Зарегистрированные Bioimaging наноматериалов для диагностических и терапевтических мониторинга

Резюме

Bioimaging методы используются для оценки клетка биораспределения наночастиц применимы для терапевтического и диагностического мониторинга nanoformulated соединений. Методы, описанные здесь, являются чувствительность и специфичность при оценке гистологическим coregistration. Методологий обеспечить поступательное путь от грызуна к человеческой приложений.

Аннотация

Nanomedications может переноситься через кровь моноцитов-макрофагов в ретикулоэндотелиальной системы (РЭС; селезенку, печень, лимфатические узлы) и к концу органов. Последние включают в себя легкие, RES, а мозг и действуют в течение иммунодефицита человека вирусом типа один (ВИЧ-1) инфекции. Макрофаги вступления в тканях выделяется в районах активной репликации ВИЧ-1 и участки воспаления. Для того чтобы оценить потенциал макрофагов как nanocarriers, суперпарамагнитных оксида железа и / или наркотиков Ладена частиц, покрытых поверхностно парентерально вводят ВИЧ-1 энцефалита мышей. Это было сделано для количественной оценки частиц и наркотиков биораспределения. Магнитно-резонансная томография (МРТ) результаты испытаний были подтверждены гистологическими coregistration и расширенные обработки изображений. Конец орган заболевания характерно изменен гистологии мозга оценивали с помощью МРТ. Демонстрация надежной миграции nanoformulations в районы координационного энцефалита обеспечивает "доказательство концепции" для использования передовых bioimaging методов для контроля макрофагов миграции. Важно отметить, что гистопатологические аберраций в мозге коррелирует с bioimaging показателей, составляющих общую полезность МРТ при исследовании распределения клеток при болезни возможно. Мы утверждать, что использование таких методов может обеспечить реальный индекс время бремени болезней и терапевтической эффективности с трансляционной потенциал для человека.

протокол

1. Введение

Селективной доставки лекарственных препаратов и терапевтических макромолекул (пептидов, белков и нуклеиновых кислот) на клеточные и тканевые участки активной болезни и текущих инфекций микробного улучшит фармацевтической реакции во время болезни ^1-3. Один частности сотовой сайт макрофагов, который является одновременно очень мобильны и иммунной интересным и является последовательным основной мишенью для вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). ⁴ Важно отметить, что макрофаг занимается воспаление лежит в основе широкого спектра заболеваний, которые включают дегенеративных, воспалительных, инфекционных и раковых заболеваний; и мобильность клеток к болезни сайтов лежит в основе прогрессирования ткани травм ^5-9. Важно отметить, что использование кровью макрофаги, как наркотик, макромолекулы, и сигнал носителей получил последние внимания к его поступательного потенциал. Тем не менее, значительные препятствия в реализации терапевтического потенциалов гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) среди других барьеров тканей, которые непроницаемы для спектра макромолекул и белки. Эти, препятствий, тем не менее, не позволять ячейки проход. Все вместе это прогнозируется, что в естественный ход заболевания периферических макрофагами, которые обходят барьеры могут носить сформулированы наркотики, маркеры и пептидов на сайты, инфекции или воспаления. Тем не менее, такие технологии остаются только в развитии. Именно через наши дела, что клеточный доставка может быть разработан для диагностических и терапевтических приложений и таких приложений, которые поддерживаются лабораторные и животных моделях болезни человека ^10-12.

2. Подготовка наноматериалов

Подготовка наноматериалы для доставки лекарств и биораспределения исследования является темой параллельно рукопись в этом вопросе (рукопись ссылкой параллельно). Все процедуры для кристаллических производства наночастиц проводятся в ламинарном боксе. Все поверхности дезинфицировать перед использованием с 70% спиртом. Это включает в себя рабочую поверхность, внешний вид перчаток и любых разливов. Все они покрыты решение повторить 70% спиртом сразу с салфетками. Перчатки удаляются после использования и не носить при входе в любой другой области лаборатории. Вспомогательные вещества, наркотики, стерильная вода с /, содержащие любые / все реагенты для изготовления наркотиков нагруженные частицы только привести в рабочих зонах, когда это необходимо для процедуры. Стерильные завернутые пипетки используются только и удаление после использования в контейнер для биологически опасных отходов. Мокрой готовы аппарат дезинфицируют спиртом до и после использования. Рабочая область очищается непосредственно до и после с 70% спиртом. Наночастиц решение проверяется на пирогенов в соответствии с руководящими принципами для оценки FDA отсутствие бактериального эндотоксина в наркотиков частиц решений, используемых для животных. Короче говоря,

