Préparation des cellules acineuses pancréatiques à des fins d'imagerie calcique, mesures de blessures cellulaires, et les infections à adénovirus

Résumé

Nous décrivons une méthode reproductible de préparation de cellules acineuses pancréatiques de souris à partir d'une souris dans le but d'examiner les signaux calciques des cellules acineuses et des lésions cellulaires avec physiologiquement et pathologiquement stimuli pertinents. Une méthode d'infection par adénovirus de ces cellules est également fournie.

Résumé

Les cellules acineuses du pancréas est la principale cellule parenchymateuse du pancréas exocrine et joue un rôle primordial dans la sécrétion d'enzymes pancréatiques dans le canal pancréatique. Il est également le site pour l'initiation d'une pancréatite. Nous décrivons ici comment les cellules acineuses sont isolés de signaux intracellulaires de calcium tout le tissu du pancréas et sont mesurées. En outre, nous décrivons les techniques de transfection de ces cellules avec des constructions adénoviraux, et mesurer ensuite la fuite de lactate déshydrogénase, un marqueur de lésion des cellules, dans des conditions qui induisent des lésions des cellules acineuses in vitro. Ces techniques constituent un outil puissant pour caractériser la physiologie des cellules acineuses et la pathologie.

Introduction

Changements dynamiques de calcium cytosolique sont nécessaires pour les événements de cellules acineuses la fois physiologiques et pathologiques. Ces effets divergents de calcium sont censés résulter de configurations spatiales et temporelles distinctes de la signalisation calcique ^1. Par exemple, une enzyme et la sécrétion d'un fluide à partir de la cellule des cellules acineuses sont liés à des pics de calcium à partir d'une région limitée du pôle apical où la sécrétion a lieu ^2. En revanche, une vague de calcium global, suivi par des signaux calciques non oscillatoires intense est associé à des événements pathologiques précoces qui conduisent à une pancréatite aiguë ^3,4. Il s'agit notamment de l'activation intra-acinaire protéase, la sécrétion de l'enzyme réduite, et la lésion des cellules acineuses. Notre laboratoire utilise isolé acini pancréatiques pour étudier ces événements pathologiques précoces qui conduisent à la maladie à la fois in vivo et in vitro ^5-7. Les méthodes décrites ci-dessous décrivent l'isolement des cellules acineuses primaires dans le but de mesurer cyles niveaux de calcium tosolic et lésions cellulaires. Une méthode d'infection par adénovirus de ces cellules est également fournie.

Protocole

1. Préparer les cellules acineuses pancréatiques pour l'imagerie calcique

1. Préparer le tampon d'incubation HEPES contenant HEPES 20 mM, NaCl 95 mM, 4,7 mM de KCl, 0,6 mM _MgCl2, 1,3 mM _CaCl2, 10 mM de glucose, glutamine 2 mM, et 1 × acides aminés non essentiels moyen de minimum aigle. Ajustez la solution finale à pH 7,4 avec NaOH.
2. Préparation d'un tampon d'incubation par addition de BSA (BSA 1% p / v final) à 25 ml du tampon d'incubation HEPES (décrit plus haut).
3. Préparation d'un tampon de digestion à la collagénase en ajoutant 1,1 mg / ml (200 unités / ml) de type 4 de la collagénase et de 1 mg / inhibiteur de trypsine de soja ml à 6 ml de tampon d'incubation BSA (décrit plus haut).
4. Acid-wash mm lamelles 22x22 par immersion en deux parties HNO ₃ et une partie HCl pendant 2 h. Puis décanter avec de l'eau DI et de stocker dans l'éthanol à 70%.
5. Euthanasier une souris par asphyxie au _CO2. Orient l'animal en décubitus dorsal, et préparer la surface abdominale par cleAning avec de l'éthanol à 70%. Effectuez une laparotomie pour exposer la cavité abdominale. Disséquer le pancréas et rincer immédiatement dans un petit bateau peser contenant 6 ml de tampon de digestion par la collagénase.
6. Disséquer les gros morceaux de vaisseaux sanguins gras ou visible, puis retirez 5 ml de tampon de digestion à la collagénase et ajoutez-le au tube conique de 15 ml.
7. Avec des ciseaux de dissection fines mâche le pancréas dans le bateau pesant petit contenant 1 ml de tampon de digestion par la collagénase. Hachez jusqu'à ce que la solution résultante apparaît dispersée uniformément.
8. Transférer le produit hachée dans un flacon en plastique 125 Erlenmeyer, puis ajoutez le reste de 5 ml de tampon de digestion par la collagénase dans le récipient. Assurez-vous que le tissu est entièrement immergé dans un tampon.
9. Placer la fiole dans un bain ° C de l'eau 37 et serrer à 90 tours par minute pendant 30 minutes. Pendant ce court laps de temps d'arrêt, préparer des agonistes d'activation de calcium (par exemple caeruléine, carbachol) et rincer le couvercle 22x22 mm lavé à l'acideglissades d'eau DI. Sec, puis placer au-dessus d'une surface plane bordée par le film laboratoire.
10. Après les 30 min digest est terminée, transférer la suspension arrière au tube conique de 15 ml et de permettre aux cellules de se déposer. Pipette délicatement le tampon de digestion à la collagénase et la remplacer par 6 ml de tampon d'incubation BSA. Agiter vigoureusement le tube la main pendant 10 s, afin de disperser les cellules dans des secteurs plus restreints. Immédiatement après la secousse, enlever toute grande, débris flottants dans les médias en suspens.
11. Laisser les cellules restantes de s'installer, et d'échanger des médias avec un tampon d'incubation BSA frais.
12. Répétez l'étape 1.11 deux fois, jusqu'à ce que la suspension est composée de seulement de petits groupes qui ne sont finement visible à l'œil nu. Les cellules doivent ressembler à celles représentées sur la figure 1A (rangée du haut).
13. Retirez le tampon d'incubation BSA et le remplacer par un tampon d'incubation HEPES.
14. Préparer un 750 uM, stock 100X de Fluo-quatre heures dans 10% DMSO.
15. Charger les cellules dans le tube conique de 15 ml contenant de la suspension cellulaire et du tampon d'incubation exempt de HEPES BSA. Pour ce faire, ajoutez un volume approprié (1:100 dilution) de la solution mère de la suspension cellulaire. Puis la plaque 500 pi de cette suspension sur chaque lamelle 22x22 mm.
16. Gardez lamelles dans l'obscurité, à température ambiante. Prenez la première Ca ^{2 +} mesures 30 min après le chargement. Le colorant est automatiquement éliminé du milieu lors du démarrage de la perfusion, ce qui devrait avoir lieu 30 minutes après le chargement colorant.

