Испытание Хвост подвеска

Резюме

Хвост-подвески тест проверяется как экспериментальная процедура оценки антидепрессивной эффективности лекарственной терапии у мышей. Мыши подвешены за хвосты в течение шести минут и избежать поведения, связанного оцениваются. Мы описываем процедуры, используемые при проведении испытаний хвостом подвески.

Аннотация

Хвост-подвески тест мыши поведенческих тестов полезно в отбора потенциальных антидепрессантов, а также оценки других манипуляций, которые, как ожидается, повлияет депрессии связано поведение. Мыши подвешены за хвосты с лентой, в таком положении, что она не может убежать или держаться на близлежащие поверхности. Во время этого теста, как правило, шесть минут по продолжительности, в результате побега ориентированного поведения количественно. Хвост-подвески тест является ценным инструментом в лекарственных препаратах для высокопроизводительного скрининга перспективных антидепрессант соединений. Здесь мы описываем детали, необходимые для реализации этого теста с дополнительным акцентом на возможные проблемы, которые могут возникнуть и как их избежать. Мы также предлагаем решения хвост восхождение поведения, общая проблема, которая делает этот тест бесполезно в некоторых штаммов мыши, такие, как широко используется C57BL / 6. В частности, мы предотвращаем хвост восхождение поведения, передавая мыши хвосты через маленькие пластмассовыецилиндра до приостановления. Наконец, мы подробно, как вручную оценка поведения, которые проявляются в этом тесте.

протокол

1. Материалы

1. Подвеска Box

Хвост-подвески теста (TST) включает в себя приостановление мыши над землей за хвосты. На самом базовом уровне, процедура требует только бар приостановлении или полки выступа, и ленты. Тем не менее, экспериментатор должен рассмотреть вопрос об использовании фон, который обеспечивает оптимальную контрастность. Кроме того, целесообразно принять меры, чтобы предотвратить мышей от соблюдения других животных, которые проходят испытания. В нашей лаборатории мы используем специально изготовленные хвостом подвески коробки (четыре-часовой рабочий день, Балтимор MD), изготовленных из пластика с размерами (55 х высота 60 ширина х 11,5 см глубины). В целях предотвращения животных от наблюдения или взаимодействующих друг с другом, каждая мышь приостановлено в пределах своей собственной три стенками прямоугольного отсек (55 X 15 высота ширина х 11,5 см глубины). Мышь приостановлено в середине этого отсека и ширине и глубине достаточно размера, чтобы мышь не может сделать сотрудничествоntact со стенами. В этих условиях приблизительное расстояние между носом мышки и аппарат пола составляет 20-25 см. Есть четыре таких идентичны отсеки в аппарате позволяет нам тестировать четыре мышей одновременно. Бар алюминиевые подвески (1 см. Высота х 1 см. Ширину х 60 см. Длины), используется для приостановки хвосте каждой мыши, расположен на верхней части коробки. Размеры, которые мы используем в нашей лаборатории, следует рассматривать как общую справочную информацию. Например, размер отдельных отсеков хвостовой подвески коробки может быть увеличена, если большая нагрузка беспородных мышей (например, CD-1) не используется.

В нижней части каждого отсека мы размещаем съемный лоток алюминия, который собирает кала или мочи животных. Мы используем темно серый квадрат на альбиноса животные и кремового цвета коробки для мышей других цветов шерсти. Такое расположение дает нам лучшую контрастность и поэтому более надежна поведенческих озвучивание тест.

2. Лента

Лента должна придерживаться надежно как мыши хвост и подвески бар, и быть достаточно прочными, чтобы выдержать вес мыши проходит испытания (например, TimeMed Маркировка Systems, Inc, Burr Ridge IL, 1,9 см в ширину). Тем не менее, лента не должна быть чрезмерно липкой так как в конце сессии он будет удален из хвоста. Мы сократили 17 см фрагменты ленты и место знак 2 см от края. Это на 2 см часть была использована для крепления ленты к хвосту, а остальные 15 см была использована для приостановления мыши.

3. Таймер

4. Устройство видеозаписи

Видеокамера и штатив (или другие структуры поддержки) не требуется. Так как этот тест обычно включает в себя несколько животных проходит испытания в то же время, жить забив будет трудным и не рекомендуется. Видеокамера должна записи в приветGH достаточное разрешение для отображения качества изображения, которое будет использоваться в дальнейшем для поведенческого скоринга. Всегда убедитесь, что имеется достаточно памяти, запись в камере перед началом теста. Мы используем видео-камеры, которые в электронном формате без использования физических носителей (например, видео-кассета), что позволяет просто передача видео.

