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요약

을 통해 에리스로 마이신의 heterologous 생합성 E. 대장균 다음 실험 단계가 포함되어 있습니다. 각 단계는 사용하는 치료 천연 제품을 생산 동기 부여, 잠재적 인, 그리고 도전의 맥락에서 설명 될 것이다 E. 대장균 대리 호스트로.

초록

복잡한 자연 제품의 heterologous 생산은 현재 한계와 미래의 가능성을 해결하기위한 방법이다. 이 치료 가치를 가지고 있지만 충분히 생산 또는 생산의 개선 양식에서 도움이 될 수 없습니다 그 화합물에 특히 유용합니다. 2) heterologous reconstitution, 그리고 3) 제품 분석 1) 유전자 송금 : 관련 실험 절차는 세 가지 구성 요소로 세분화 할 수 있습니다. 각 실험 요소는 도전을 극복하고이 새로운 접근 방식과 관련된 기회를 예상 할 수 지속적인 최적화 아래에 있습니다.

Heterologous 생합성는 귀중한 자연 제품에 대한 책임 유전자 시퀀스의 식별로 시작합니다. heterologous 호스트에이 시퀀스를 전송하는 것은 제품의 형성에 대한 책임 biosynthetic 경로의 복잡성에 의해 복잡합니다. 항생제 에리스로 마이신은 좋은 예입니다. 스물 유전자 ()> 50킬로바이트 총은 결국 생합성 필요합니다. 또한,이 유전자의 세 크기는 megasynthases, 멀티 도메인 효소 각 ~ 300 kDa을 인코딩합니다. 이 유전 물질을 설계 및 E.로 이동해야합니다 재구성 생합성에 대한 대장균. PCR 절연, 오페론 건설, 멀티 cystronic plasmids 및 전기 변환의 사용은 에리스로 마이신에게 E.에 대한 유전자 클러스터를 전송하게 설명 될 것이다 대장균.

일단 양도, E. 대장균 세포는 결국 생합성을 지원해야합니다. 이 과정은 또한 E. 사이의 상당한 차이를 주어 도전합니다 대장균과 복잡한 자연 제품의 형성에 대한 책임 대부분의 원본 호스트. 세포는 생합성을 지원하기 위해 필요한 기판을 제공하고 coordinately 활성 효소를 생성하기 위해 전송 유전자 클러스터를 표현해야합니다. 에리스로 마이신 A, E.의 경우 대장균 세포는 두 전구체을 (PR 제공 할 수 있도록 설계해야했습니다opionyl-COA 및 (2S) - methylmalonyl-COA)은 생합성에 필요합니다. 또한, 유전자 시퀀스 수정, 플라스미드 복사 번호, chaperonin 공동 표현, 사후 병진 효소 수정, 및 프로세스 온도는 최종 에리스로 마이신에게 형성 할 수 있도록해야했다.

마지막으로, 성공적인 생산은 평가해야합니다. 에리스로 마이신 경우를 들어, 우리는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째는 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (LC-MS)가 생산을 확인하고 정량화하는 것입니다. 에리스로 마이신의 bioactivity는 또한 항생제 활동이 세균의 subtilis에 대한 테스트되는 bioassay의 사용을 통해 확인합니다. E.에서 에리스로 마이신을 설정 평가 assays는 생합성 생산을 향상 다양 화하는 미래의 엔지니어링 노력이 접근 방식을 사용하여 새 복잡한 자연 화합물의 생산을위한 무대를 대장균 등을 설정합니다.

