Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

Resumen

Biosensores fagos líticos y los granos de anticuerpos son capaces de discriminar entre resistente a la meticilina (MRSA) y la bacteria estafilococo sensibles. Los fagos se inmovilizaron mediante un método de Langmuir-Blodgett sobre una superficie de un sensor de microbalanza de cristal de cuarzo y trabajaron como amplias sondas estafilococo gama. Perlas de anticuerpos reconocen SARM.

Resumen

Un bacteriófago lítico estructuralmente transformado que tiene una amplia gama de huéspedes de cepas de Staphylococcus aureus y una proteína de unión a penicilina (PBP 2a) de anticuerpos conjugados con perlas de látex se han utilizado para crear un biosensor diseñado para la discriminación de resistente a la meticilina (SARM) y sensible a la meticilina (SASM) S . especies aureus ^1,2. Los fagos líticos se han convertido en esferoides de fagos por el contacto con la interfase agua-cloroformo. Fagos monocapas esferoide se han movido en una superficie biosensor de Langmuir-Blodgett (LB) Técnica ^3. Los biosensores creados han sido examinados por una microbalanza de cristal de cuarzo con seguimiento de disipación (QCM-D) para evaluar las interacciones bacteria-fago. Interacciones bacteria-esferoide llevaron a la reducción de la frecuencia de resonancia y un aumento de la disipación de la energía, tanto para las cepas de SARM y SASM. Después de la unión bacteriana, estos sensores han sido expuestos más al anticuerpo de proteína de unión a penicilina perla de látexs. Sensores analizados con MRSA respondieron a PBP 2a cuentas de anticuerpos, aunque sensores inspeccionados con SASM dieron ninguna respuesta. Esta distinción experimental determina una discriminación inequívoca entre resistente a la meticilina y S. sensible cepas de Staphylococcus. Igualmente consolidados y no consolidados bacteriófagos suprimen el crecimiento de bacterias en las superficies y en suspensiones de agua. Una vez que los fagos líticos se transforman en esferoides, que conservan su fuerte actividad lítica y muestran una alta capacidad de captura bacteriana. Los esferoides de fago y los fagos se pueden utilizar para la prueba y la esterilización de los microorganismos resistentes a los antibióticos. Otras aplicaciones pueden incluir el uso en la terapia de bacteriófagos y las superficies antimicrobianas.

Introducción

Cepas resistentes a la meticilina de Staphylococcus aureus se han sugerido como un factor en las infecciones esenciales y los brotes nosocomiales ^4-8. Las formas más comunes de reconocimiento de la resistencia a la meticilina, tales como la prueba de difusión en disco oxacilina agar pantalla, o de microdilución en caldo, se basan en las condiciones de cultivo a medida para mejorar la expresión de la resistencia. Las alteraciones incluyen la utilización de oxacilina, incubación a 30 o 35 ° C en lugar de 37 ° C, y la inclusión de NaCl al medio de crecimiento. Por otra parte, para la detección correcta de estos tipos de técnicas, en lugar de 16 a 18 horas se requiere un largo período de incubación de 24 h. Técnicas rápidas con nivel apropiado (> 96%) de la sensibilidad para la identificación de la resistencia a la meticilina incluyen técnicas de microdilución automatizados tales como la tarjeta Vitek GPS-SA, el sistema Rapid ATB Staph, y el sistema Rapid Panel de Microscan que producen resultados después de 3-11 hr ^9-11. El Crystal MRSA sistema de identificación es un método rápido que se basa en el reconocimiento de crecimiento de S. aureus en presencia de 2% de NaCl y 4 mg de oxacilina por litro con un sensor de fluorescencia sensible al oxígeno. Sensibilidades reclamados varían entre el 91 y el 100% después de 4 horas de incubación ^12-14. Estos métodos fenotípicos están limitados en sus exactitudes por el impacto de las cepas prevalentes que expresan resistencia heterogénea. Por lo tanto, los mejores métodos aceptados para el reconocimiento de la resistencia a la meticilina es PCR o hibridación de ADN del gen mecA ^15. Sin embargo, esta técnica requiere ADN purificado y es extremadamente sensible a varias mezclas (impurezas), que incluyen restos de células de ^16.

