שיטת איסוף Fungiform (טעם) ואדומות מן הלשון האדם

Summary

הידע של המנגנונים המולקולריים שבבסיס התמרה התעורר אצלם נהנתה לאחרונה התקדמות משמעותית, בעיקר בשל שימוש במודלים של בעלי חיים. עם זאת, מגוון רחב של רגישות וספציפיות טעם בקרב היונקים מחקרים צווי ברקמות אנושיות. אנו מתארים טכניקה ביופסיה כדי לאסוף טעם תאים חיים מ גבשושיות על הלשון האנושית.

Abstract

חוש הטעם הוא קריטי עבור חיי אדם. הוא מיידע את הגוף על איכות המזון יהיה ingested פוטנציאלי ומעורר תהליכים מטבוליים כי להכין את העיכול לעיכול. התקדמות יציבה נעשית להבנת אירועים ביוכימיים מוקדם המולקולריים שבבסיס התמרה טעם (לסקירה, ברסלין ו ספקטור, 2008 ^1). עם זאת, ההתקדמות עד כה הביאה במידה רבה במודלים של בעלי חיים. עם זאת, מאז הבדלים מסומן סגוליות הקולטן צפיפות קולטני להשתנות בין המינים, התמרה טעם אנושי שתובן רק באמצעות רקמות הטעם האנושי. כאן אנו מתארים טכניקה ביופסיה כדי לאסוף אדם fungiform ואדומות, נראה כמו מבנים מעוגלים הקדמי ורוד, על 0.5 מ"מ בקוטר המכילים בלוטות הטעם. גבשושיות אלו ביופסיה משמשים למטרות מספר כולל בידוד של תאים ניצן קיימא טעם, ב אימונוהיסטוכימיה באתרו הכלאה, ובאמצעות טכניקות של ביולוגיה מולקולרית, לזיהוי של טעם ספציפי חלבונים חדשים.

Protocol

1. מבוא שיקולים כלליים

ההליך כרוך בהרדמה מקומית כללית של אזור (1 ס"מ ²⁾ קטן של פני השטח הגבי של הלשון הקדמי, ואחריו הסרת מספר (6-8) של fungiform (טעם) ואדומות מאזור זה בהרדמה באמצעות קפיץ מיקרו מעוקל , מספריים (מקפרסון-Vannas סוג # SR 5603, Roboz, Rockville, MD). הורידו fungiform ואדומות כ 0.25 מ"מ ³ כל אחד. יש מעט מאוד אי - ואדומות (טעם) רקמת האפיתל להסיר יחד עם כל פטמית. טופס חדש ואדומות באזור זה לאחר 3 עד 5 שבועות ולהשיב תפקוד בלוטות הטעם (שפילמן ו ברנד, תצפיות לא פורסם). אין השפעה ניכרת על טעם או טעם של מזון לאחר הסרת כמות קטנה של חומר זה הטעם. ממחקרים כי יש לספור את בלוטות הטעם היחיד בלשון אדם מבוגר, זה יכול להיות מעריכים כי לשון האדם מכיל כ 5000 בלוטות הטעם. ההליך שלנו מסיר לכל היותר 20-25 אלה בלוטות הטעם (בממוצע, ~ 3.5-4 בלוטות הטעם לכל fungiform פטמית בבני אדם) ^2, או כ -0.4% מכלל תושבי העיר. בנוסף אין כאב הקשור לאובדן כירורגית של רקמה זו. האדם מרגיש, כמובן, כאב קל במקום ההזרקה בלבד, כמו מחט נכנס הלשון. לאחר הרדמה יש נשחק, יש אי נוחות קלה ולפעמים פחות מיום, אבל נוחות זה הרבה פחות ממה שחווים לאחר בטעות "נושך" לשון אלה.