서문

에리스로 마이신은 그람 양성 토양 세균 Saccharopolyspora erythraea에 의해 생산 polyketide 항생제이며, 현재의 생산은 점차적으로 전통적인 mutagenesis 및 검사 프로토콜의 수십 년을 통해 그리고 더 최근의 프로세스 최적화를 구성 1-6으로 ~ 10g / L로 향상되었습니다. Mutagenesis 및 심사 전략은 배양 및 / 어려움의 결과로 또는 유전자 원시 생산 호스트를 조작하고 있기 때문에 즉시 사용할 수 항생제 활동이나 선택을 돕기위한 개선 된 성장 phenotypes의 항생제 천연 제품 개발에 일반적입니다. 에리스로 마이신 A, S.의 경우 erythraea의 생산과 새로운 파생 상품의 생합성에 빠른 개선을 hampering, 따라서 속도가 느린 성장 프로필과 더 직접적인 유전자 조작 기술의 부족 (대장균과 같은 미생물에 비해)에 의해 제한됩니다. 생산 문제를 인식하고 diversificati을 해제 갖는에리스로 마이신과 같은 화합물과 가능성에 연구 커뮤니티는 heterologous 생합성 (그림 1) 7의 아이디어를 추구하기 시작했다. 이러한 노력은 에리스로 마이신 유전자 클러스터 8-11에 사용할 수 시퀀스 정보를 동시에. 그것은 인코딩 의약 잠재력을 액세스 할 수 heterologous 생합성의 지속적인 노력이 원동력을 제공 순서가 복잡한 자연 제품 유전자 클러스터의 수가 크게 12-16을 확장했다 점을 강조해야합니다. 이렇게하려면 heterologous reconstitution는 새로운 호스트가 특정 biosynthetic 경로의 요구를 충족해야합니다. E.는 대장균은 기술의 편의를 분자 생물학 기술의 폭에 걸친 세트 및 제품 개발을위한 신진 대사 및 프로세스 엔지니어링 전략을 제공합니다. 그러나, 기본 생산 호스트, E.에 비해 대장균은 복잡한 자연 제품 생산의 동일한 수준을 전시하지 않습니다. 따라서 알려지지 않았다 E 여부. 대장균은 복잡한 자연 제품 생합성을위한 가능한 heterologous 옵션으로 제공 수 있습니다. 그러나, 가정이라고 E. heterologous 생합성을 수행 할 수 있다면 대장균은 이상적인 숙주 것입니다.

염두에두고이 목표로 초기 노력은 6 deoxyerythronolide B (6dEB) E. 통해 polyketide aglycone을 생산하기 시작 대장균. 그러나, 기본 E. 대장균의 신진 대사는 propionyl-COA의 감지 수준을 제공 할 수 없습니다 및 (2S) - methylmalonyl-COA의 전구체는 6dEB 생합성을 지원하기 위해하거나 새로운 호스트가 후 translationally deoxyerythronolide B의 synthase (DEBS) 효소를 수정할 수 있습니다 필요했습니다. 이러한 문제를 해결하려면 기본 및 heterologous 효소로 구성된 대사 경로는 E.에 내장 된 exogenously 자란 프로 피오 네이트는 (2S) - methylmalonyl-COA 후 propionyl-COA에 intracellularly 변환되었다는 등 대장균,이 경로를 완료 할 수있는 엔지니어링 동안은 SFP 유전자는 일에 배치되었습니다E.의 전자 염색체 새로운 변종을 생산하는 대장균 BL21 (DE3)는 BAP1를 칭했다. SFP 효소는 DEBS 효소 17,18에 4'-phosphopantetheine cofactor을 첨부 phosphopantetheinyl transferase 할 수 있습니다. 세 DEBS 유전자는 (각 ~ 10 KB) 후 inducible T7의 추구를 포함하는이 별도로 선택 표현 벡터에 배치되었습니다. 포스트 유도 온도 (22 ° C까지)의 주요 조정 후, DEBS 유전자는 coordinately 6dEB 19 생성 할 수 활성 상태로 BAP1 내에서 표현되었다.

전체 에리스로 마이신을 추구하는 생합성 후 Micromonospora megalomicea에서 유사한 유전자 클러스터 나 S.의 유전자로 구성된 하이브리드 경로를 사용하기 시작 erythraea, S. fradiae, 그리고 S. 각각 중간체 에리스로 마이신 C, 6-deoxyerythromycin D, 20-22을 생산 venezuelae. 최근 우리 그룹은 erythrom을 생산하여 이러한 노력을 연장했습니다E. 통해 ycin A (에리스로 마이신의 가장 임상 적으로 관련성이 높은 양식) 대장균. 이전 작품에 대조적으로, 우리의 전략은 coordinately 20 원래 S.을 표현 erythraea 유전자는 polyketide 생합성, deoxysugar 생합성 및 첨부 파일 추가 조정하고, 자기 저항 (그림 2)에 필요한. 총 26 (기본 및 heterologous) 유전자는 E. 할 수 있도록 설계되었습니다 4 MG / L 23,24에서 에리스로 마이신을 생산하는 대장균. 이 결과는 E.를 사용하여 복잡한 polyketide 천연 제품의 전체 생산을 설립 대장균 및 활용이 새로운 생산 옵션을하거나 새를 추구에 기초 역할을합니다.

