傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

要約

細胞媒介のlymphocytotoxicity（CML）アッセイは、in vitroにおける自己反応性応答と細胞死の研究のメカニズムをテストするために使用することができます。しかし、蛍光染料、型と細胞死だけでなく、利用経路の動態と生きた細胞の共焦点顕微鏡イメージング技術を用いてより詳細に調べることができる。

要約

1型糖尿病（T1D）は、T細胞媒介性自己免疫疾患である。インスリン産生が失われると病因の間に、患者は、T細胞による膵β細胞の破壊から、おそらくこの結果は、次第にinsulinopenicになる。 T1Dの開発中にベータ細胞死のメカニズムを理解することはこの病気のための効果的な治療法を生成するための洞察を提供します。細胞媒介lymphocytotoxicity（CML）アッセイは、歴史的に標的細胞を標識する放射性核種クロム^51（51 Cr）を使用している。これらのターゲットは、エフェクター細胞に曝露されており、標的細胞から^{の51 Cr}の放出は、リンパ球が介在する細胞死の指標として読み込まれます。 ^{51 Cr}の減少のリリースでは細胞死の結果の阻害剤。

エフェクター細胞として、我々はAI4 T細胞受容体（TCR）のαとβ鎖の両方のためのマウスの株式のトランスジェニックから分離されたCD8 ⁺細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の活性化自己反応性クローン集団を使用する。活性化さAI4 T細胞が16時間^{の51 Cr}標識標的NITの細胞と共培養された^{、51 Cr}の放出は、特異的溶解を計算するために記録された

ミトコンドリアなどのエネルギー生産、伝達をシグナル伝達の調節、およびアポトーシスなどの多くの重要な生理学的なイベントに参加。 T1Dの開発中のベータ細胞のミトコンドリアの機能変化の研究は、研究の新たな領域です。ミトコンドリア膜電位色素テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）と共焦点顕微鏡、ライブセルイメージングを使用して、我々は、β細胞株NIT - 1で時間をかけてミトコンドリア膜電位をモニターする。イメージング研究のために、エフェクターAI4 T細胞は、蛍光核染色色素Picogreenで標識した。 NIT - 1細胞とT細胞はチャンバーカバーガラスで共培養し、生細胞のチャンバーを装備した顕微鏡ステージに搭載された、37℃に制御された° C、5％CO _2、及び加湿付き。これらの実験中にイメージは、各クラスタから400分毎に3分を採取した。

400分のコースで、我々はAI4 T細胞が接続されていたNIT - 1細胞​​クラスターのミトコンドリア膜電位の散逸を観察した。 NIT - 1細胞​​はMHCの不整合ヒトリンパ球Jurkat細胞と共培養した同時対照実験では、ミトコンドリアの膜電位はそのまま残った。この手法は、細胞傷害性リンパ球、サイトカイン、または他の細胞毒性試薬の攻撃を受けて細胞内のミトコンドリア膜電位のリアルタイムの変化を観察するために使用することができます。

プロトコル

1。細胞の調製

1. 標的細胞培養：マウスのβ細胞株、NIT - 1及びNIT - 4の培養は、10％FBS、0.02％BSA、非必須アミノ酸、15mmのHEPES、16.5を含むDMEMで前に説明した^1,2だったGlocoseおよびペニシリン/ストレプトマイシン。 ^{5 × 10 4}細胞で平底96穴培養プレートの^{51 Cr}のラベル、種子の細胞/ウェル200μlの培養培地中のため。顕微鏡実験、500μlの培養培地中のチャンバーあたり5 × ⁴で8ウェルのLab -徳IIチャンバーカバーガラスの種子の細胞、および細胞毒性実験に使用する前に48時間のために成長することができます。
2. 制御性T細胞株の培養：陰性コントロールとしてJurkat細胞細胞株（ATCC、CD3 ⁺ヒトリンパ球細胞株）を使用してください。 RPMI1640で培養したJurkat細胞は10％FBS、2mMのL -グルタミン、1.5 g / Lの重炭酸ナトリウム、10mMのHEPESおよび1.0mMのピルビン酸ナトリウムを補充した。

2。エフェクター自己反応性CD8 ⁺ T細胞の収集と活性化

NOD.Cg - RAG1 ^tm1Mom TG（TcraAI4）1Dv....

ディスカッション

細胞傷害性T細胞を介したβ細胞死は、T1D ⁵の主な病態である。 ^{51 Cr}放出を用いたCMLアッセイは、私たちはエフェクター-ターゲットの反応⁶の度合いを調べることができます。しかし、詳細なプロセスと、T細胞媒介性のβ細胞死の経路はまだ完全には理解されていない。ミトコンドリアは、β細胞機能と死⁷の重要なので、我々は、視覚的なCMLの間にミトコンドリ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
CR - 51	パーキンエルマー	NEZ030500IMC
PBS	Cellgro	21-040-60
テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）	インビトロジェン	T668
Picogreen	インビトロジェン	P7581
AI4 mimotope	mimotopes.com	アミノ酸配列：YFIENYLEL
IL - 2	R＆D	485 - MI
DMEM	インビトロジェン	11885
FBS	HyClone	SH30071.03
ウシ血清アルブミン	シグマ	A8412
HEPES	Cellgro	25から060 - Clを
MEM非必須アミノ酸	GIBCO	11140
ペニシリン/ストレプトマイシン	双子座	400から109
フェノールレッドを含まないDMEM	シグマ	D5303
CO2インキュベータ	サーモフィッシャー	HeraCell 150i	細胞培養用の滅菌保管
生物学的安全キャビネット	サーモフィッシャー	フォーマ1440
使い捨て文化のチューブ、6x50 mm黄ガラス	フィッシャー	14から958 -
ガンマカウンタ	パーキンエルマー	ウィザード1470自動ガンマカウンター
共焦点顕微鏡	ツァイス	LSM 510共焦点メタ	電動ステージと生細胞のチャンバーで
ピペット（1ミリリットル、200μlの、20μlの、10μlの、2μlの）	エッペンドルフ
チューブ（アンバー）	フィッシャー	50819772
遠心	ソーバルレジェンドRT +	75004377
血球計	フィッシャーサイエンティフィック	267110
正立顕微鏡	ツァイス	Axioskop40
NOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcraAI4）1Dvs/DvsJマウス	ジャクソン研究所	004347
NOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcrbAI4）1Dvs/DvsJマウス	ジャクソン研究所	004348
NOD -AI4α/βF1マウス	N /	N /	フロリダ大学の動物施設で飼育