiroidea superior.
16. Aproximado de la piel y la piel cerca usando una pequeña cantidad de tejido-Mend.
17. Los ratones en una cámara de calentamiento hasta la recuperación. Recuperación por lo general tarda de 30 a 60 minutos.
18. Una sola dosis de buprenorfina (0.1mg/kg) debe administrarse inmediatamente después de la cirugía si la anestesia que se utiliza no proporciona alivio del dolor prolongado (es decir, inhalación isoflurano) o si el animal está en peligro en las primeras 24 horas. En nuestra experiencia, la dosis de ketamina para anestesia administrada proporciona una analgesia suficiente cuando la cirugía se lleva a cabo por un cirujano experimentado y no se necesita más analgesia.

2. Ecografía carotídea

1. Para validar si la ligadura parcial inducida perturbado el flujo, el flujo de la carótida debe examinar un día después de la ligadura
2. Inducir la anestesia con isoflurano - Caja de inducción de la anestesia podría ser utilizado si es necesario
3. Lugar ratones anestesiados en el escenario de imágenes, lado boca arriba
4. Los brazos y las piernas para cinta ECG sensor de imagen en el escenario
5. Defoliar cuello mediante la aplicación liberal de Nair (este paso sólo es necesario si no lo ha hecho para el procedimiento de ligadura)
6. Inserte el termómetro rectal para registrar la temperatura
7. Aplicar gel eco en el cuello
8. Inicio en modo-B.
9. Plano de la imagen debe ser de 90 grados (el mando de la sonda debe estar orientada hacia la nariz del ratón)
10. Inferior de la sonda en el cuello del ratón hasta que la imagen se obtiene.
11. Manipular la izquierda del escenario y la derecha hasta la tráquea (en la línea media la estructura) se identifica
12. Identificar la arteria carótida común
13. Etapa de formación de imágenes de inclinación de manera que un ángulo se crea entre el plano de la imagen y la carótida. Cuanto mayor sea este ángulo, mayor será la señal Doppler se.
14. Coloque la onda de pulso Doppler en medio de la carótida común izquierda.
15. Utilizar la corrección de ángulo según sea necesario.
16. Repetir las mediciones en la carótida común derecha.
17. El éxito de la ligadura de la carótida parcial resultará en una reducción general en el flujo (~ 80-90%) en la arteria carótida común izquierda en comparación con el lado derecho, con inversión del flujo de entrada hacia la aorta durante la diástole.
18. Una vez que las imágenes se han obtenido satisfactoria, apague la anestesia, limpie echo gel de los ratones y los ratones libres de resolución de la cintatraints. Coloque los ratones en una cámara de recuperación caliente.

3. La íntima de la carótida de aislamiento de ARN

1. Sacrificio de los ratones por inhalación de CO ₂ de acuerdo con el protocolo institucional IACUC
2. Tape las patas de una toalla de papel.
3. Cortar la piel del ratón desde el abdomen hasta la parte superior del tórax.
4. Abrir la pared abdominal por debajo de la caja torácica con un par de tijeras afiladas.
5. Levantar el esternón con una pinza y corta el diafragma, y ​​luego cortar la caja torácica para exponer el corazón.
6. Corte de la vena cava con unas tijeras.
7. La presión de perfusión (120 mmHg) de 2 a 3 minutos con solución salina normal contiene 10 unidades / mL de heparina a través del ventrículo izquierdo hasta que los pulmones y el hígado se vuelven pálidos.
8. Cortar la piel del cuello y retirar toda la grasa, los músculos y tejidos conectivos hasta las arterias carótidas están expuestos.
9. Coloque el ratón bajo un microscopio de disección.
10. Haga un agujero justo debajo de los sitios de ligadura de la arteria carótida izquierda para la segunda perfusión.
11. La presión de perfusión de nuevo ~ 1 minuto con solución salina normal contiene 10 unidades / mL de heparina a través del ventrículo izquierdo, asegurándose de la carótida izquierda y examinaba.
12. Utilizando una pinza de punta fina y tijeras pequeñas de primavera, retire con cuidado los tejidos peri-adventicia que rodea la carótida. Tenga cuidado de no apretar o estirar las carótidas durante este proceso de limpieza.
13. Corte de la arteria carótida izquierda entre el arco aórtico y los puntos de ligadura por encima de la bifurcación de la carótida.
14. Corte de la arteria carótida derecha entre el punto de arteria subclavia derecha y la ramificación de la bifurcación de la carótida.
15. Transferencia de las carótidas con un plato mm cultura 35, que contienen agua helada HBSS. Si es necesario, retire con cuidado cualquier resto de tejido peri-adventicia.
16. Prepare una jeringa de insulina (3 / 10 ml jeringa) con una aguja 29G, llenando con 150 l buffer de lisis QIAsol (Qiagen) por cada carótida.
17. Con cuidado, inserte la punta de la aguja en un extremo de la arteria carótida.
18. Mientras mantiene la carótida y la punta de la aguja con una pinza, de forma rápida (~ 1 segundo) a ras de la solución amortiguadora de lisis QIAsol (150 l) en un tubo de 1.5 ml (eluido íntima).
19. Enjuague los restos de la carótida (los medios de comunicación + adventicia) de vez en HBSS, lo puso en un tubo de 1.5 ml, y el complemento congelación en nitrógeno líquido.
20. Eluido íntima y las sobras congeladas se utilizan para la íntima o medios de aislamiento + adventicia de ARN utilizando el miRNeasy Mini Kit (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4. Los resultados representativos:

