Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

Riepilogo

Risonanza magnetica (MRI) è diventato uno strumento sempre più popolare per l'esame del fenotipo di topi geneticamente modificati. Questo articolo illustra i metodi necessari per raggiungere high-throughput fenotipizzazione di topi geneticamente modificati utilizzando più-mouse risonanza magnetica.

Abstract

Il campo di fenotipizzazione del mouse con la risonanza magnetica (MRI) è in rapida crescita, motivata dalla necessità di strumenti migliorati per la caratterizzazione e la valutazione dei modelli murini di patologie umane. La risonanza magnetica è una modalità eccellente per studiare gli animali geneticamente modificati. È in grado di copertura intero cervello, può essere utilizzato in vivo, e fornisce meccanismi di contrasto più per indagare diversi aspetti della neuranatomy e fisiologia. L'avvento di alto campo scanner insieme alla capacità di eseguire la scansione topi multiple permette contemporaneamente per fenotipizzazione rapida di nuove mutazioni.

Efficace del mouse studi di risonanza magnetica richiedono attenzione per molti aspetti della progettazione esperimento. In questo articolo, descriveremo metodi generali per acquisire immagini di qualità per la fenotipizzazione del mouse utilizzando un sistema che i topi immagini contemporaneamente nella schermata di trasmissione / ricezione a radiofrequenza (RF), bobine in un comune magnete (Bock et al., 2003). Ci concentriamo in particolare sul fenotipizzazione anatomiche, un'applicazione importante e accessibile che ha mostrato un alto potenziale di impatto in modelli murini molti presso il nostro centro di imaging. Prima di poter fornire la procedura dettagliata per l'acquisizione di tali immagini, vi sono importanti sia per considerazioni di ordine pratico in vivo imaging cerebrale (Dazai et al., 2004) ed ex vivo di imaging cerebrale (primavera et al., 2007) che dovrebbe essere notato. Questi sono discussi di seguito.

Protocollo

1. Multiple-mouse Imaging cerebrale in vivo:

Quando gli animali immagini dal vivo, alcune caratteristiche chiave deve essere presente per tutta la sessione di imaging: 1) un metodo sicuro di anestesia, 2) controllo ambientale e 3) il monitoraggio fisiologico. Inoltre, quando i soggetti più immagini contemporaneamente, si aggiungono le complessità per quanto riguarda la facilità e la velocità di preparazione e la riproducibilità delle posizioni degli animali per facilitare la registrazione delle immagini. Di conseguenza, tre componenti principali personalizzati sono stati progettati e fabbricati: un carico di sistema per inserire i topi in bobine RF all'interno della risonanza magnetica, una camera di induzione per facilitare la preparazione e una piattaforma di monitoraggio integrato porta a standardizzare posizione.

Il sistema di caricamento:

Il sistema di carico del mouse si compone di due parti principali: 'vasta di carico' il 'mouse alveare' e la. La funzione principale del alveare mouse è quello di posizionare sette Millepiedi bobine RF (Varian Sistemi NMR, Palo Alto, CA) in un array esagonale all'interno del magnete. L'array di carico è progettato per contenere e trasportare i topi più alloggiati in tubi millilitro 50 centrifuga con fori attraverso i loro suggerimenti per consentire l'ingresso di gas anestetico. Dopo i topi vengono anestetizzati e interfacciato al dispositivo di localizzazione in una zona di preparazione nelle vicinanze del magnete, sono inseriti in tubi di centrifuga modificato e montato su l'array di carico. Dopo aver montato tutti i topi, l'array di carico viene trasportato e inserita nel magnete e posizionato su un sistema ferroviario. Il sistema ferroviario permette l'array di coppia con l'alveare del mouse quando viene spinto giù il foro del magnete. Quando è completamente inserito nel magnete, la darsena centrifuga tubi sul sistema di consegna anestetico all'interno delle bobine RF. Isoflurano mescolato con l'ossigeno viene fornito dalla fine alveare mouse per il campione attraverso un tubo lungo l'asse di ogni singola bobina. Questa miscela di gas anestetico scorre nei tubi, passato i topi e viene raccolto da un gruppo attivo scavenging collegato al retro del vettore di carico (Figura 1).

La Camera di induzione:

Sin dai tempi di imaging può richiedere fino a tre ore, riducendo al minimo il tempo di preparazione degli animali è fondamentale per limitare l'esposizione del mouse per l'anestesia. Quindi, abbiamo sviluppato una camera di induzione personalizzati per snellire il processo di preparazione (Figura 2). La camera di induzione personalizzato crea un unico ambiente sia per l'induzione e la gestione dei topi multipli. Costruito in acrilico trasparente, le caratteristiche di induzione camera autochiudente silicone porte iride per ridurre la dispersione anestesia e permette all'utente di accedere all'ambiente interno senza la necessità di guanti speciali. Rispetto alla maschera convenzionale e circuiti per un mouse, la camera di induzione è abbastanza grande per ospitare fino a venti topi e permette la manipolazione libera dei topi senza il collegamento di tubi ingombrante e maschere. L'unità viene fornita con un flusso costante di gas anestetico che viene raccolto tramite un sistema passivo scavenging. Elementi riscaldanti resistivi vengono utilizzati per riscaldare il pavimento della camera per mantenere la temperatura corporea degli animali 'durante la preparazione.