1. Кандидат на nanoformulations в естественных условиях использования реплицируются путем замены основных лекарств или капель с одинаковым размером частиц или измельченный кусок суперпарамагнитных оксида железа (Спио) перед нанесением покрытия с соответствующими ПАВ.
2. Это сопровождается мерами размера, заряда, формы и цитотоксичности, чтобы определить, является ли система Спио модель имеет те же свойства, как кандидат nanoformulated препарата.
3. Наконец, анализы ячейки загрузки выполняются путем инкубации с моделью nanoformultation кандидата Спио с целью определения relaxivity в клетки с использованием фантомов состоит из меченых клеток, взвешенных в геле агара. Фантомы готовятся в трех экземплярах, и готовы в серии концентраций для того, чтобы количественно relaxivity из-за поглощения Спио в клетках. Это обеспечивает индекс чувствительности и определяет, будет ли nanoformulations может повлиять на степень окисления и, следовательно, видимость Спио в магнитно-резонансной томографии (МРТ).

3. Методы и процедуры: подготовка животных

1. Инъекции / катетеры. В зависимости от времени интерес, инъекции, может потребоваться использование катетер для введения животным в МРТ. Катетеры готовятся с использованием немагнитной иглы и трубки расширение с минимальным диаметром, чтобы минимизировать мертвое пространство инъекции линии. Катетер должен быть заполнены как с раствором, содержащим наноматериал для инъекций или физиологического раствора, в зависимости от мертвого пространства и общего приемлемого объема инъекции. Если это возможно, инъекции могут следовать с физиологическим раствором заподлицо. Если острая раз не очень важна, предварительное сканирование может быть выполнено, и инъекция может быть сделано вне магнита в заранее определенное время, прежде чем следить за сканирование биораспределения мер. Катетеры, как правило, вставляется в хвостовую вену для инъекции IV.
2. Анестезия и мониторинга. Перед сканированием, животное помещается в камеру, чтобы вызвать анестезию. Эта камера заполнены с 1,5% изофлуран в 70% пitrous азота и 30% кислорода для ускорения наступления анестезии в животных и свести к минимуму время, необходимое для того, чтобы животное не будет просыпаться при удалении от камеры. Как только животное полностью под наркозом, животное удаляется из камеры и помещают в стереотаксической держатель оборудован для контроля скорости дыхания и температуру животного, продолжая поставлять изофлуран во время настройки и сканирования.
3. Владельцы животных и регулировка соображения: Настройка включает в глаза смазки для защиты от язв роговицы. Животное слегка обернутые марлей и марлевые выявляется в месте, чтобы минимизировать потери тепла в процессе сканирования и обеспечить положительное давление на дыхательные монитора. Животное держателей оснащены регулируемыми баров зуба, что позволяет для вертикального и горизонтального выравнивания головы. Это особенно важно для высокочастотного поля МРТ, а углы головы в хвостовом-ростральная направлении вызовет дополнительные трудности при неоднородности магнитного поля из-за магнитной восприимчивости. Неоднородности магнитного поля является вредным для высокого качества T ₂ * МРТ, а также ¹ H магнитно-резонансной спектроскопии ⁽¹ H МРС) и магнитно-резонансной визуализации тензора диффузии (DTI). В дополнение к правильное положение головы в угол хвостового-ростральная направление, повороты головы, следует избегать в той степени, что это возможно. С учетом вращения животных держателя в магнит будет предоставлять компенсацию за незначительные повороты, которые могут произойти от животного к животному. Это может быть в дальнейшем свести к минимуму путем тщательного размещения голову и внимание к углами до вставки животных в МРТ системы.
4. Калибровка и прокладок: После того как животное находится в держателе и поверхности катушки правильно расположенных на голове, начальное положение животного определяется в режиме реального времени одномерного отсчет в хвостовом-ростральная направлении. Сигнал ограничивается область вокруг поверхности катушки используется для приема, ограничение необходимо для интерпретации наблюдаемых форм волны. Как только начальная позиция определяется, 3-плоскость локализатор Изображение взято, чтобы определить точное положение животного в сканер и создать условия для движения к точному положению, необходимые для сканирования (ы), представляющих интерес. Далее следует корректировка однородность магнитного поля или "прокладок" магнитом. Это делается путем сопоставления распределения поля и расчет точно определить пространственное коррекции на основе измеряемых ответы серии электромагнитов или "прокладка катушек» в рамках системы, предназначенной для настройки полей однородности. Прокладок осуществляется с использованием мульти-градиент последовательности эхо и картографического программного обеспечения, разработанная доктором Хетерингтон ^13. Регионы однородности соответствуют регионе рассматривается каждый отдельный метод визуализации. После шиммирования завершена, мы можем приобрести сканирования (ы) интереса со стороны животного.

