Подготовка, очистка и характеристика комплексов лантанидов для использования в качестве контрастных агентов для магнитно-резонансная томография

Резюме

Мы демонстрируем металлирование, очистка и характеристика комплексов лантанидов. Комплексы, описанные здесь могут быть сопряженными с макромолекулами включить отслеживание этих молекул с помощью магнитно-резонансной томографии.

Аннотация

Polyaminopolycarboxylate основе лигандов обычно используются для хелатных ионов лантанидов, и в результате комплексы могут использоваться в качестве контрастных агентов для магнитно-резонансной томографии (МРТ). Многие коммерчески доступные лигандов особенно полезны, поскольку они содержат функциональные группы, которые позволяют быстро, высокой чистоты и высокоурожайных конъюгации макромолекул и биомолекул с помощью амин-реактивного активированных эфиров и изотиоцианата групп или тиол-реактивного малеимидов. Хотя металлирование этих лигандов считается общеизвестным в области bioconjugation химии, тонкие различия в металлирование процедуры должны быть приняты во внимание при выборе металла исходных материалов. Кроме того, несколько вариантов для очистки и характеристики существует, и выбор наиболее эффективных процедур частично зависит от выбора исходных материалов. Эти тонкие различия часто пренебрегают в опубликованных протоколах. Здесь, наша цель заключается в демонстрации общих методов металлирование, очистка и характеристика комплексов лантанидов, которые могут быть использованы в качестве контрастных агентов для МРТ (рис. 1). Мы ожидаем, что эта публикация поможет биомедицинских ученые включить лантаноидов реакций комплексообразования в свой репертуар наиболее часто используемых реакций, облегчая выбор исходных материалов и методов очистки.

протокол

1. Металлирование использованием LnCl ₃ солей

1. Растворите в воде лиганд для получения решения 30-265 мМ. Лиганд 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-диэтилентриамин pentaacetic кислота (р-SCN-Вп-DTPA) была использована в этом видео в концентрации 73 мМ.
2. Отрегулируйте рН раствора лиганда в диапазоне от 5,5 до 7,0, добавляя 1 М NH ₄ OH. В этом видео, 0,2 мл 1 М NH ₄ OH решение было использовано.
3. Растворите 1-2 эквивалентами LnCl ₃ в воде для получения раствора с концентрацией 5-1000 мМ. В этом видео, EuCl ₃ и GdCl ₃ были использованы в концентрации 111 мМ. Избыток металла часто используется для дисков металлирование к завершению и, следовательно, упростить очистку.
4. Добавить решение LnCl ₃ до решения лиганд при перемешивании.
5. После добавления LnCl _3, отрегулировать рН полученной реакционной смеси от 5,5 до 7,0 добавлением 0,2 М NH ₄ OH. В общей сложности 0,5 мл 0,2 М NH ₄ OH решение было использовано в этом видео. Если лиганд содержит кислоту, чувствительных к функциональным группам, отрегулировать рН несколько раз во время этого шага. ВНИМАНИЕ - Если решение становится слишком основных, любая база чувствительных функциональных групп, как изотиоцианата, будет непригодным для сопряжения.
6. Монитор реакции с помощью измерения рН. Реакция считается завершенным, когда рН остается постоянным.

2. Повышение рН обследование (не входит в этом видео, но хорошо для лигандов без основания чувствительных функциональных групп)

1. Добавить концентрированный NH ₄ OH в реакционную смесь для доведения рН до ≥ 11. Этот шаг ускорит любой незакомплексованного металла нерастворимые гидроокиси.
2. Фильтры супернатанта через фильтр 0,2 мкм. Если реакционная смесь забивает фильтр, центрифугированием и декантацией до фильтрации рекомендуется.
3. Если диализ не будет выполнена, удалите растворитель при пониженном давлении (ротационный испарения или сублимационной сушки рекомендуется).
4. Шаги 2.1-2.3 может быть повторена, если свободное лантаноидов остается.