La slitta:

Uno degli aspetti più scomodi e che richiede tempo di preparazione di topi per la risonanza magnetica sono l'applicazione di elettrocardiografo (ECG) elettrodi e sonde di temperatura rettale. Inoltre, molti degli elettrodi convenzionali, come bracciale e elettrodi ad ago, sono stati trovati a falsare la postura dell'animale rendendo difficile standardizzare posizionamento. Pertanto, abbiamo pensato ad un modulo personalizzato, dotato di piattaforma di posizionamento integrato ECG, respirazione e sonde di temperatura chiamato il 'slitta' (brevetto US 7146936) (Figura 3). Limitazioni di movimento a base di velcro sono stati utilizzati per limitare il movimento della testa.

Multiple-mouse in fasi brain imaging in vivo:

1. Tutte le ricerche del mouse richiede locali ACC (Comitato di prodotti per animali), l'approvazione IACUC (Cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa) o equivalente per le procedure di gestione del mouse.
2. Tutte le procedure come l'identificazione e pesatura degli animali deve essere effettuata sotto una cabina di sicurezza biologica (BSC) e l'Unità di risonanza magnetica. Gli animali vengono trasferiti in un contenitore di plastica autoclavabile e trasportati alla camera di induzione magnetica.
3. I topi vengono anestetizzati in una camera di induzione preriscaldata con il 4% isoflurano e 4 L / min di ossigeno. Gli animali sono completamente anestetizzati una volta non riescono a rispondere a pizzico zampa. Pelo dal petto viene rimosso utilizzando un dispositivo di rimozione dei capelli (NAIR), se necessario, per fornire un migliore contatto con ECG e dispositivi di monitoraggio della temperatura che sono state costruite in una slitta personalizzati. Salve Eve (Tears Naturale PM) è applicato agli occhi per prevenire l'essiccazione, e circa 0,3 mL di soluzione salina viene somministrata per via sottocutanea per mantenere l'idratazione.
4. Gd-DTPA-BMA (Omniscan) puòessere utilizzato se di contrasto non è desiderata. Se Gd-DTPA deve essere utilizzato, verrà diluito in soluzione salina (volume finale 300uL) e somministrato in una singola dose di 1 mmol / kg prima della sessione di MR via IP.
5. I topi sono poi caricati in slitte individuali, immobilizzato con cinghie di testa e scivolare a tempo indeterminato 50mL tubo conico (Figura 3). Fino a 7 topi vivi possono essere acquisiti in una sola volta. Una volta che tutti gli animali sono pieni di monitoraggio fisiologico collegato, impostare il livello di isoflurano nel magnete al 2% e il livello di ossigeno a 8 l / min.
6. I tubi conici sono montati in un sistema di aggancio (Figura 1) progettato per topi posizione in modo uniforme in ogni bobina RF posizionato al centro del magnete. Una volta caricato, isoflurano può essere ridotto al 0,9-2%. ECG e la temperatura sono monitorati ogni animale nel corso della scansione. Gli animali vengono tenuti al caldo nel corso della scansione con l'aria riscaldata.
7. La durata di ciascuna scansione tridimensionale è di circa 3 ore. I dettagli sono i seguenti: spin echo veloce con TR di 2300 ms e un TEeff di 36 ms. Eco lunghezza del treno di 8 con 1 media. Risoluzione di immagine risultante è di 125 micron (Figura 4).
8. Quando la scansione è completata, gli animali vengono rimossi dal campo magnetico e scaricato in una camera di induzione caldo riempito con ossigeno al 100%. Gli animali vengono trasferiti in un contenitore di plastica sigillato e trasportato in un BSC. Essi sono posti in una gabbia progetto calda gratuita e ha permesso di recuperare da anestesia.

2. Multiple-topo ex vivo Brain Imaging:

Indipendente da artefatti da movimento, fisse RM raggiunge una risoluzione superiore rispetto immagini dal vivo. Ad alta risoluzione, tridimensionale di dati forniscono la massima flessibilità nella estrazione di informazioni quantitative e consentire l'analisi delle immagini automatizzata. Un'usanza serie bobina RF è stato sviluppato in parallelo per l'acquisizione di 16 set di dati ad alta risoluzione di MR fissato cranio-cervello del mouse durante la notte le sessioni di scansione.