5. Белый шум генератора

Генератор шума должен маски прерывистый звуки окружающей среды. Использование генератора шума особенно рекомендуется в лабораторных условиях, где внезапный громкий шум можно услышать, что потенциально могло бы напугать мышей. В нашей экспериментальной комнате уровень окружающего шума (без генератором белого шума активирована) составляет около 60 дБ. Общий уровень звука с генератором белого шума активируется в месте, где TST проводится в 70-72 дБ. Тем не менее, следует отметить, что эти цифры приведены в качестве примера только, и каждая лаборатория должна выбратьПраво уровней шума в соответствии с их уникальной окружающей среды и обстоятельств.

6. Средства для чистки

Подвески коробка должна быть уничтожена полностью после каждой сессии с стерилизации раствора (например, MB-10, Quip Laboratories, Inc, Уилмингтон, Делавэр, и т.п.).

7. Climbstoppers (опционально: зависит от штамма используется)

Мыши некоторых фонов, таких как C57BL / 6, могут подняться хвосты во время теста ^1. Очистить полых цилиндров (4 см в длину, 1,6 см наружный диаметр, 1,3 см в диаметре, 1,5 грамма), которые разрезают на четыре см в длину (по FourHourDay Inc, Балтимор MD) из труб поликарбоната (# 8585K41, McMaster-Carr, Санта-Фе-Спрингс , Калифорния) расположены вокруг хвостов мышей, чтобы предотвратить такое поведение хвоста восхождения ^2,3. Эти устройства могут быть выполнены в любой лаборатории с обычных инструментов и материалов.

2. Поведенческие процедур

Общий экспериментальный дизайн должен отражать надлежащее противовеса между переменные, характерные для эксперимента. Например, в наших экспериментах мы стараемся для представления каждой группы в равной степени во всех TST сессии (т.е., если Есть четыре группы, каждая из них будет представлена ​​в каждой сессии). Кроме того, позиции мыши поворачиваются таким образом, что мышей из каждой группы находятся в ином положении в каждой сессии.

1. Поместите фотокамеру в нужном положении. Камера должна быть как можно ближе, чтобы получить максимально возможное разрешение животных.
2. Лента фрагменты, которые будут использоваться во время сессии должны быть сокращены, маркировано и подготовлен к сессии.
3. Начало генератором белого шума, если используется, прежде чем мышей знакомятся с тестирования комнате. Уровень белого шума должен только быть достаточно, чтобы замаскировать внешние шумы. Избегайте большого объема и убедитесь, что такой же уровень белого шума используется для всех животных.
4. Принеситеimals в тестировании комнате. Если комната, где животные живут и тестирования комнате рядом друг с другом с аналогичным условиям окружающей среды, без акклиматизации срок может быть необходимо. В противном случае, место животных в тестировании возможностей для периода акклиматизации (как правило, не менее одного часа). Помните, что другие животные помещаются в одной комнате может ощутить обонятельные и ультразвуковые сигналы.
5. Если напряжение известно, чтобы подняться хвосты, такие как C57BL6 / J, используется месте Climbstoppers вокруг хвосты перед нанесением ленты.
6. Придерживайтесь ленты хвосты мышей. Используйте отмечен конец ленты и убедитесь, что лента приклеивается к хвосту и обратно на себя. Лента должна быть применена к самому концу хвост с 2-3 миллиметров хвоста, остающихся вне ленты.
7. Как только каждый кусок ленты крепится к мыши хвост палкой средней части ленты на внутренних стенках клетки. Это поможет избежать запутывания ленты частей друг к другу. Заметим, что сonfinement таким образом может вызвать стресс и, что важно, чтобы завершить процесс применения ленты для каждого животного, как только возможно.
8. После того как все Лента применяется, начать запись и определить сессии до мышей приостановлены.
9. Приостановить животных, поместив свободный конец ленты на панели подвеской или на полке в порядке, который уравновешивается между группами лечения. Приостановить мышей таким образом, чтобы это не создавало препятствий камеры, потому что вся сессия TST будет забито и препятствует камеры приведет к невозможности оценить поведение в это время. Убедитесь, что все ленты концы висят параллельно бар приостановлении или полку с аналогичной длиной слабину для каждой мыши.
10. В конце сессии (которая, как правило шести минут), возвращение животных в их homecage и осторожно удалите ленту с каждого хвоста, осторожно потянув ее. Не сорвать ленту с хвоста так как это может вызвать боли в микрофонe.
11. После возвращения мышей, чтобы их колонии комнату отказаться от фекальных Боли и мочи из коллекции лотки и протрите аппарат с стерилизации решение.