2. Mesure de calcium dans les cellules acineuses pancréatiques

1. Rincez chaque perfusion set-up avec de l'eau DI et remplir avec une quantité appropriée de tampon ou un agoniste. Premier chaque seringue avec un tampon ou un agoniste d'assurer un débit correct. Pince seringues à un anneau reposer environ 1-2 mètres au-dessus de la platine du microscope.
2. Utilisez des pinces fines pour saisir soigneusement de sa une suspension de cellules contenant de lamelle de bord. Inclinez le couvercleglisser 45 °, et permettre à l'excès de tampon de s'écouler. Placer la lamelle couvre-objet sur ​​le dessus du joint en caoutchouc avec les cellules au-dessus de la lamelle couvre-objet, et à assembler la chambre (figures 2A et 2B).
3. Fixer la chambre d'irrigation à la scène et insérer le tube qui contient du tampon dans la première entrée de la chambre (figure 2C). Tourner la seringue contenant le tampon et de permettre à la mémoire tampon pour perfuser sur toute la surface de la lamelle. Une fois que le tampon a atteint l'extrémité opposée de la chambre, insérer une ligne de vide dans l'entrée d'aspiration. Insérez les autres tubes (contenant des agonistes, inhibiteurs, etc) dans leur position appropriée le long de la chambre.
4. Visualiser les cellules en utilisant soit une, 1,4 objectif d'ouverture numérique 200X ou 400X et un laser à argon à exciter le colorant Fluo-quatre heures à une longueur d'onde de 488 nm (figure 1A, en bas). Les réglages de puissance du laser doit être ajustée de telle sorte que le tube photomultiplicateur (PMT) N'est pas saturé par la lumière émise. En outre, la tension aux bornes de la PMT doit être optimisée pour la détection de lumière maximale.
5. Des signaux d'émission passe-long de> 515 nm sont collectées en utilisant une vitesse de trame de 2-5 sec / trame pour visualiser les modèles d'oscillation lente et de 0,2 à 0,3 sec / trame pour visualiser plus rapide, les ondes de calcium globaux (figures 3 et 4).
6. Après l'exposition est terminée, fermez les seringues et retirer tous les tubes. Démontez la chambre et répétez les étapes 2.2-2.4.
7. Recueillir des données sous forme de valeurs numériques d'intensité de fluorescence au cours du temps et le transfert à l'image J (logiciel fourni sous forme de freeware par le National Institutes of Health et peut être trouvé à http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
8. Voir les images cellulaires en temps réel et d'identifier les régions d'intérêt (ROI, c'est-apicale, basolateral, nucléaire, etc)
9. Acquérir des intensités de fluorescence pour ces régions d'intérêt et represent comme intensité de fluorescence / base intensité de fluorescence (ie f/f0).
10. Générer des tracés en traçant F / F ₀ vs temps. En plus des tracés, des images représentatives sont généralement fournies et affichées à l'aide pseudocouleur.