בשנים האחרונות פיתחנו הליך חלופה שאינה כוללת הרדמה. הטכניקה להסרת רקמות זהה עבור שניהם. ההבדל היחיד בהליך היא כי המנתח הוא מוגבל עוד שטח 1 ² ס"מ קוטר שבו הרדמה טופלה. במקום זאת הוא / היא יכול לבחור בכל אתר על פני השטח הגבי של הלשון היכן ואדומות בולט להופיע. המספר הכולל של ואדומות להסיר מוגבלים ל 6-8 בטכניקות שניהם, עם או בלי הרדמה אם מבוצע כראוי, אי הנוחות של הוצאת 6-8 טעם ואדומות fungiform נחשב פחות בעיה בהשוואה הכאב הקשורים לניהול של הרדמה מקומית סקירה כללית של אנשים שעברו שני הליכים, כלומר, עם או בלי הרדמה, הראה כי רוב מכריע של הנבדקים היה לוותר ללא הרדמה מקומית בכל ביופסיות בעתיד. המנתח שפיתח את הטכניקה הזו (AIS) ועמיתיו מספר לימד על ידי המחבר שביצע ביופסיות ללא הרדמה, ניסיתי את זה על עצמם מעידים כי אי הנוחות היא זמנית והיא נחשבת פחות מזו של הלשון אחד של נשיכה. לבסוף, עשרות אנשים שהסכימו להיות ביופסיה נשאלו אם הם יהיו מוכנים לנסות הסרת פטמית אחד בלי הרדמה ואם לשפוט שזה יהיה כואב מדי הם היו עוברים הרדמה, הסכימו הכל כדי להמשיך עם ההסרה של ואדומות ללא הרדמה.

ביופסיה כולו לא אמור לקחת יותר מ 5-10 דקות. אם הרדמה הוא מועסק עוד 2-3 דקות הוא הוסיף. ביופסיה מבוצעת בדרך כלל בחוץ בשעות הבוקר. לפני ביופסיה, מתנדבים מצווים לאכול ארוחה קלה כשעתיים לפני זמן ההתחלה המתוכנן. בשלב ביופסיה, הסכמה מדעת בכתב מתקבל. הכללת קריטריונים בזמן ביופסיה כוללים את אלה עם מחלה כרונית קשה, אם בשליטת תרופות או לא (למשל, כל מחלות במערכת העיכול, מחלות ניווניות, סרטן, dyscrasias דם, אלרגיה הרדמה מקומית, וכו ') בעלי קצב לב גדול יותר 100 או פחות מ 60, לחץ הדם הסיסטולי עולה על 145 או פחות מ 100, לחץ הדם הדיאסטולי עולה על 90 או פחות מ 60, ואת חוות דעתו של המנתח כי הנושא יכול להשתתף במחקר.

לבסוף, חשוב להביא בחשבון כי הליך ביופסיה צריכה להתבצע באותו מתקן שבו רקמה יעובדו לבחינה מאז שלמות רקמות אובד במהירות כפי שציינו פעמים רבות על ידי איכות בירידה של mRNA. כדי למזער את הבעיות הללו הרקמה הלשון אמורה להתבצע במהירות האפשרית.