Además, estas técnicas necesitan mucho tiempo para llevar a cabo. Estrategias para el reconocimiento del producto del gen mecA, proteína PBP 2a, se podrían utilizar para determinar la resistencia y pueden ser más fiable en comparación con las técnicas de ensayo estándar ^17.

Se había demostrado anteriormente que bacteriófago 12600 puede ser utilizado como una sonda de reconocimiento para cepas de Staphylococcus aureus incluso los que tienen resistencia a la meticilina ^1,2,18. En este trabajo hemos propuesto una nueva técnica en el reconocimiento específico y la detección de MRSA, tales como el reconocimiento de las bacterias, junto con la conformación de MRSA en tiempo real. Para este propósito específico de una S. bacteriófago aureus con un amplio espectro de huéspedes (incluyendo cepas de SARM) en combinación con el anticuerpo monoclonal contra la proteína (PBP 2a) se han utilizado. PBP 2a es una proteína de la pared celular y que es la causa de la resistividad antibiótico de MRSA. Sin embargo anticuerpo PBP 2a no es específico para S. aureus, ya que algunas otras bacterias tienen proteínas de unión a los antibióticos con secuencia similar a PBP 2a ^19,20. En consecuencia, en este trabajo, S. bacteriófago aureus y anticuerpos contra la proteína PBP 2a se han utilizado. Para ser capaz de desarrollar un biosensor que específicamentecamente detectar e identificar MRSA un dispositivo con una acción en dos etapas se ha utilizado. El paso inicial utilizó una S. aureus monocapa bacteriófago como un sensor de la sonda, mientras que el segundo paso emplea PBP 2a anticuerpos específicos. Por lo tanto, el primer paso será reconocer S. bacteria Staphylococcus, como el otro serán sensibles a la proteína de unión a los antibióticos. Cuando las señales recibidas de los dos pasos son positivos, que indica la detección específica de MRSA.

Protocolo

1. Preparando el escenario

1. Obtener la cepa de tipo S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 y Bacillus subtilis ATCC 6051. Cepas resistentes a la meticilina de S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, 13 MRSA, MRSA 26, 34 MRSA, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; El fago lítico 12600.
2. Obtener PBP 2a anticuerpos conjugados con perlas de látex.
3. Preparar medio NZY tal como se describe ^21.
4. Obtener solución tamponada con fosfato salino (PBS).
5. Preparar agua desionizada como subfase de Langmuir-Blodgett (LB) deposición monocapa.

2. Propagación del bacteriófago y Titulación

1. Incubar 5 ml de cultivo de una noche de S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 ⁸ unidades formadoras de colonias (UFC) / ml) con 500 l de fago (3 x 10 ^{9 <}/ Sup> PFU / ml) en 500 ml de medio NZY en 2 L de Flack en un agitador-incubador a 37 ° C durante la noche.
2. Centrifugar cultivo a 4424 xg durante 10 min a 4 ° C.
3. Sobrenadante se volvió a centrifugar a 11.325 xg durante 10 min a 4 ° C.
4. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro Millipore de 0,22 micras.
5. Centrifugar el filtrado a 75.395 xg durante 1,5 horas.
6. Disolver el precipitado en 100 l de agua destilada.
7. Preparar diluciones de 10 veces de la suspensión de fagos en medio NZY.
8. Placa 1 ml de cultivo de una noche (ON) de S. aureus ATCC 12600 en cada una de 2 placas con agar NZY para asegurarse de cubrir toda la superficie. Retire el exceso de la cultura y deje que la superficie se seque durante 30 minutos.
9. Detectar una muestra (10 l) de la dilución apropiada del fago sobre la superficie de la placa y se incuba a 37 ^{° C} durante 18-24 horas.
10. Examinar la formación de placas y calcular el título de fagos. Los títulos de bacteriófagos (T) se calcula sobre la base del número de pLaques (N) formadas por 10 l de volumen (V) de suspensión de fago y el factor de dilución (F). El título se calculó por la fórmula:. T = N / (vxf) Por ejemplo, para el número de placas 75 a la dilución 10 ^-7 y el volumen de 10 l (10 x 10 ^-3 ml), el título es igual 75 / (10 x 10 x 10 ^{-3 -7)} = 7,5 x 10 ¹⁰ unidades formadoras de placa (UFP) por ml de suspensión.

