Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Resumo

Um protocolo de base para a separação de fragmentos de DNA usando electroforese em gel de agarose é descrito.

Resumo

De agarose de electroforese em gel é a forma mais eficaz de separar fragmentos de ADN de tamanhos variados que variam de 100 pb a 25 kb ^1. De agarose é isolado a partir da alga géneros Gelidium e Gracilaria, e consiste de agarobiose repetido (L-e D-galactose) subunidades ^2. Durante a gelificação, os polímeros de agarose associar não covalentemente e formam uma rede de feixes cujos poros tamanhos determinar um gel moleculares propriedades de peneiração. A utilização de electroforese em gel de agarose revolucionou a separação de DNA. Antes da adopção de géis de agarose, o DNA foi primeiramente separados utilizando sacarose centrifugação em gradiente de densidade, que apresentou apenas uma aproximação de tamanho. Para separar o DNA usando electroforese em gel de agarose, o DNA é carregado no pré-moldados poços no gel e uma corrente aplicada. A espinha dorsal do fosfato do ADN (e RNA) molécula é carregada negativamente, por conseguinte, quando colocado num campo eléctrico, fragmentos de ADN irá migrar para a positively carregada ânodo. Como o DNA tem uma relação de massa / carga uniforme, moléculas de DNA são separados por tamanho dentro de um gel de agarose num padrão tal que a distância percorrida é inversamente proporcional ao logaritmo do seu peso molecular ^3. O modelo principal para o movimento de DNA através de um gel de agarose é "enviesada reptation", em que o bordo de ataque se move para a frente e puxa o resto da molécula ao longo de ^4. A taxa de migração de uma molécula de DNA através de um gel é determinada pela sequência: tamanho 1) da molécula de ADN, 2) concentração de agarose, 3) conformação de DNA ^5, 4) presença de tensão aplicada, 5) de brometo de etídio, 6) tipo de agarose e 7) tampão de electroforese. Após a separação, as moléculas de ADN podem ser visualizados sob luz UV, após coloração com um corante apropriado. Seguindo este protocolo, os alunos deverão ser capazes de:

1. Compreender o mecanismo pelo qual os fragmentos de DNA são separados dentro de uma matriz de gel
2. Entenda como conformação daMolécula de ADN irá determinar a sua mobilidade por meio de uma matriz de gel
3. Identificar uma solução de agarose de concentração adequada para suas necessidades
4. Preparar um gel de agarose para eletroforese de amostras de DNA
5. Configure o aparelho de eletroforese em gel e fonte de alimentação
6. Seleccionar uma tensão apropriada para a separação de fragmentos de ADN
7. Compreender o mecanismo pelo qual o brometo de etídio permite a visualização das bandas de DNA
8. Determinar os tamanhos dos fragmentos de DNA separados

Protocolo

1. Preparação do Gel

1. Pesar a massa adequada de agarose em um balão de Erlenmeyer. Géis de agarose são preparadas utilizando aw / v solução percentagem. A concentração de agarose num gel dependerá dos tamanhos dos fragmentos de ADN a ser separado, com a maioria dos géis que variam entre 0,5% -2%. O volume do tampão não deve ser maior do que 1/3 da capacidade do balão.
2. Adicionar tampão de corrida para o balão de agarose contendo. Agite para misturar. O gel mais comum em execução buffers são TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) e TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA).
3. Derreta a mistura de agarose / buffer. Esta é mais comumente feito por aquecimento em microondas, mas também pode ser feito ao longo de uma chama de Bunsen. Em intervalos de 30 s, retirar o balão e agite o conteúdo para misturar bem. Repita até que a agarose foi completamente dissolvido.
4. Adicionar brometo de etídio (EtBr) a uma concentração de 0,5 ug / ml. Alternativamente, o gel pode também ser coradas após electroforese em tampão de corrida contendo 0,5 ug / ml para EtBr 15-30 min, seguido de descoloração em tampão de corrida para um comprimento igual de tempo.

Nota: EtBr é suspeito de ser carcinogênico e devem ser eliminadas de acordo com as normas da instituição. As luvas devem ser sempre usadas ao manusear géis contendo EtBr. Corantes alternativos para a coloração do ADN estão disponíveis, no entanto EtBr continua a ser a mais popular devido à sua sensibilidade e custo.

5. Permitir que a agarose para arrefecer tanto na bancada ou por incubação em um banho de água 65 ° C. Não fazer isso irá deformar a bandeja de gel.
6. Coloque o tabuleiro de gel dentro do aparelho de fundição. Alternativamente, pode-se também fita as extremidades abertas de um tabuleiro de gel para criar um molde. Coloque um pente apropriado para dentro do molde de gel para criar os poços.
7. Verter a agarose fundida no molde de gel. Permitir que a agarose para definir a temperatura ambiente. Remover o pente e colocar o gel na caixa de gel. Alternativamente, o gel também pode ser envolto em película de plástico e armazenado a 4 ° C até à sua utilização (Fig. 1).