3. Диализ обследование

1. Вырезать диализа трубку к соответствующей длины (следовать рекомендациям производителя) провести объем пробы, оставляя дополнительной длины (примерно 10% от объема выборки). В этом видео, 100-500 дальтон молекулярная масса отсечки (MWCO) мембрана была использована, но больше MWCO трубы могут быть использованы в соответствующих случаях, если сопряжение осуществляется до металлирование. Кроме того, диализ кассеты могут использоваться как альтернатива диализа трубы при желании.
2. При необходимости на основе руководящих принципов производителя, помочь сократить трубы диализа в воде в течение 15 мин при комнатной температуре.
3. Заполните диализа водохранилища (1 л стакан была использована в данном видео) с водой (диализата). Диализата объем должен быть примерно в 100 раз, что в образце.
4. Сложите один конец трубки в два раза и безопасной сложенные части трубки с зажимом закрытия диализа. Оберните конец закрытия с резиновой лентой, чтобы убедиться, что он остается закрытым во время диализа.
5. Фильтры реакционной смеси через фильтр 0,2 мкм, и загружают фильтрата в открытый конец трубки будьте осторожны, чтобы не разорвать трубы. Не забудьте оставить достаточно места головы, чтобы закрыть трубу.
6. Сложите оставшийся открытым концом трубы в два раза, безопасный с закрытием, и оберните закрытия с резинкой, как в пункте 3.4.
7. Прикрепить стекла флакон, содержащий воздух зажим на одном конце трубы использованием диализа резинкой. Прикрепить флакон, содержащий песок других зажима. Эти флаконы обеспечения того, чтобы трубка остается погруженным в диализата.
8. Место полный труб в диализе резервуар, который содержит диализата.
9. Движение диализата использованием магнитных пластин перемешать на медленной скорости (без вортексе) при комнатной температуре.
10. Изменение диализата 3x в течение дня (в этом видео, диализата было изменено на уровне 2,5, 6,5 и 11,5 ч), а затем позволить диализа продолжать в течение ночи (в общей сложности 20-28 часов диализа).
11. Удалить диализа труб из диализата и осторожно откройте один закрытия для удаления образца. Вымойте диализа трубки 3x с водой и объединить стирок с образцом.
12. Удалите воду при пониженном давлении. Сублимационная сушка используется в этом видео.

4. Оценка наличия свободного металла

1. Растворите металл комплекса в ацетатный буфер (буфер приготовления: Растворить 1,4 мл уксусной кислоты в 400 мл воды, отрегулировать рН до 5,8 с 1 М NH ₄ OH, и добавьте воды, чтобы произвести общий объем 500 мл) и добавить ксиленола оранжевый индикатор (16 мкМ в рН 5,8 буфера). В этом видео, 0,3 мг комплекса растворяли в 0,3 мл буфера и 3 мл раствора индикатора был добавлен.
2. Определение наличия свободного металла через наблюдение изменение цвета индикатора от желтого до фиолетового.
3. При желании, количество свободного металла может быть определена количественно путем создания калибровочной кривой ^1. Кроме того, краситель арсеназо III может быть использован вместо ксиленолового оранжевый ^2. Если свободного металла остается, образец следует дополнительно очищают, используя диализ, обессоливания столбца или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) до характеристику.

5. Определение содержания воды-координационным числом (д)

1. Подготовка решения Eu ^{III-содержащих} комплекс (~ 1 мм) в H ₂ O и другое решение того же концентрации в D ₂ O. Перед проведением анализа, D ₂ O решение должно быть испаряется и растворяют в D ₂ O в три раза, чтобы удалить остатки H ₂ O.
2. Добавить водный раствор на чистую кювету и поместить кювету в spectrofluorometer.
3. Выполните возбуждения и излучения сканирует определить максимумы для каждого (~ 395 нм и ~ 595 нм, соответственно).
4. Выполните фосфоресценции времени распада эксперимент с использованием следующих параметров: возбуждения и излучения волн определяется из шага 5.3, возбуждения и излучения щели ширины (5 нм), флэш-счет (100), начальную задержку (0,01 мс), максимальная задержка (13 мс) , а прирост задержки (0,1 мс). Эти условия подходят для большинства комплексов, а максимальная задержка и приращение значения могут быть увеличены или уменьшены для видов с очень длинными или очень короткое время распада.
5. Повторите шаг 5,4 с D ₂ O раствор, приготовленный в шаге 5.1.
6. Из-распада люминесценции данных, полученных в 5,4 и 5,5, участок натуральный логарифм интенсивности в зависимости от времени. Наклон этих линий скорости распада (τ ^-1) (рис. 2). В этом видео, Microsoft Excel 2007 была использована для природных участков журнал из исходных данных. Используйте скорости распада в уравнении разработан Хоррокс и его коллеги (напр. 1) ^3. Если лиганд содержит ОН или NH группы согласуются с металлом, то уравнение должен быть изменен перед использованием ^3.