2. נושא ההכנה

1. הנושא הוא יושב בכיסא שיניים או כיסא עם משענת הראש.
2. בדוק את קצב הלב ואת לחץ הדם בזמן ביופסיה. האם נפילת הנושא מחוץ לטווח של לחץ הדם, קצב הלב או ליכולת האוראלית, המנתח ממליצה לנושא שהוא / היא להפוך את מינויו המיידי לראות רופא.
3. בדוק את חלל הפה לבריאות רקמות כללי, עם תשומת לב האינדיקטורים xerostomia, לשון גיאוגרפית או נגעים הלשון. נושא כל סימני המחלה הפה, כולל הלשון נגעים או xerostomia אינם נכללים במחקר. הדריכו את הנושא כדי לשטוף את הפה במים כדי להסיר את כל פסולת cavit הפהי ' אם יש צורך הלשון הוא ניקה עם scrapper לשון הפנויה להסיר פלאק או פסולת, אשר יכול להתבצע לתוך הלשון במהלך הזרקת ההרדמה. המנתח משתמש פדי גזה סטרילי ביד עטוית כפפה להחזיק את ¼ הקדמי של הלשון כפי שהוא משתרע בין חלל הפה.
4. אם הרדמה משמש, מזרק טוברקולין 1cc עם מד 28 x ½ "מחט 0.25 מ"ל המכיל לידוקאין (2%) עם אפינפרין (1:100,000) מוזרק באיטיות מתחת לפני השטח הגבי של החלק הקדמי של הלשון לתוך באתר אחד . האתר של הרדמה היא דיסטלי לאתר את האוסף, כדי למנוע הפרעה של לידוקאין עם מחקרים עוקבים. לשם השוואה, כמות לידוקאין מוזרק (0.25 מ"ל) הוא כרבע מהסכום שניתן בדרך כלל לחסום העצב טיפולי שיניים (0.8 מ"ל עד 1 מ"ל). לאחר החדרת המחט, אך לפני הזרקה של חומר הרדמה, השאיפה מבטיח כי אין כלי דם הוא פגע. זהירות זה נלקח אף אין זה סביר כי מבחינה אנטומית כלי גדול יהיה פגע קרוב לפני השטח הגבי. העורקים רק על פני השטח הגבי, עורקי לשוני הגב הם כלי דם קטנים הממוקמים בעיקר האחורי יותר בשליש הקדמי, שם מתרחשת קצירת רקמות. העורקים לשוני גדול הוורידים לשוני לרוץ על פני השטח הגחון של הלשון, רחוק מאזור הגב קבלת הרדמה ^3. אזור 1 ס"מ בהרדמה נראה מעט חיוור לעומת הרקמה הסובבת. זאת בשל נפיחות של הרקמה כפי שהוא דוחס את כלי הדם הקטנים. זה גם בשל ההשפעה vasoconstrictive של אפינפרין. אחרי דקה בערך, בדיקה משמש כדי לבדוק את השטח עבור קהות. אם האזור אינו משותק, זריקה שנייה (0.1-0.2 מ"ל) יכול להינתן.