Nos parcialmente ligado izquierdo del ratón arterias carótidas y ecografía se llevó a cabo un día después del procedimiento. Como se muestra en la Figura 1, la ligadura parcial de éxito se reduce la velocidad del flujo sanguíneo y el flujo se invierte (alteración del flujo) en la arteria carótida común izquierda durante la diástole. La ligadura parcial de la ApoE knockout (KO) ratones acompañado de una dieta rica en grasas induce la aterosclerosis robusta en la arteria carótida común (LCA), pero no en la carótida derecha contralateral, en dos semanas (Figura 2). ARN recogido de la íntima carotídea contiene genes marcadores endoteliales como PECAM-1, mientras que sin medial del músculo liso genes marcadores de células tales como SMA (Figura 3).

Figura 1: Esquema de la anatomía de la carótida y la ligadura: Tres ramas de la arteria carótida común (LCA) [arteria carótida externa (ACE), la arteria carótida interna (ICA), y la arteria occipital (OA)] se ligaron, dejando la arteria tiroidea superior (STA) abierto.

Figura 2: Las imágenes de ultrasonido muestran los perfiles de velocidad del flujo y revelan que la ligadura parcial provoca la inversión del flujo (indicado por las flechas) en el LCA durante la diástole. Flujo de RCA se mantiene sin cambios después de la ligadura.

Figura 3: ligadura parcial y la dieta rica en grasas induce rápidamente la aterosclerosis en la ECV de ApoE ratones ApoE KO ratones KO se ligaron parcial y alimentados con la dieta alta en grasa de 1 a 3 semanas.. Las secciones congeladas de LCA fueron teñidos con aceite rojo-O.

Figura 4. Método de la íntima preparación de ARN. Íntima y media de ARN + adventicia (m + a) ARN se obtuvieron a partir de farsa que funciona con RCA y CLP en ratones C57BL / 6. ARN se analizaron semi-cuantitativos de RT-PCR (A) y qPCR (B, C) ​​de PECAM-1 y α-SMA con 18 años como un control interno. Los gráficos de barras son la media ± SEM, n = 3.

Discusión

En este procedimiento, la identificación adecuada de todas las ramas de la carótida común, incluyendo la carótida externa, la carótida interna, arteria occipital y la arteria tiroidea superior es esencial. También es importante verificar el patrón de flujo con ultrasonido como se ha demostrado. En nuestras manos experimentadas, nuestra tasa de éxito de las cirugías de ligadura parcial basado en los estudios de ultrasonido de más de 500 ratones es superior al 90%. De la carótida íntima preparaciones de ARN, e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter Internationl Inc.	2B1323
Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe)	Tyco Healthcare, Covidien	8881600145
HBSS	Cellgro	21-023
miRNeasy mini kit (including, QIAzol)	Qiagen	217004
Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System	VisualSonics, inc.	a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice	or similar system
6-0 Silk Suture, sterile	Covidien	s-1172 c2
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5675	or similar
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	or similar
Tissue Mend II	Webster Veterinary	07-856-7946