프로토콜

아래의 텍스트는 에리스로 마이신 항생제에 대한 구체적인이지만, 단계 heterologous 생합성 후보와 같은 다른 천연 제품에 일반적으로 적용 할 수 있도록 설계되어 있습니다.

1. 에리스로 마이신 유전자 클러스터 전송

  1. 디자인 PCR의 프리 머의 S. 내의 에리스로 마이신 클러스터와 관련된 유전자를 모두 증폭하는 erythraea의 염색체. 이 단계는 해당 유전자 시퀀스를 결정 않은 천연 제품 후보에 따라 달라집니다. 또한, 필요한 유전자는 새로 합성 유전자의 새 E. 내에서 최적의 코돈 사용을 위해 설계 될 것이라고 장점과 (여러 상용 공급 업체 옵션을 통해) 합성 할 수 있습니다 대장균 호스트. DNA 합성을 추구하는 경우, 현재 도전의 길이 10킬로바이트를 초과 할 수 있습니다 megasynthase 유전자를 생성합니다. 기술적으로 합성이 달성하지만, 도전과 비용이 많이 드는 것입니다 할 수 있습니다. 그것은 예상되는 지속적인 improvem유전자 합성 기술의 행군 현재 단점을 해결하고 더 heterologous 유전 물질을 제공하기 위해이 방법을 확인합니다.
  2. 신선하게 조리 된 S.를 사용하여 PCR을 수행 템플릿으로 erythraea 게놈 DNA. 염색체 DNA는 S.의 문화에서 준비 할 수 있습니다 erythraea 또는 세균의 냉동 주식 (그림 3) 25. PCR 반응은 대상에서 높은 G+ C 콘텐츠에 대한 계정에 DMSO의 추가 (50 μl 반응 4 μl)에서 혜택을받을 수 있습니다 S. erythraea 유전자. 각각의 증폭 유전자는 전체 유전자가 검색되었다는되며 변이가 PCR 과정에서 도입되지 않았습니다 확인 순서가되어야합니다.
  3. 제한 다이제스트와 결합을 통해, E.위한 표현 벡터에 격리 된 유전자의 각을 삽입 대장균 (그림 3). 이것은 적절한 예에 소화와 결합 할 수 있도록 PCR의 프리 머 내에서 제한 사이트를 설계에 의해 시작된다pression 벡터 (예를 그림 3에 포함되어 있습니다). 우리는 pET21와 pET28 벡터를 모두 사용했습니다. pET28 벡터는 에리스로 마이신 경우에 유전자 표현을 도와 왔으며 5 '리더 시퀀스를 포함 할 수 있습니다. RT-PCR, SDS-PAGE 분석 (수용성 단백질 분수를 사용하여), 또는 편리한 phenotypic assays (그림 4)를 통해 개별 유전자 발현을 확인합니다.
  4. 성공적으로 개별 식 plasmids (그림 3)에서 표시 유전자를 기반으로 operons를 구성합니다. 우리는 전통적으로 순차적으로 operons에 유전자를 변환 호환 - 응집 제한 효소 (예 : Xba I 및 SPE I 등) (24)의 조합을 사용했습니다하지만, 오페론 건설을 위해 선택한 제한 사이트 내에 거주하지 않아야합니다 (또는에서 제거해야합니다)를 격리 유전자 시퀀스 (유전자 합성을 사용하는 경우 피할 수있는 문제). 이 단계는 E. 이전 20 에리스로 마이신에게 유전자를 통합 대장균 transformation. 현재, 우리는 표준 애완 동물 벡터 (~ 10킬로바이트의 두 유전자 각각)에 외국인 DNA의 20킬로바이트까지 포함하는이 방법을 사용했습니다. 또한, 아홉 유전자를 포함하는 operons을 생성하기 위해이 방법을 사용했습니다. 그러나, 위의 인용 통계 에리스로 마이신의 biosynthetic 경로와 같은 복잡한 시스템에 대한 참조를 제공, 그것은 정확히 얼마나 많은 DNA 또는 얼마나 많은 유전자 애완 동물 유형 plasmids에 통합 할 수 있습니다 알 수 있습니다. 마지막으로, 표준은 체외 결합 단계와 후속 성공적으로 변환 단계에서 오페론와 플라스미드 크기가 증가할수록 점점 더 어려워집니다. 결합 온도 (12-22 ° C)와 시간 (3-24 시간) 다양한 있으며, 전자 변환은 최종 플라스미드 구조를 생산하는 과정을 지원하기 위해 사용됩니다.
  5. E.로 새롭게 디자인 된 biosynthetic의 plasmids를 변환 대장균은 전기 변환 (그림 5)를 사용하여 BAP1 변형. 절차는 plasmids과 함께 시도 할 수 있습니다하는 중 순차적으로 또는 공동으로 도입mbination. 크기 수 또는 다수의 plasmids 변환 할 때, 우리는 전통적으로 전기 변환을합니다 (화학 변환에 반대)를 사용하고 있습니다. 일단 변환, 판 테트라 사이클린 (5 밀리그램 / 리터), carbenicillin (100 MG / L), kanamycin (50 MG / L), 스트렙토 마이신 (50 MG / L) 및 apramycin를 (포함 고체 LB 매체에 세포가 50 밀리그램 / 리터 ) 플라스미드 유지 보수를 위해 선택합니다. 그것은 E. 6 가지 선택 항생제가 후 변환을 사용하는 매우 특이한 대장균 세포,이 단순히 최종 에리스로 마이신에게 생합성을 허용하는 데 필요한 plasmids의 총 수를 반영합니다. 수 있지만 배양 (아래 참조)를 시작하면, 방법은 화합물의 생산 기능을 제한합니다.