3. Phage Oro-inmovilizada

1. Piezas de cuarzo recubiertos de oro Limpio (60 mm ²⁾ de grabado con plasma en atmósfera de argón durante 10 min y después se esterilizan durante 6 horas bajo luz UV en un gabinete estéril.
2. Añadir 50 microlitros de 1 x 10 ⁹ UFP / ml de suspensión de fagos a la superficie de oro de cada pieza en una placa de Petri estéril, y luego incubar durante la noche en una cámara húmeda a temperatura ambiente.
3. Retire y título de la suspensión de fago restante.
4. Lavar piezas con fago unido 5 veces con PBS para eliminar no unidofagos.

4. Las pruebas de infectividad fago inmovilizado sobre una superficie seca

1. Difundir una cultura de O / N de S. Aureus ATCC 12600 en una placa de agar NZY y dejar secar.
2. Coloque una pieza de oro con el fago inmovilizado en la placa frontal hacia abajo.
3. Observe una zona de lisis después de 12 h de incubación a 37 ° C que indica la infectividad.
4. Utilice piezas cubiertos de oro sin fagos en los experimentos de control.

5. Pruebas de actividad lítica de fagos libres y ligados en el líquido

1. Añadir una cultura ON del S. aureus ATCC 12600 a 10 ml de NZY en cada uno de cuatro matraces de 300 ml brazo lateral (6 x 10 ⁶ UFC / ml en cada matraz).
2. Añadir en dos matraces de 2 x 10 ⁶ PFU / ml de fagos libres.
3. Utilice las otras dos frascos como controles.
4. Vigilar la evolución temporal de la S. lisis celular aureus para 570 min por medición de la densidad óptica (DO ₆₀₀₎ a intervalos de 30 min para todos los matraces.
5. Tome una medición final a las 24 horas.
6. Repita los pasos 5.1 a 5.5, pero el uso de piezas de oro con fagos unidos en vez de fagos libres, y piezas de oro sin fago en frascos de control.

6. La pérdida de los fagos unidos Durante la Incubación

1. Añadir 50 l de 1 x 10 ⁹ PFU / ml de fago sobre la superficie de la pieza de oro estéril en una placa de Petri que se coloca en una cámara húmeda durante la noche a temperatura ambiente.
2. Extraiga la suspensión con el fago no unido de la superficie de oro y el título.
3. Lave la pieza de oro con fagos unidos 5 veces con PBS y colóquelos en 1 ml de solución NZY 15 ml tubo de agitador-incubador a 37 º C durante 8 horas.
4. Determinar el título del fago individual como se describe en 2.

7. Phage Spheroids Preparación

1. La combinación de 400 l de suspensión de fago 12600 (10 ¹¹ UFP / ml) con un volumen igual de cloroformo espectrofotométrico grado en 1 ml frascoa temperatura ambiente.
2. Suavemente vórtex con la suspensión de fago-cloroformo 5-6 veces (intervalos de 5 segundos) más de un minuto de duración.
3. Con la suspensión de estabilizar durante 30 segundos y luego pipeta de la fase superior que contiene esferoides se pipeta para la preparación monocapa.
4. Tómese unos microlitros de la suspensión esferoides para la transmisión y microscopía electrónica de barrido.
5. Utilizar una suspensión esferoide restante para la fabricación de biosensores.