4. Сбор данных

1. High Resolution T ₂ * взвешенной МРТ. Биораспределения из Спио содержащих наночастицы могут быть определены путем обнаружения районов потери сигнала в высоком разрешении 3D T ₂ * взвешенная МРТ. Области мозга определяется из локализатор сканирует и заданными на локализатор сканирует или дополнительные проверки по мере необходимости. НА ₂ * взвешенная МРТ с 150 разрешение изотропной микрона, затем приобрел. Высокое разрешение 3D градиент напомнил эхо МРТ мыши голова, приобретенный с помощью 25 мм птичьей клетки объем катушки с приобретением параметров эхо время = 5 мс, время повторения = 50 мс, 30% эхо, флип угол = 35 градусов, в среднем = 2, поле зрения = 20 х 20 х 20 мм с разрешением 128 х 128 х 128 (воксела размер = 150 х 150 х 150 мкм ^3), общее время приобретения = 30 мин.
2. Тензора диффузии Imaging (DTI): изображения диффузии тензора количественные показатели направление и величину диффузии воды в клетках тканей. В результате, фаза сигнала чрезвычайно чувствительны к движению, так как сканирование были осведомлены или "взвешенный" для микроскопического движения воды. В результате приобретения одного выстрела желательны для предотвращения фазовых сдвигов между приобретениями от причинения сигнал размытия; и дыхательной стробирования требуется для предотвращения валового движения во время получения сигнала. Таким образом, дыхательный закрытого спин-эхо диффузии взвешенных эхо-планарной томографии (РПИ) MR последовательности работает. Опять же, прокладок область сканирования очень важно, так как вне резонансные эффекты в процессе эволюции сигнала вызывает misregistration частоты сигнала и, следовательно, положение, в плоскости изображения. EPI приобретение параметров вошли 14 ломтиков, 200 кГц, 96 х 96 в плоскости приобретения нулями до 256 х 256 и 0,5 мм толщина среза. Диффузии кодировку была сбалансированной, вращательно-инвариантной и переменной полярности икосаэдрической схема (12 направленийусловиях) ^14,15. Схема кодирования была разработана, чтобы уменьшить фон-диффузии градиент муфты ^16. Диффузия взвешивания б-фактор = 800 мм с ^2, δ = 4 мс, Δ = 15 мс, Gdmax = 40 г / см, 200 мкс время нарастания, 7 средних для б = 0, приобретения, 3 средних для каждого б = 800 кодирования направлении, общее время приобретения 20-40 мин, в зависимости от частоты дыхания.
3. Локализованные ¹ H Магнитно-резонансная спектроскопия ⁽¹ H МРС): ¹ H МРС может быть получено из области мозга, заданных на изображения, полученные в течение одного сеанса съемки. Анатомические места находятся на картинки, чтобы предписывать области, представляющие интерес для приобретения спектров. Как только область определена, прокладок осуществляется на область соответствия объемов приобретения, проверяется с помощью локализованных спектр воды. Затем мощность импульсов воды подавления оптимизированы, вода частота измеряется для обеспечения на-резонанс воды сигнала и спектра коротких тест приобрел обеспечить контроль качества. Если спектры имеют недостаточное качество, настройки системы, в том числе радиочастотной (РЧ) энергии и прокладку настройки, проверяются. Наконец, если качество все еще недостаточно, второй 3-плоскость локализатор запускается для того, чтобы животное не сдвинулся с начальной проверки. По нашему опыту, это обеспечивает очень высокую степень воспроизводимости и точности для спектроскопических приобретений. Наконец, спектры, приобретенных в короткие блоки с перенастройка системы частоты между приобретениями устранить эффекты магнитного поля дрейф и обеспечить воспроизводимость и качество конечного сканирования. В конце приобретение, одного спектра воды импульсов в заданное усиление предусилителя используется как количественный ссылкой амплитуды сигнала.
4. Гистологии и Blockface Imaging: После финальной сессии МРТ сканирования во время серии экспериментов, мыши перфузии, мозг удаляют, а встроенный в блок октября, соединение, которое было затемненной использованием капли чернил Индии. Блок помещается в криостат для нарезки и гистологического анализа. Blockface Изображения получены с помощью цифровой камеры (Canon EOS Digital Rebel 300D с Canon EFS 60mm Ультразвуковые f/2.8 Macro USM объектив), установленный в передней части криостата с пользовательским монтировать и вызвано дистанционный выключатель. Цифровые изображения приобрели каждые 50 мкм по всему объему мозга. Фрагменты нумеруются чтобы позволить регистрацию в объеме после гистологической обработки и окрашивания. Индивидуальные ломтиками blockface были приведены в соответствие реконструировать 3D громкости с помощью блока контуры для учета джиттера в положение криостат голову. Объем мозга, после чего автоматически сегментированных использованием семян основана регионе растущий алгоритм анализа пакета программ (AnalyzeDirect, Lexena, К. С.).