2. E. 대장균의 Biosynthetic의 Reconstitution

  1. 스트레인 BAP1는 생합성에 필요한 기판를 제공하고 게시 - translationally deoxyerythronolide B의 megasynthase를 수정하도록 설계되었습니다. eryt의 개별 유전자hromycin이 경로는 유전자 발현에 대한 테스트 및 표현 plasmids에 operons로 통합되었습니다. 이 섹션은 전체 에리스로 마이신 경로의 공동 활동에 대해 테스트 할 문화 조건에 최선을 다하고 있습니다.
  2. 갓 변형 BAP1 3 별도의 식민지를 가지고 필요한 플라스미드 선택 항생제를 (같은 농도에서 고체 매체에 transformants에 대한 선택 위에 표시)가 포함 된 1.5 ML의 LB 문화, 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG 예방, 100 μM을 유전자 발현 및 세포 biosynthetic 전구체 형성을 지원하기 위해 프로 피오 네이트 20 MM 나트륨을 유도하기 위해)와 arabinose (2 밀리그램 / ML). 생산이 확정되면 더 큰 문화는 제품 titers을 확장하고 극대화하기 위해 실시 될 수 있습니다.
  3. 22 문화 세포를 ° C 및 24-48 시간 250 RPM. 이 경우 항생제 선택이 필요한 plasmids은 세포 문화의 초기 단계에서 유지됩니다 보장합니다. 그러나, 플라스미드선택 항생제 수준이 배양 기간의 과정 변화로 s이 (가) 쉽게 손실 될 수 있습니다. 이 후 생산 능력을 제한 것 플라스미드 불안정 (즉, 문화 중 하나 이상의 plasmids의 손실)이 발생할 수 있습니다. 호환되지 않는 plasmids은 전​​체 heterologous 유전자 클러스터를 소개하는 데 사용되는 경우 문제가 악화됩니다. 이러한은 에리스로 마이신 화합물 (그림 5)의 경우이며, 진정한 E.의 화합물을 과잉 생산하다 할 수 해결 될해야 대장균. 그러나, 초기 생산을 시연하기위한 목적으로 이러한 설계 결함이 신속하게 heterologous 접근의 가능성을 확립을 위해서 용납 있습니다.
  4. Eppendorf microfuge 10,000 rpm으로 원심 분리하여 문화를 명확히하십시오. 분석을 위해 4에 표면에 뜨는 및 매장 ° C를 제거합니다.
  5. 에리스로 마이신 A, 화합물 생산의 부족의 경우 pGro7를 사용하여 GroES / EL chaperonin (를 포함하여 해결했습니다특히 효소의 포스트 표현 활동의 부족)와 추가 유전자 사본 (약한 표현 / 활동 혐의를 해당 유전자의 경우)의 포함을 해결합니다. 비슷한 전략은 다른 heterologous 천연 제품 생산 노력이 필요 할 수 있습니다.