2. Criação de Aparelhos Gel e separação dos fragmentos de DNA

1. Adicionar carregamento corante para as amostras de DNA a ser separada (fig. 2). Carga de gel de corante é tipicamente feito a uma concentração 6X (0,25% azul de bromofenol, xilenocianol a 0,25%, 30% de glicerol). Carregando tintura ajuda a controlar o quanto sua amostra de DNA viajou, e também permite que a amostra afundar no gel.
2. Programa oferta o poder de tensão desejada (1-5V/cm entre os eletrodos).
3. Adicionar tampão de corrida suficiente para cobrir a superfície do gel. É importante usar o mesmo tampão executado como o utilizado para preparar o gel.
4. Ligue os fios da caixa de gel para o fornecimento de energia. Ligue a fonte de alimentação e verificar que tanto a caixa de gel e fonte de alimentação estão funcionando.
5. Remover a tampa. Lentamentee cuidadosamente carregar a amostra de DNA (s) para dentro do gel (Fig. 3). Um marcador de tamanho apropriado de DNA devem sempre ser carregado juntamente com amostras experimentais.
6. Colocar a tampa para a caixa de gel. O cátodo (fios pretos) deve estar mais perto dos poços do que o ânodo (pistas vermelhas). Verifique se os eletrodos estão conectados nos slots corretos no fornecimento de energia.
7. Ligue a alimentação. Executar o gel até o corante tenha migrado para uma distância apropriada.

3. Observando fragmentos de DNA separados

1. Quando eletroforese foi concluído, desligue a fonte de alimentação e retire a tampa da caixa de gel.
2. Remover gel a partir da caixa de gel. Drenar o tampão em excesso a partir da superfície do gel. Coloque a bandeja de gel em papel toalha para absorver qualquer buffer extra em execução.
3. Remover o gel a partir do tabuleiro de gel e expõe o gel à luz UV. Esta é mais comumente feito usando um sistema de documentação gel (Fig. 4). Bandas de DNA deve mostraracima como laranja bandas fluorescentes. Tire uma foto do gel (Fig. 5).
4. Descarte a gel e tampão de corrida por regulamentos da instituição.

4. Os resultados representativos

A Figura 5 representa um resultado típico após electroforese em gel de agarose de produtos de PCR. Após a separação, os fragmentos de DNA resultantes são visíveis como bandas claramente definidos. O padrão de ADN ou de escada devem ser separados a um grau que permite a determinação útil dos tamanhos das bandas da amostra. No exemplo mostrado, fragmentos de DNA de 765 pb, 880 pb e 1022 pb foram separados num gel de agarose a 1,5%, juntamente com uma escada de DNA 2-log.

Figura 1. Um solidificou em gel de agarose após a remoção do pente.

Figura 2. Um estudante adicionando corante de carregamento para as amostras de DNA.

Figura 3. Um estudante carregamento da amostra de DNA dentro de um poço no gel.

Figura 4. Um exemplo de um sistema de documentação de gel.

Figura 5. Uma imagem de uma electroforese em gel de pós. EtBr foi adicionado ao gel antes de electroforese para uma concentração final de 0,5 ug / ml, seguido de separação a 100 V durante 1 hora. O gel foi exposto a luz UV e da fotografia tirada com um sistema de documentação de gel.

Discussão

Electroforese em gel de agarose provou ser um modo eficiente e eficaz de separar ácidos nucleicos. Força de agarose de gel de alta permite a manipulação de géis percentuais de baixo custo para a separação de fragmentos de ADN de grande porte. Peneiração molecular é determinado pelo tamanho dos poros gerados pelos feixes de agarose ⁷ na matriz de gel. Em geral, quanto maior a concentração de agarose, quanto menor o tamanho dos poros. Géis de agarose tradicionais são mais eficazes na separação de fragmentos de ADN entre 100 bp e 25 kb. Para separar fragmentos de ADN maiores do que 25 kb, uma será necessário usar pulso electroforese em gel de campo ^6, que envolve a aplicação de corrente alternada a partir de duas direcções diferentes. Deste modo maiores fragmentos de DNA são separados por tamanho a velocidade a que eles reorientar-se com as mudanças na direcção da corrente. Os fragmentos de DNA mais pequenos do que 100 pb são mais eficazmente separados usando electroforese em gel de poliacrilamida. Ao contráriogéis de agarose, a matriz de gel de poliacrilamida é formada através de uma reacção química de radical livre accionado. Estes géis são mais finas de maior concentração, são executados na vertical e tem uma melhor resolução. No DNA moderna sequenciação electroforese capilar é usado, em que tubos capilares são preenchidos com uma matriz de gel. A utilização de tubos capilares permite a aplicação de tensões elevadas, permitindo assim a separação de fragmentos de DNA (e à determinação da sequência de ADN) rapidamente.