5. Данные анализов

1. Спио обнаружения с использованием МРТ: Спио причины потери сигнала в T ₂ * МРТ, и, как таковой, МРТ недействительным сигнал чувствительным, но не специфическим маркером Спио присутствие в тканях. Чувствительность зависит от пространственного разрешения МРТ и размер частиц Спио, с одной частицы микронных размеров обнаружено на 100 разрешение изотропной микрона. В этих работах, 150 микрон изотропного разрешения с 200 нанометров размер частиц Спио используются. Чтобы обеспечить как чувствительность и специфичность для присутствия Спио в мозге, мыши были отсканированы до введения Спио меченых клеток, чтобы вычитание изображений, которые будут использоваться для идентификации клеток в головном мозге в более поздние моменты времени. 3D МРТ subimaged использованием метода ограниченного уровня, установленного в нашей лаборатории, как описано выше ^17. Subimaged объемов мозга были тогда coregistered, интенсивность сигнала нормализовалось, и объемы вычитаются для выявления регионов внутри объема мозга с потерей сигнала (наличие Спио), которая была не по краям для устранения ложного положительного сигнала от любых ошибках субпиксельной регистрации.
2. Coregistration гистологии и МРТ: Coregistration между гистологии и МРТ было достигнуто с помощью blockface изображение в качестве общей справки. Такой подход уменьшает сложность главная проблема коррекции асимметричный усадки срезы тканей во время подготовки и окрашивания для двумерного проблема, как описано в наших предыдущих работах ^18,19. Здесь, МРТ и гистологии обнаружения Спио макрофагов, содержащих в коре головного мозга показала отличные пространственной корреляции, с ожидаемым завышению объема на потери в МРТ сигнала и большую чувствительность к несколько клеток свидетельствует гистология ^12. Точная совместной локализации этих двух сигналов дает один из показателей точности coregistration и деформацию гистологии вернуться к первоначальному формы ломтики.
3. Области интереса (ROI) анализ DTI: DTI сканирует, как правило, анализируется выбор анатомических ROI для determINE среднем свойства диффузии ткани в частности подструктуры анатомические.
   Анализы диффузионно-взвешенных данных осуществляется с помощью пользовательских программ, написанных на IDL (Interactive Data Language, ITT Visual Information Решения, Boulder, CO), как описано выше ^15,20. Анализы подготовить карты тензора диффузии (λ _1, λ _2, λ _3), средний коэффициент диффузии (D _пр.), где: D _ср = (λ ₁ + λ ₂ + λ ₃₎ / ₃ и дробный анизотропии (ФА), где:
   
   Поперечный (λ _⊥ = (λ ₂ + λ ₃₎ / 2) и продольной (λ = λ _{будете 1)} компоненты тензора диффузии были получены, как описано в другом месте ^21. Как только карты построены, трансформирования нарисованы на T ₂ МРТ с наложением цвета закодированы λ ₁ карт направленности. Примеры регионов выбрали для анализа в мышиной модели ВИЧ отображаются на рисунке 1.
4. Спектроскопические Анализ: Количественное определение метаболических соединений, способствующие пики мозга ¹ H МРС определяется с помощью одного из разнообразных методов построения кривой. Различные методы построения кривой были разработаны. В нашей лаборатории мы используем установки временной области методом (QUEST) ²² в ²³ jMRUI обработки сигналов пакет, который представляет собой линейную комбинацию отдельных метаболитов спектров способствует окончательной спектра. Мы используем основе набора из 22 отдельных метаболитов в качестве потенциальных факторов. Основе спектров моделируются и проверяется с помощью спектров растворов отдельных метаболитов. Пример результата аппроксимации кривой от одного спектра показан на рисунке 2.