экв 1:

6. Relaxivity измерений

1. Выберите нужный режим применения на анализаторе релаксации: T ₁ (время продольной релаксации) или _Т-2 (время поперечной релаксации).
2. Подготовка серии образцов, которые содержат различные концентрации Gd ^{III-содержащего} комплекса в водном растворителе. В этом видео, вода была использована в качестве растворителей и растворов 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 и 0 мМ были подготовлены. Другие водные растворители или буферы могут быть использованы, но важно использовать растворитель, как пустой. Конечный объем пробы, специфичные для инструмента, который используется.
3. Место образца в прибор и оставьте на 5 минут, чтобы уравновесить до температуры инструмент (37 ° С в этом видео).
4. Определить время релаксации (в единицах ы), регулируя параметры программного обеспечения для получения гладкой экспоненциальная кривая T ₁ и T ₂ (представитель кривые для T ₁ и T ₂ показаны на рисунке 3).
5. Повторите шаги 6,3 и 6,4 для всех образцов, включая пустые.
6. Вычислить обратную измеряется T ₁ и T ₂ значения в единицах с ^-1.
7. Участок T ₁ ^-1 или Т ₂ ^-1 значений от концентрации Gd ^III (в единицах мМ). Из-за гигроскопичны характер Б-г ^{III-содержащих} комплексов, подтвердить концентрации Gd ^III с помощью атомно-абсорбционной спектрофотометрии или индуктивно-связанной плазмы масс-спектрометрии. Fit сюжет с прямой линии. Представитель график представлен на рисунке 4.
8. Склона оборудована линия relaxivity (R ₁ или R ₂ для Т ₁ и Т _2, соответственно) и имеет размерность мм ^-1 с ^-1.

7. Представитель Результаты

Представитель данные шаги в этом протоколе, были включены в Таблицы и рисунки раздела. В дополнение к воде координационным числом и relaxivity характеристики описаны в протоколе, важно для характеристики конечных продуктов с использованием стандартных методов химического вещества. Личность соединение может быть получено с помощью масс-спектрометрии и представитель масс-спектров показывает диагностических характеристиках изотопов к Б-гу ^III - ^III и Eu-содержащих комплексов, показаны на рисунке 5. Кроме того, для не-Б-г ^III лантаноидов содержащих комплексов, ЯМР-спектроскопии может быть использован для идентификации продукта. Для характеристики чистоты комплекса, ВЭЖХ или элементного анализа или оба могут быть использованы.

Рисунок 1 Общая схема металлирование и очистки. Схема изображающие общий порядок металлирование и причины для выбора разных маршрутов очистки.

Рисунок 2 Люминесценция интенсивности участка:. Представитель участок натуральный логарифм интенсивности в зависимости от времени из раздела 5. Наклона прямых полученные от подобных кривых, приобретенных для воды и D ₂ O решения используются с 1 экв охарактеризовать воды координационное число Eu ^{III-содержащих} комплексов.

Рисунок 3 Релаксация время спада кривых:. Репрезентативных данных (слева) и T ₁ (справа) T ₂ приобретения. Отклонения от этих форм кривой будет производить недостоверных сведений.

Рисунок 4 Relaxivity определения:. Представитель участок 1 / T _{1 по} сравнению с концентрацией Gd ^III. Склона оборудована линия relaxivity и единиц мМ ^-1 с ^-1.

Рисунок 5 Масс-спектры. Представителю масс-спектров показывает диагностических характеристиках изотопа (слева), Б-г ^{III-содержащих} комплексов и (справа) Eu ^{III-содержащих} комплексов. Черные пики гауссовский представляют теоретическое распределение изотопов и красные линии являются фактическими данными.

Обсуждение

Учитывая растущее количество публикаций, которые включают лантаноидов основе контрастных веществ ^4-14, важно, что приняты меры по подготовке, очистке, и характеризующие продукции, чтобы обеспечить воспроизводимые и сопоставимые результаты. Эти комплексы часто считается сложной, ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реактивы и оборудование	Компания	Номер в каталоге
EuCl 3 • 6H 2 O	Sigma-Aldrich	203254-5G
р-SCN-Вп-DTPA	Macrocyclics	B-305
гидроксид аммония	EMD	AX1303-3
Spectra / Por Biotech эфиров целлюлозы (CE) Диализ Мембрана - 500 D MWCO	Fisher Scientific	68-671-24
Millipore IC Millex-LG фильтровальные установки	Fisher Scientific	SLLG C13 NL
ксиленола оранжевый тетранатриевая соль	Альфа Aesar	41379
уксусная кислота	Fluka	49199
D 2 O	Кембриджский Изотопный Laboratories, Inc	DLM-4-25
водоочиститель	ELGA	Purelab Ультра
высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии	Shimadzu	LCMS-2010EV
Анализатор время релаксации	Bruker	mq60 minispec
UV-VIS спектрофотометр	Fisher Scientific	20-624-00092
замораживание сушилка	Fisher Scientific	10-030-133
измеритель pH	Hanna Instruments	HI 221
spectrofluorometer	HORIBA Jobin Ивон	Fluoromax-4
Молекулярные версии калькулятора Вес 6,46 Мэтью Монро, скачан 17 октября 2009	http://ncrr.pnl.gov/software/	Молекулярная Калькулятор веса