Il 16-Coil ex vivo Cervello Array Imaging:

Un custom-built 16-bobina array solenoide è stato creato a immagine di 16 campioni contemporaneamente. Questo design migliora su un prototipo in precedenza usato per l'immagine tre campioni contemporaneamente in un set 60 millimetri gradiente inserire. L'8-turno bobine sono più di ferite alle estremità per fornire una sensibilità uniforme entro il 10% su una lunghezza di 26mm e sono individualmente schermati all'interno di scomparti modulari (Idziak e Haeberlen, 1982). I 16 comparti della bobina sono assemblati a un fotogramma (Figura 5), ​​che posiziona le bobine all'interno del gradiente e morsetti in posizione con una vescica pneumatica per ridurre al minimo movimento.

Multiple-topo ex vivo imaging cerebrale come segue:

1. Cavità toracica aperta e inserire l'ago (o set di infusione di sicurezza Alata, 25G X 3 / 4) nel ventricolo sinistro del cuore di un topo anestetizzato (tramite iniezione intraperitoneale di ketamina (150 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) . Tagliare il padiglione auricolare destro.
2. Perfusione Transcardiac a filo con 30 mL di temperatura camera 1 X PBS + 1 ml / ml di eparina (1000 unità USP / ml) + 2 ProHance mm ad una velocità di flusso di circa 100 ml / ora.
3. Passare fissazione con 30 ml 4% PFA (temperatura ambiente) + 2 ProHance mm a 100 ml / ora.
4. Decapitare e togliere la pelle, la mascella inferiore, le orecchie, punta del naso cartilagineo.
5. La struttura del cranio posto rimanente nel 4% PFA + 2 ProHance mM notte a 4 ° C.
6. Trasferimento in PBS 1X + sodio azide 0,02% + 2 ProHance mM.
7. Alta risoluzione di scansione tridimensionale tre risonanza magnetica a 7 Tesla si verifica tra 4 giorni e non più di 2,5 mesi dopo la perfusione. Cervelli sono posti in un array di 16-canali solenoide della bobina (Figura 5).
8. Parametri di imaging sono i seguenti: spin echo veloce con TR 325 ms e un TEeff di 30 ms, lunghezza del treno eco di 6 con 4 medie. Le immagini finali hanno una risoluzione isotropica di 32 micron (Figura 6) e la durata di scansione è di circa 12 ore.
9. Dopo la scansione, luogo del cranio in formalina 10% + 2 ProHance mM per la conservazione.

3. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. Il sistema di carico del mouse. La "matrice di carico" e "mouse alveare" collegato con un sistema common rail in fibra di vetro.

Figura 2. La camera di induzione.

Figura 3. A) La slitta, che mostra sensori per il monitoraggio integrato e poggiatesta. b) Un mouse anestetizzato su una slitta con il poggiatesta attaccato. L'assemblea slitta scivola facilmente in provetta da centrifuga.

Figura 4. immagini del cervello in vivo più da uno a 3 di tre ore di scansione tridimensionale.

Figura 5. A 16 canali serie bobina per la scansione di 16 campioni di cervello fisso.

Figura 6. Rappresentante ex-vivo di immagini del cervello.

Discussione

Sia in vivo ed ex vivo del mouse di imaging soggetti immagine più sistemi contemporaneamente per aumentare la produttività degli studi di imaging senza aumentare considerevolmente il tempo di imaging. Le immagini del cervello di entrambi i in vivo ed ex vivo più del mouse tecniche di imaging sono di alta qualità e sono adatti per la fenotipizzazione strutture maggiori e minori nel cervello di topo, rispettivamente.

Per ridurre al minimo il tempo di preparazione dei campioni più animali, parallelizzazione dei processi è di estrema importanza. Per esempio, lo sviluppo della camera di induzione permesso per l'induzione di campioni contemporaneamente, e la slitta ha sincronizzato l'applicazione della ECG e sonde di temperatura, mentre standardizzando posizionamento del corpo. Inoltre, il nostro ex vivo sistema di imaging ci consente di acquisire ad alta risoluzione di immagini tridimensionali di 16 cervelli fisso tutto in una volta sola che è ideale per high-throughput studi fenotipizzazione.

Possibili limiti del nostro sistema in vivo immagini comprendono l'incapacità di controllare individualmente anestetici e temperatura per ogni mouse. Se necessario controllo individuale anestetico può essere implementato con l'aggiunta di esclusiva vaporizzatori di anestesia per ogni mouse. Un altro limite del sistema in vivo imaging è che la scansione è limitata ai topi che hanno meno di circa 32 grammi. Tuttavia, vi è attualmente un piano per aumentare le dimensioni della bobina per ospitare grandi animali.

Materiali

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP (AErrane)		Baxter	CA2L9108
NAIR		Church & Dwight Canada Corp.
Tears Naturale P.M.		Alcon	DIN 02082519
Omniscan (gadodiamide injection USP)		GE healthcare	J-110A
Custom Sleds		Dazai Research Instruments
PBS w/o Ca and Mg		Wisent	311-010-CL
Heparin 10000USP/10ml		Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02264315
ProHance (gadoteridol injection USP)		Bracco Diagnostics	11181
Parafolmadehyde (powder)		Sigma	P-6148-500g
Sodium Azide		Fisher	S227-100
Formalin 10%		Fisher	SF100-4