Agarose pode ser modificada para criar baixo ponto de fusão de agarose através hydroxyethylation. Baixo ponto de fusão de agarose é geralmente usado quando o isolamento de fragmentos de DNA separados é desejada. Hydroxyethylation reduz a densidade de empacotamento dos feixes de agarose, reduzindo efectivamente o seu tamanho de poro ^8. Isto significa que um fragmento de ADN do mesmo tamanho levará mais tempo para se mover através de um baixo ponto de fusão gel de agarose em oposição a um gel de agarose padrão. Porque os feixes associar com um outroatravés de interacções não covalentes ^9, é possível re-derreter gel de agarose um depois de ter definido.

EtBr é o reagente mais comum utilizado para corar o DNA em géis de agarose a ^10. Quando exposta à luz UV, os electrões no anel aromático da molécula de etídio são activadas, o que leva à libertação de energia (luz) como o retorno electrões para estado fundamental. EtBr funciona por intercalando-se na molécula de ADN de uma forma dependente da concentração. Isto permite a uma estimativa da quantidade de DNA em qualquer banda de DNA particular com base na sua intensidade. Devido à sua carga positiva, o uso de EtBr reduz a taxa de migração de DNA em 15%. EtBr é um agente mutagênico e carcinogênico suspeito, portanto é preciso cuidado ao manusear géis de agarose que o contenham. Além disso, é considerado um EtBr resíduos perigosos e devem ser eliminados de forma adequada. Manchas alternativos para DNA em gel de agarose incluem SYBR Gold, SYBR verde, Cristal Violeta Metil e Azul. Destes,Metil Blue e Cristal Violeta não requerem a exposição do gel à luz UV para a visualização das bandas de DNA, reduzindo assim a probabilidade de mutação se a recuperação do fragmento de ADN a partir do gel é desejada. No entanto, as suas sensibilidades são mais baixos do que a de EtBr. SYBR ouro e SYBR verdes são ambos altamente sensíveis, uv corantes dependentes, com menor toxicidade do que EtBr, mas são consideravelmente mais caros. Além disso, todos os corantes alternativos ou não pode ser ou não funcionam bem quando adicionado directamente ao gel, portanto, o gel terá de ser coradas pós após a electroforese. Devido à facilidade de custo, de uso, e sensibilidade, EtBr continua a ser o corante de escolha para muitos investigadores. No entanto, em determinadas situações, tais como quando a eliminação de resíduos perigosos é difícil ou quando jovens são realizar um experimento, um corante menos tóxica pode ser preferido.

Corantes de carregamento utilizadas no eletroforese em gel de servir a três propósitos principais. Primeiro adicionam densidade para a amostra, Permitindo que a afundar-se no gel. Em segundo lugar, os corantes proporcionar cor e simplificar o processo de carregamento. Finalmente, os corantes mover na taxa padrão através do gel, o que permite para a estimativa da distância que os fragmentos de DNA ter migrado.

As dimensões exactas dos fragmentos de DNA separados pode ser determinada através da representação gráfica do logaritmo do peso molecular das bandas diferentes de um padrão de DNA contra a distância percorrida por cada banda. O padrão de DNA contém uma mistura de fragmentos de ADN de tamanhos pré-determinados que podem ser comparados contra as amostras de DNA desconhecidos. É importante notar que as diferentes formas de ADN mover-se através do gel com taxas diferentes. DNA de plasmídeo superenrolado, devido à sua conformação compacta, se move através da rápida em gel, seguida por um fragmento de DNA linear do mesmo tamanho, com a forma circular aberta viajando o mais lento.

Em conclusão, uma vez que a adopção de géis de agarose na década de 1970 para a separação de DNA, que temprovado ser uma das técnicas mais úteis e versáteis na investigação ciências biológicas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
Eu Agarose	Amresco	0710
Ácido bórico	Sigma	B7901
Azul de bromofenol	Sigma	B8026
EDTA	Sigma	E9884
O brometo de etídio	Sigma	E7637	Cancerígeno-precisa ser eliminados como resíduos perigosos
Ácido acético glacial	Pescador	BP2401-212	Corrosivo
Glicerina	Pescador	G33-1
Tronco e ramose cianol FF	Sigma	X4126
Tris base	Sigma	T1503
Investigador / FX sistema de documentação de gel	Fotodyne
Coruja Easycast B1 mini-sistema de eletroforese em gel	Thermo Scientific	B1-PTM
EPS fonte de alimentação 301	GE Healthcare	18-1130-01