6. Представитель Результаты

Примеры DTI и 1HMRS показаны на рисунках 1 и 2. Дополнительные примеры 1H MRS ^24-26 и ²⁷ DTI результаты можно увидеть в наших предыдущих публикациях. Примеры preinjection T ₂ * взвешенная МРТ с наложением расположения меченых клеток в желтом показано на рисунке 3. Мыши были помечены моноцитов производные макрофагов вводили в хвостовую вену. Пять дней спустя, T ₂ * МРТ был приобретен и обрабатывается, как описано выше. Мышь была подготовлена ​​в виде инъекций ВИЧ-инфицированных человеческих макрофагах в мозг, которое рассматривается как линия обнаружена мышь моноцитов производные макрофагов. Дальнейшие примеры и обнаружения меченых клеток и coregistration с гистологии можно увидеть в наших предыдущих публикациях ^10,12.

Рисунок 1. Изображение регионах проанализированы для метрик DTI.

Рисунок 2. Спектроскопические фитинге, используя QUEST в обработке сигнала набора jMRUI.

Рисунок 3. Обнаружение Спио меченых клеток мигрируют из периферической крови в области мозга с очаговым энцефалитом. Сотовые позиций (желтый) наложения представитель ломтики от T ₂ * МРТ приобретения, как указано в тексте.

Обсуждение

Точный учет гистологии с в естественных результатах изображений является важным шагом в развитии изображений биомаркеров для выявления и постановки нейронов болезни. Некоторые изображения метрик, вероятно, будут связаны с валовой морфологические изменения, включая изменения в магнитных свойствах релаксации тканей, используемых для обнаружения присутствия белого вещества и болезни рака. Другие, более тонкие методы, например, Министерства торговли и промышленности, вероятно, обнаружить ранние клеточные изменения, которые не могут быть обнаружены как гистологические изменения, вызванные болезнью не появляются позже стадиях заболевания. Тем не менее другие маркеры, такие как спектроскопические маркеры, могут быть показатели ранней и обратимые изменения, которые предшествуют даже тончайший сотовый изменений.

Биораспределения может быть определена неинвазивно с использованием различных методов. Первичного неинвазивного метода позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ), оптических изображений, и МРТ. Ядерной медицины, основанной томография (ПЭТ и ОФЭКТ), использовались в течение многих лет для многих биораспределения, но эти методы ограничены периодом полураспада Радиоактивные использоваться для маркировки соединений или наноматериалов, особенно для трейсеров ПЭТ. Оптические изображения могут быть использованы для мелких грызунов, но не могут быть переведены на использование человеком, за исключением регионов легко доступны, такие как поверхности опухоли из-за поглощения света и рассеяния света. Кроме того, трудно оценить количественно оптических сигналов по тем же причинам. МРТ использует постоянные теги, например Спио, которые могут быть отслежены в организме в течение недели. Это, также, должны использоваться с осторожностью, так как метка может быть переведен в различных клеток или поглощаться телом.

Обнаружение специфичность Спио в МРТ может быть обеспечена с помощью различных методов. Методы обнаружения, которые дают положительные, так и негативных сигналов, которые используются для повышения специфичности МРТ для обнаружения присутствия Спио в тканях. Метод вычитания используется в этой работе была использована другими пользователями, а также ^28. Другие подходы включают в себя вне резонанса обнаружения ^29-31, фазочувствительный визуализации, которая производит определенный шаблон рядом пустот Спио ^32, и нулевой эхо времени образ, который использует T1 взвешивания для получения положительного интенсивности сигнала в области Спио ^33. Продвижение этих методов для улучшения количественного определения этикетки, чувствительность и специфичность область активных исследований сегодня.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane
Medical Oxygen
Isoflurane vaporizer
Rodent gas anesthesia mask
MRI compatible Stereotactic head holder
Syringe
Polyethylene catheter tubing
Non-magnetic needle
Eye lubricant
Gauze
Tape
Perfusion media
OCT compound for embedding tissue
MRI system
Digital Camera
Tissue Sectioning Cryostat