3. Préparation des cellules acineuses pancréatiques pour les dosages des blessures cellulaires

1. Chaudes DMEM F-12 médias (sans rouge de phénol) à 37 ° C.
2. Ajouter BSA (0,1% v / v final), et de l'HCl (50 pM final) aux DMEM F-12 médias.
3. Aliquote de 50 ml de milieu DMEM dans un tube conique.
4. Préparer un tampon de collagénase par addition de 0,5 mg / ml (12 U / ml) de la collagénase de type IV de 10 ml de DMEM supplémenté F-12 médias.
5. Euthanasier une souris par asphyxie au _CO2. Orient l'animal en décubitus dorsal, et préparer la surface abdominale par un nettoyage à l'éthanol à 70%. Effectuez une laparotomie pour exposer la cavité abdominale. Disséquer le pancréas et rincer immédiatement dans un petit bateau pesant contenant 6 ml de tampon de collagénase.
6. Hachez le tissu avec des ciseaux de dissection fines pendant 3-5 min ou jusqu'à ce que la solution résultante apparaît dispersée uniformément.
7. Transférer le tissu haché dans une fiole Erlenmeyer 125 avec 5 ml de tampon de collagénase supplémentaire, puis le placer dans un 37 ° C au bain d'eau sous agitation à 90 rpm pendant 5 min.
8. Retirer du shaker, permettent aux cellules de s'installer brièvement, et d'échanger avec 5 ml de tampon de collagénase frais. Puis incuber pendant une 35 min supplémentaires à 37 ° C au bain d'eau sous agitation à 90 rpm.
9. Vigoureusement remettre le digest aide d'une pipette de transfert jusqu'à la suspension apparaît homogène sans grumeaux cellulaires évidentes. Puis ajouter doucement la suspension de cellules à travers un tamis de nylon de mouillage préalable dans un Erlenmeyer.
10. Vigoureusement pipette une supplémentaire de 3 ml de DMEM frais F-12 médias (avec de la collagénase) à travers les mailles, afin de forcer à travers toutes les cellules restantes.
11. Ajouter un autre 6-10 ml de DMEM F-12 des médias et uneermettez les cellules se contenter de 2-3 min. Répétez cette étape deux fois, et retirer le surnageant après le lavage final.
12. Ajouter DMEM frais F-12 médias, remettre en suspension les cellules, et la plaque 500 pl de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 48 puits. Les cellules doivent ressembler à celles représentées sur la figure 1B.
13. Laisser la plaque de s'asseoir dans ° C au bain-marie à 37 à 90 tours par minute pendant 5 min avant d'ajouter agonistes.
14. Stimuler les cellules avec des agonistes variant de 2-4 heures.
15. Inclinez la plaque à un angle pour permettre aux cellules de se déposer et la pipette avec précaution une partie aliquote de médias (généralement 100 pi) et de gel rapide dans l'azote liquide.
16. Un gel de la suspension cellulaire restant. Congélation Flash n'est pas indispensable pour les mesures LDH. Comme alternative échantillons peuvent être conservés dans la glace si elles seront analysés le même jour ou stockés dans des -20 ° C pour le stockage à long terme.

4. Mesure de l'étanchéité de la lactate déshydrogénase

1. Mesure lactate déshydrogénase (LDH) fuite principalement en utilisant les réactifs et les instructions fournis dans le kit CytoTox 96 de test de cytotoxicité non radioactif Promega (voir le tableau des réactifs et matériels spécifiques).
2. Reconstituer le substrat LDH (qui est fourni dans le kit) avec 12 ml de tampon d'essai (également fourni).
3. Dégeler suspension de cellules congelées échantillons de milieu dans un bain d'eau à température ambiante.
4. Plate 50 ul de chaque échantillon médias dans une plaque de 96 puits.
5. Pour la suspension de cellules, ajouter le volume nécessaire de tampon de lyse 10X de telle sorte que la concentration finale est 1X. Vortex brièvement et incuber à 37 ° C pendant 60 min.
6. Centrifuger les échantillons lysées à 250 g pendant 4 min à débris culot cellulaire.
7. Pour lysats cellulaires, plaque 50 pi d'une dilution 1:10 dans chaque puits d'une plaque à 96 puits.
8. Ajouter 50 ul de substrat reconstitué dans chaque puits, incuber la plaque dans l'obscurité à la température ambiante pendant 30 min.
9. Arrêter la réaction enajoutant 50 pl de la solution d'arrêt (fourni dans le kit) dans chaque puits.
10. Mesurer l'absorbance à 490 nm.
11. Utilisez la formule suivante pour calculer% LDH fuite. Les densités optiques suivantes sont corrigées en soustrayant une lecture OD vide à partir d'un puits contenant uniquement PBS, le substrat et la solution d'arrêt.

