Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

De agarose de electroforese em gel é a forma mais eficaz de separar fragmentos de ADN de tamanhos variados que variam de 100 pb a 25 kb ^1. De agarose é isolado a partir da alga géneros Gelidium e Gracilaria, e consiste de agarobiose repetido (L-e D-galactose) subunidades ^2. Durante a gelificação, os polímeros de agarose associar não covalentemente e formam uma rede de feixes cujos poros tamanhos determinar um gel moleculares propriedades de peneiração. A utilização de electroforese em gel de agarose revolucionou a separação de DNA. Antes da adopção de géis de agarose, o DNA foi primeiramente separados utilizando sacarose centrifugação em gradiente de densidade, que apresentou apenas uma aproximação de tamanho. Para separar o DNA usando electroforese em gel de agarose, o DNA é carregado no pré-moldados poços no gel e uma corrente aplicada. A espinha dorsal do fosfato do ADN (e RNA) molécula é carregada negativamente, por conseguinte, quando colocado num campo eléctrico, fragmentos de ADN irá migrar para a positively carregada ânodo. Como o DNA tem uma relação de massa / carga uniforme, moléculas de DNA são separados por tamanho dentro de um gel de agarose num padrão tal que a distância percorrida é inversamente proporcional ao logaritmo do seu peso molecular ^3. O modelo principal para o movimento de DNA através de um gel de agarose é "enviesada reptation", em que o bordo de ataque se move para a frente e puxa o resto da molécula ao longo de ^4. A taxa de migração de uma molécula de DNA através de um gel é determinada pela sequência: tamanho 1) da molécula de ADN, 2) concentração de agarose, 3) conformação de DNA ^5, 4) presença de tensão aplicada, 5) de brometo de etídio, 6) tipo de agarose e 7) tampão de electroforese. Após a separação, as moléculas de ADN podem ser visualizados sob luz UV, após coloração com um corante apropriado. Seguindo este protocolo, os alunos deverão ser capazes de:

1. Compreender o mecanismo pelo qual os fragmentos de DNA são separados dentro de uma matriz de gel
2. Entenda como conformação daMolécula de ADN irá determinar a sua mobilidade por meio de uma matriz de gel
3. Identificar uma solução de agarose de concentração adequada para suas necessidades
4. Preparar um gel de agarose para eletroforese de amostras de DNA
5. Configure o aparelho de eletroforese em gel e fonte de alimentação
6. Seleccionar uma tensão apropriada para a separação de fragmentos de ADN
7. Compreender o mecanismo pelo qual o brometo de etídio permite a visualização das bandas de DNA
8. Determinar os tamanhos dos fragmentos de DNA separados