3. ואדומות לשון הסרת טכניקה

1. ברבעון הקדמי של הלשון של הנושא הוא עטוף לתוך גזה סטרילית (איור 1) והחזיק ביד שמאל של המנתח (אם ביצוע ביופסיה עם יד ימין). פינה אחת של גזה נותר פתוח על מנת לאפשר למנתח כדי לנגב את הלשון חינם של רוק. הלשון חייבת להתקיים בחוזקה, אבל, כמובן, לא כדי לגרום אי נוחות מיותרת. קצה האצבע המורה של יד שמאל ממוקמת מתחת ללשון ישירות מתחת למקום שבו הביופסיה מבוצעת. על ידי דוחפים את האצבע כלפי מעלה, הלשון הופכת מתוחה על קצה האצבע עושה ואדומות את המקל עבור ביופסיה קל.
2. קריטריונים לבחירת ואדומות עבור ביופסיה: ואדומות טעם וניתן להבחין בקלות שמסביב filliform ואדומות על ידי צורתם וגודלם. Fungiform עגולות ואדומות ומבודדת במידת מה שמסביב. בסביבה הקרובה שלהם יש חלל עגול ללא filliform ואדומות (איור 2A, חיצים כחולים). שטח זה הוא כ 1 מ"מ בקוטר. סימן היכר נוסף של ואדומות fungiform הוא arborization נימי המורחבת גלויים על גבי גבשושיות fungiform רוב הנבדקים הצעירים. למרות arborization עושה באיתור ואדומות fungiform יותר קל, הם לא בהכרח מנבאים טוב על קיומו של בלוטות הטעם ב פטמית זה. בתור כלל אחד מתחיל קציר לקראת סוף הקדמית נעה הרחק קצה הלשון, כדי למנוע דימום נימי מן להסתיר את האתר של אוסף רקמות הבא.
3. לאחר פטמית טוב זוהה, מעיין מיקרו מספריים (מקפרסון-Vannas, קצה מעוגל, חיתוך חד 5 מ"מ, מסרק, רוחב קצה 0.2 מ"מ אורך כולל 3 "(RS-5603, Roboz) משמש קליפ אותו. כדי להשתמש ביעילות את המספריים מיקרו כירורגי אחד לא צריך להשתמש קצה להב לחיתוך, אלא ככל בתוך הלהב ככל האפשר (איור 1, תמונה מוגדלת איור 3), קרוב לנקודת ההצטלבות עם להב ההפוך. הסרת פטמית מושגת עם מהלך אחד החנית של המספריים (איור 1). נוספת בתוך להבי לפתוח את פטמית ממוקד מופיע, היעילה יותר היא גזירה. יש להקפיד כי העמדה הכללית של המספריים חייב להיות מקביל עם המשטח הגבי של הלשון.
4. לפעמים הלשון הופך יבש כמו המנתח מנסה לזהות פטמית להסרה. יבש פעם, את היכולת של המפעיל לראות בבירור שהוא פטמית fungiform הופך מאתגר יותר והופך הזזה של להבי על פטמית קשה מאוד. לשון יבשה מדי בדרך כלל עושה את המקל להב מתכת הלשון עושה את המהלך כירורגי עדין לשליטה פחות. לתת הנושא קרוב שלו / שלה בפה יש רוק לבוא במגע עם פני השטח של הלשון מסייעת בתהליך. לשון רטובה מדי הוא לא טוב. שימוש בפינה של גזה כי אחד השימושים להחזיק את הלשון מסייעת בתהליך זה.
5. דימום כל נימי כי מתרחשת מטופל על ידי סופג עם גזה סטרילית. בדרך כלל הדימום מפסיק תוך כמה דקות אוטי ולא להפריע קצירת רקמות נוספות. מכיוון ואדומות להאריך מעל פני האפיתל של הלשון, ורק העליון 3 / 4 של פטמית fungiform מוסר (תרשים 2B), חלק של fungiform מראה בלוטות הטעם, דימום קטן צפוי.
6. בעזרת מלקחיים קטנים דומון (סוג תבנית), ואדומות הסיר ממוקמים חיץ צונן Ringer בסיסי (130 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 1 mM Na-Pyruvate, 20 mM HEPES-Na , pH 7.2, osmolality של ~ 305 osmols מילי) עבור מניפולציות הבאים. זה הכרחי אף פעם לצבוט את הגבשושיות בין הלהבים של מלקחיים. רקמה היא שברירית מאוד, יש לטפל בזהירות רבה.
7. לאחר הסרת ואדומות, בכפוף נשאר בכיסא במשך 10-15 דקות. כל נושא הוא אמר לא לנשוך את הלשון בהרדמה שלהם, אבל כדי לשמור על הלשון שלהם במנוחה. נושאים יש לעקוב באופן חזותי על ידי המנתח המטפל. הרדמה צפוי לפוג בתוך כ 30-60 דקות. כי באתר של הסרת גבשושיות עשוי להיות כואב מעט לאחר הביופסיה, הם מונחים להיות מודעים מזון (טמפרטורה) חריף או חם, משקאות מוגזים או משקאות כי הם או קר מאוד או חם. אינדיקציה נוספת ניתנת נושאים כל גוון אדמדם קלה של רוק הוא נורמלי תיפסק על פירוק הקריש.
8. נושאים נראים 30-40 ימים לאחר הסרת ואדומות להערכה של האתר שבו את גבשושיות הוסרו. לפי טעם זה ואדומות זמן צריך מחדש לחלוטין.