3. 제품 분석

  1. 형성을 확인하고 에리스로 마이신을 수량화하기 위해 LC-MS 시스템 (그림 6)에 문화 표면에 뜨는를 삽입. 상업적으로 이용 가능한 에리스로 마이신은이 생산을 확인하고 정량화하는 동안 표준으로 사용되었다. 상업적으로 이용 가능한 표준이없는 경우는, LC-MS 분석은 NMR 및 고해상도 질량 분광법에 의한 추가 화학 특성을 필요로합니다.
  2. BAP1 변환에서 3 식민지 / 문화 사이의 생산을 비교합니다. 최고의 제작자를 선택하고 식민지 소스에서 글리세롤 주식을 준비합니다. 이 단계는 프로토콜과의 생산 문화와 병렬로 수행 할 수 있습니다글리세롤 주식을 준비하는 문화의 작은 부분을 사용하여 2. -80 ° C 냉동고에 글리세롤 주식을 저장합니다.
  3. 확인, 높은 생산 세포 재고 사용하여 별도의 생산 문화를 시작하고 초산 에틸 배 볼륨으로 최종 표면에 뜨는 압축을 풉니 다. 추출물을 건조, 100 μl 메탄올에 resuspend하는 진공 증발 시스템을 사용합니다. 살균 필터 디스크 (~ 1 / 4 인치 직경)에 추출물을 전송하고 디스크가 건조 할 수 있습니다. 이와는 별도로, 문화, B. 박 LB 액체의 subtillis. B. 20 μl를 추가합니다 45 액체 LB 한천의 20 ML에 subtilis 문화 ° C. 플레이트 한천과 더욱 강화 할 수 있습니다. 37 ° C (그림 7)에서 플레이트와 배양에 필터 디스크를 넣으십시오. 또는 추출물은 플레이트 리더 (그림 7)를 사용하여 활동을 수량화하기 위해 96 - 웰 플레이트에서 액체의 문화에 추가 할 수 있습니다.

결과

이 방법의 원하는 결과는 E.에서 완전히 bioactive 천연 제품의 생산입니다 호스트 heterologous 대장균. 이것은 가장 생산 (그림 6)과 (그림 7) 최종 작업을 확인하는 데 사용되는 항균 bioassay을 확인하고 정량화하는 데 사용되는 LC-MS 결과로 표시됩니다. heterologous 생합성의 전체 구조에서이 결과는 성공을 정의합니다. 일단 달성, 연구 노력은 다음 최적화 (모두 휴대 전화 및 공?...

토론

2) biosynthetic의 reconstitution; 3) 제품 분석 1) 유전자 전달 : heterologous 생합성에서 중요한 단계는 과정에서 세 절차 점의 각에 발생합니다. 어떤 단계에서 문제가 heterologous 생합성을 설립의 궁극적 인 목표를 탈선 것입니다. 이것은 절대적으로 성공적인 분석을 허용하는 데 필요한 있기 때문에 아마도 프로세스의 가장 어려운 부분은 재구성 생합성을 수립하고 있습니다. 그러나, reconstitution는 결국 생?...

공개

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 말

저자는 heterologous 생합성에 전념 프로젝트를 지원하는 자금에 대한 NIH (AI074224 및 GM085323)와 NSF합니다 (0712019 및 0924699) 감사합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트 (선택 사항)
PCR 기계 Eppendorf Mastercycler 개인
디메틸 sulfoxide (DMSO) 어부 BP231
Electroporator BioRad Micropulser
IPTG 어부 BP1620
나트륨 프로 피오 네이트 시그마 P1880
L-arabinose 시그마 A3256
냉장 쉐이커 열 과학 MaxQ 4000
Microfuge Eppendorf 5415D를 원심 분리기
pGro7 다카라 자야 플라스미드 세트 (3340)
pET21, pET28, pCDF - 듀엣-1 EMD 화학 물질 69742-3, 69864, 71340
LC-MS 응용 Biosystems 3200 Q-함정
에틸 아세테이트 시그마 270989
메타놀 시그마 322415
진공 원심 분리기 Eppendorf 농축기 5301
로터리 증발기 Buchi R-200

참고문헌

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