LDH dans les médias = (Media OD492) x (facteur de dilution médias) x (vol. des médias) * Comme il n'est généralement pas nécessaire de diluer les échantillons des médias, le facteur de dilution sera le plus souvent Equal1.

LDH totale = ((lysat OD ₄₉₀₎ x (facteur de dilution lysat) x (vol. en suspension de cellules)) + ((Media OD ₄₉₀₎ x (facteur de dilution) x (vol. des médias aliquotés pour l'échantillonnage))

5. Infecter les cellules acineuses pancréatiques avec un adénovirus

1. Préparercellules acineuses pancréatiques telles que décrites dans la section 3.
2. Après l'étape 3.12, ajouter 10 ⁷ unités infectieuses (IFU) d'adénovirus à la suspension de cellules et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
3. Uniformément plaque 2 ml de suspension cellulaire dans une plaque à 6 puits.
4. Pour la plupart des constructions d'expression, les cellules doivent être suffisamment infectés dans les 18 heures, et pour certaines constructions luciférase, juste au sein de 6 heures.

Résultats

Un exemple de mesures de calcium des cellules acineuses en réponse à des stimuli physiologiques est fourni à la figure 3. cellules acineuses ont été chargés avec le calcium colorant Fluo-4 et perfusé avec l'acétylcholine, un analogue carbachol (CCH; 1 M)) ^8. Les cellules ont réagi, sous la forme d'une onde de calcium qui déclenche dans la région apicale et se propage dans la région basolatérale ^3,9. tracés représentatifs illustré à la figure 3B

Discussion

La méthode d'isolement cellulaire et des essais ultérieurs décrits ici sont des outils puissants pour étudier les caractéristiques physiologiques et physiopathologiques du pancréas exocrine. La méthode pour isoler des cellules acineuses dispersées a été décrite par Amsterdam et Jamieson en 1972 ^11. Les méthodes présentées ici ont été adaptés à partir de méthodes d'isolement plus récents décrits par Van Acker et ses collègues ^12. Bien que ces techniques sont hautement r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalogue Number	Comments
Mice	NCI	N/A	Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
Sodium Chloride	J.T. Baker	3624-05
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Magnesium Chloride	Sigma	M-8266
Calcium Chloride	Fischer	C79
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamine	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture	Gibco	11140-050
Sodium Hydroxide	EM	SX0593
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	4188
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T-9003
Carbon Dioxide	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Erlenmeyer plastic flask	Crystalgen	26-0005
Dissection kit	Fine Science Tools	14161-10
70% Ethanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipettes	Gilson	FA10005P
Weighing boat	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastic transfer pipettes	USA Scientific	1020-2500
15 ml conical tubes	BD Falcon	352095
50 ml conical tubes	BD Falcon	352070
1.5 ml micro-centrifuge tube	Fisher	05-408-129
0.65 ml micro-centrifuge tube	VWR	20170-293
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher	032811-9
Nitric Acid	Fischer	A483-212
Hydrochloric Acid	Fischer	A142-212
Deionized water	N/A	N/A
18 x 18 mm coverslips	Fischer	021510-9
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimethylsulfoxide	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
60 ml syringe	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ gauge needle	BD Bioscience	9328270
PE50 tubing	Clay Adam	PE50-427411
Flat head screwdriver	N/A	N/A
DMEM F-12, no Phenol Red	Gibco	21041-025
30.5 gauge needle	BD Bioscience	305106
5 CC syringe	BD Bioscience	309603
25 ml Erlenmeyer flask	Fischer	FB50025
Nylon mesh filter	Nitex	03-150/38	150 μm pore size
48 well tissue culture plate	Costar	3548
96 well tissue culture plate	Costar	3795
6 well tissue culture plate	Costar	3506
Liquid nitrogen	Matheson Gas	7727-37-9
Cytotoxicity assay kit	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Gift from J. Williams
			Equipment
Ring stand with clamps	United Scientific	SET462
Perifusion chamber	N/A	N/A	Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University
Vacuum line	Manostat	72-100-000
Water bath with shaker	Precision Scientific	51220076
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	11-120-534
Tissue culture hood	Nuaire	NU-425-600
Tissue culture Incubator	Thermo	3110