5. נציג תוצאות

רקמות שנאסף יכול לשמש אימונוהיסטוכימיה, RT-PCR, ב הכלאה באתרו, הדמיה סידן, תיקון clamping ותרבות רקמות. כאשר ביצעו כראוי את המראה של ואדומות הם בריאים למראה, לבן, על 0.5-1 מ"מ בקוטר (תרשים 2B).

ואדומות שנאספו אימונוהיסטוכימיה מעובדים מבוסס על פרוטוקולים קיימים פרסם ^4. ניצן טעם אופייני פטמית paraformaldehide-קבוע טעם מוצג באיור 4 א.

ואדומות ביופסיה יכולים גם להיות מטופלים enzymatically ⁵ להשיג דיסוציאציה של תאים ניצן הטעם. לאחר ניתוק האנזימטית, תאים יכול להישמר לתקופה של עד 4 שעות בצלחת פטרי humidified ב 4C. במצב זה הם יכולים לשמש עבור תא יחיד PCR (תרשים 4 ב), Ca הדמיה וכו '

תאים להראות מגוון של צורות, רבים להיות רזה דו קוטבית (איור 5 א ו 5 ב) כפי שניתן היה לצפות התא ניצן הטעם. כאשר איסוף תאים או ביצוע Ca הדמיה, לאחר כ -20 דקות תחת מיקרוסקופ, התאים מתחילים לפתח blebs אפופטוטיים (איור 6 א ו - 6B, חיצים) ורבים מהם להיות עגול. שימוש בטכניקה שפותחה במעבדה שלנו, התאים היו הרים בנפרד באמצעות תיקון, פיפטה, כפי שמוצג באיור 5A ו - 5B.

כאמור, ואדומות להתחיל לצמוח מחדש לאחר 5 עד 8 שבועות. איור 7 א ממחישה את המראה של הלשון שבה 8 ואדומות fungiform הוצאו מן הצד השמאלי של הלשון באמצעות מתנדבים ללא הרדמה. שימו לב 8 נקודות אדמדם קל, שם את גבשושיות היו נגדע. דימום לא הוא ציין לאחר הניתוח. התמונה צולמה הנוכחי 10 דקות לאחר הביופסיה. 7B איור הוא דימוי של לשון באותו נושא ראו 40 ימים לאחר הביופסיה. שימו לב כל ואדומות יש שצמחו שוב. כדי לקבוע אם את גבשושיות מחדש הם פונקציונליים ביקשנו מתנדב שלנו להסכים ביופסיה second מעורבים ואדומות בדיוק. כדי לזהות נכון את גבשושיות המתאים תיכננו לקצור מחדש, שעוררנו רשת (איור 7C) שמתאים את גבשושיות 8 שהוסרו מלכתחילה ועל גבי אותו על הלשון של המתנדב אותו לאחר 40 ימים שלאחר ביופסיה ראשונית . בעזרת קווי המתאר של הלשון ואת המרחק בין השוליים לרשת, המזוהה פעם, הסרנו כמה ואדומות המדויק אותו ולעבד אותם אימונוהיסטוכימיה. איור 4 א היא אחת ואדומות אלה. שימו לב את קווי המתאר של ניצן הטעם (בצהוב) ואת מכתים immunopositive עבור phospholipase Cβ2 (PLCβ2), 2 סוג טעימה תא התמרה הקשורים האנזים. נתונים אלה מראים כי באמצעות ההליך ביופסיה כפי שתואר לעיל, את גבשושיות fungiform להתחדש מספיק על ידי 40 ימים יש גם מקום להניח את בלוטות הטעם תפקודית.

באיור 1. ברבעון הקדמי של הלשון של הנושא הוא עטוף לתוך גזה סטרילית והחזיק ביד שמאל של המנתח. לשון חייב להיות בחוזקה. תמונה מוגדלת בצד ימין מראה את המיקום הנכון של מספריים את המיקום של פטמית ביחס הלהב.