3. Анализ поведения

1. Как правило, TST является от начала до конца шесть минут в длину. В отличие от другого широко используется антидепрессант процедуры эффективность, вынуждены плавать теста, весь сеанс забил. Это связано с общий вывод, что у мышей, как правило, проявляются неподвижность ранее в TST.
2. В нашей лаборатории мы загружать видео-файлы непосредственно с камеры на компьютер, где проводится анализ.
3. В поведенческом анализе времени, что каждый мышь тратит как мобильные измеряется. Хотя вполне возможно, для измерения времени неподвижности напрямую, мы нашли ее легче обнаружить и измерить активных движений, а не отсутствие такого движения.
4. Наиболее важным аспектом TST поведенческого анализа является последовательное выявление движенияов, которые регистрируются в качестве добросовестных мобильности. Мыши, особенно в начале сессии, проявлять поведение, которое открыто избежать связаны между собой. К ним относятся пытаются достичь стен аппарата и подвески бар, сильным сотрясением тела, и движения конечностей сродни работает. Эти движения, несомненно, являются мобильность. Такое поведение, то стихают и становятся тоньше. В нашей лаборатории небольшие движения, которые ограничены передними ногами, но без участия задние ноги, не учитываются как мобильность. Кроме того, колебания и маятник, как качели, которые из-за импульс, полученный в ходе предыдущих боев мобильности также не учитываются, как мобильность.
5. В нашей лаборатории мы используем на экране секундомер программное обеспечение для измерения времени (XNote секундомер, dnSoft Research Group). Два отдельных секундомеров, используемых на экране. Первый секундомер отсчитывает от 360 секунд и оповещения наблюдателя при анализе поведенческих период заканчивается. Второй стоpwatch-контролируемой наблюдателями мерах время, проведенное мобильного телефона. Некоторые программы секундомер имеет возможность назначать ключи для запуска и остановки функций, так что на экране клавиатуры могут управлять секундомер. Вместо обычной клавиатуры, мы используем устройства ввода широко известный как "геймпад" для управления секундомеры.
6. Если есть больше чем одна мышь проверены и присутствует на экране, это хорошая идея, чтобы покрыть другие животные, так что их движение не будет отвлекать наблюдателя. Это может быть достигнуто с помощью другой программы окна или физически покрытие других мышей на экране с бумагой.
7. Там могут быть некоторые смещения, происходящие, если общее количество времени, прошедшего мобильности для конкретной мыши видна до завершения анализа сессии. Если на экране секундомер используется, мы предлагаем, чтобы охватить все, но миллисекунды десятичные дроби из секундомер. Прикрывая секундомер наблюдатель знает ли секундомерили выключить в любой момент, но не знает общее время прошло, и поэтому не может зависеть от какой-либо предвзятости. Используя этот подход наблюдателя, в то время закрывать глаза на групповых заданий животных, не будет иметь общее представление о уровень мобильности у каждого животного.
8. Тест interobserver надежность должна проводиться для каждого нового наблюдателя, прежде чем начать собирать данные из подопытных животных. В нашей лаборатории каждый новый наблюдатель первые часы опытный наблюдатель, пока он или она забил. После новых наблюдателей получить достаточную уверенность, чтобы отличать мобильность от неподвижности, они тогда счет в режиме реального времени с опытным наблюдателем заниматься указывая на ошибки. Как только этот этап успешно завершен, новых наблюдателей будет анализировать определенный набор TST видео, которые мы поддерживаем в нашей лаборатории в учебных целях. Только после того, высокий уровень interobserver корреляция полученных опытный наблюдатель делает следователя анализировать TST видео с фактическимэкспериментов. Мы архива данных из этих учебных анализов, чтобы составить внутренний стандарт для лабораторий. Мы наблюдали различия между штаммами в порядке, в котором они выражают мобильности (и неподвижности) поведения, и означает неподвижность времени между полами. Когда новый штамм мыши, пола или генетически модифицированная модель тестируется в лаборатории необходимо снова провести этот тип анализа надежности.

4. Представитель Результаты

Мы использовали TST для оценки антидепрессантом, как ответы на литий лечения в различных линий мышей (рис. 1) ^3. Экспериментальные детали этого эксперимента опубликованы в Кан и соавт., 2011 ^3.

Рисунок 1. Неподвижность время в тестовом хвост суспензии после длительном приеме лития в пяти инбредных линий мышей. Мышей группы домег, четыре мыши в клетке. Мышей в группе лечения лития получил литий чау, содержащий 4 г / кг LiCl в течение трех недель. Контрольные животные получали идентичный пищу без хлорида лития. ** Р <0,01, ***: р <0,001 обозначают значительные, непарный т-тест. Данные представлены в виде среднего ± SEM. н :10-12 животных в каждой группе для каждого штамма. (Рисунок воспроизведен из ^3).

В этом примере, существенного влияния лечения хронических лития доставлен в пище наблюдается только в C57BL/6J и DBA/2J штаммов. В трех других штаммов, не статистически значимое снижение неподвижность времени не наблюдалось. Эти данные свидетельствуют о том, что антидепрессанты, как ответ на хроническое лечение лития напряжение зависимой как это наблюдалось и с другими антидепрессантами ^4-8.

Обсуждение

Развитие TST по Steru и др. ^9. Находился под влиянием разработанной ранее вынуждены плавать тест ^10-12. Как и вынуждены плавать испытания, в TST мышей находятся в неизбежной, но умеренно стрессовой ситуации. Отсутствие избежать поведения, связанного считается неподвижности. Как...

Материалы