201/2201fig2.jpg "alt =" איור 2 "/>
איור 2. (א) Fungiform ואדומות מופיעות עם חיצים כחולים. אלה הם מבנים עגולים מבודדים למדי מן הסביבה שלה בסביבתם יש חלל עגול ללא filliform ואדומות. (ב) Fungiform פטמית לטעום על קצה באביב מיקרו מספריים שניות אחרי זה הוסר.

איור 3. עצמי ביופסיה של פטמית fungiform שימוש במראה ולא הרדמה. הבלעה מדגים את העמדה הכללית של המספריים, אשר חייב להיות במקביל פני השטח הגבי של הלשון. אם נעשה כראוי atraumatically, הרדמה היא מוותרת על ידי כמעט כל המתנדבים.

איור 4 א אימונוהיסטוכימיה של ניצן הטעם. פטמית fungiform דמיינו ידי אופטיקה Nomarski באמצעות נוגדנים phospholipase β2 ו מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי אדום. קווי המתאר של ניצן את הטעם ואת מספר תאים טעם שכותרתו מוצגים צהוב.

ב RT-PCR של קולטן טעם חמוץ מועמד, חומצה חישה יון ערוץ 1 (ASIC1). מ = סמן. Lanes 1 עד 4 היו תא בודד RT-PCR עבור ASIC1 מארבעה מתנדבים שונים. לאחר איסוף, היו fungiform ואדומות ניתק enzymatically, תאים בנפרד הרים ביטוי ASIC1 נעשו. Lanes 2 ו - 4 היו ביטוי נורמלי של ASIC1.

איור 5. תמונה א 'של תאים טעם להיות בודד הרים בעזרת פיפטה התיקון. תא אפיתל גדול גלוי בפינה השמאלית התחתונה (5A). שתי כדוריות דם אדומות הם גם נראו מעל פיפטה תיקון חבית מאחורי הזכוכית. התא טעם הוא כ 30-50 מיקרון ארוך כ 6 מיקרון רחב. לקבלת הפניה, תא דם אדום הוא כ 7-8 מיקרון בקוטר. ב 'מראה עוד קולטן טעם התא מוקף בארבעה לתאי האפיתל. התא טעם נראה פריך.

איור 6. א 'תמונות של התאים החלו לפתח blebs אפופטוטיים (כמו רוח רפאים blebs עגול המחובר לתא טעם, חיצים). תאים ב נקצרים עוד כאשר המראה שלהם משתנה כפי שמוצג כאן.

איור 7. א עשר דקות לאחר הסרת ואדומות 8 אין טעם באמצעות הרדמה. האתרים כירורגית נראים כמו כתמים אדמדמים מעט. הדימום אינו שם לב.
ב לשון זהה 40 ימים לאחר ביופסיה. שימו לב כל ואדומות מחדש. כדי לעזור לזהות את גבשושיות הוסרו כפי שצמחו שוב, רשת נוצרה עם האתר על התמונה בצד ימין ועבר מעל ואדומות מחדש על התמונה בצד שמאל.
ג ואדומות הופיעו מחדש באותו מקום בדיוק. מסיק ואדומות שוב מקבוצה זו ואחריו אימונוהיסטוכימיה הוכיחו כי ואדומות מחדש הכיל תאים טעם תפקודית (ראה תרשים 4 א).

Discussion

אחד היתרונות הבולטים בשימוש בתאים אנושיים הוא הספציפיות שלהם. ההליך המתואר כאן בפירוט מספק רקמות לשון לבידוד של הקולטן בתאי הטעם של בני אדם. תאים אלה יכולים לשמש טעם ללימודי מולקולרית, המבקשים לגלות מולקולות חשובות עבור התמרה של מידע הטעם, הדמיה מחקרים סידן שהצג תא פ...

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3"		Roboz Surgical Instruments Co., Inc. Gaithersburg, MD 20898	RS-5603, Roboz
Small Dumont forceps		Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4915, Roboz