8. Preparación biosensor

1. Limpiar sensores QCM-D por plasma grabado en argón durante 10 min PDC-32G limpiador plasma Harrick.
2. Enjuague sensor con hexano para eliminar las posibles impurezas orgánicas.
3. Preparar y limpiar un canal de la balanza película como se describe en el ^22.
4. Rellene través LB con una solución subfase y limpiarlo con una barrera a través y estabilizar el canal a 20 ± 0,1 ° C
5. Extienda 300 l alícuota de fago 12600 en Suspensiòn acuosaen (10 ¹¹ UFP / ml) en subfase LB.
6. Prepare monocapa fago sobre una solución subfase LB al permitir 300 l alícuota de fago 12600 suspensión acuosa (10 ¹¹ PFU / ml) a correr por una varilla de vidrio mojable inclinado que está parcialmente sumergido en la subfase de ^22,23.
7. Estabilizar la monocapa preparada durante 10 min, y luego comprimir a una velocidad de 30 mm / min (45 cm ² / min), hasta que una presión constante se alcanza 19 N / m.
8. Realizar una deposición de película vertical sobre posicionado perpendicular sensor de QCM-D a una velocidad de 4,5 mm / min por inmersión sucesiva sensor de dentro y fuera de la monocapa siete veces. La microscopía electrónica de depositado monocapas de fagos antes de la exposición a muestras de bacterias mostró que las capas estaban continua, homogénea y uniforme (datos no mostrados).
9. Repetir los pasos 4.5 a 4.8 con una suspensión de esferoide fago que se prepara en 3.
10. Utilice biosensores fagos fabricados por MRSA detección electrónicamicroscopía, y elipsometría.

9. Prueba biosensor, la Discriminación de la meticilina resistente y bacterias estafilococos sensibles

1. En este protocolo, se preparan biosensores con fago no modificado y modificado y esferoides de fagos. Una microbalanza de cristal de cuarzo con cuatro cámaras de flujo de sensor se utiliza para monitorizar la unión de las bacterias a los fagos inmovilizada en la superficie del sensor QCM. PBP 2a anticuerpos conjugados con perlas de látex se utilizan para discriminar entre resistente a la meticilina (SARM) y bacterias estafilococos sensibles. Todas las mediciones se llevan a cabo en el modo de flujo (50 l / min) a 5 MHz.
2. Establecer una línea de base de la frecuencia de resonancia del sensor QCM en agua (~ 30 min).
3. Dibuje una suspensión de células vivas sensibles a meticilina de estafilococos bacterianas en el agua (10 ⁹ UFC / ml) a través de la celda de ensayo.
4. Un seguimiento continuo de los cambios en la frecuencia de resonancia de sensores y la disipación de la energía para el primer armónico, using el software Q-Soft.
5. Cuando los cambios en la frecuencia de resonancia de sensores y la disipación alcanzaron niveles de saturación, añadir la suspensión de PBP de anticuerpos conjugados con perlas de látex (6,77 x10 ¹⁰ perlas / ml) para el flujo durante el monitoreo continuo de la frecuencia y la disipación.
6. Repita los pasos de 09.02 a 09.05 para las células bacterianas por estafilococos resistentes a la meticilina (MRSA).
7. Definir un cambio de frecuencia a través de la variación de la masa debido a las bacterias de unión por la ecuación de Sauerbrey ^24,25 Df = xn-Delta M / C, donde C es la sensibilidad masa constante (C = 17,7 ng x cm x ^{-2 -1} Hz a 5 MHz ), m es la masa y n es el número de armónicos (n = 1).
8. Definir un cambio de disipación de energía (Δ D) a partir de la grabación de la disminución exponencial de oscilación (frecuencia y amplitud de amortiguación, lo que permitió la cuantificación de la energía disipada y se almacena durante un período de oscilación,E _{se disipó} y E _almacenada, respectivamente: Δ D = E _disipada / 2 πE _almacenada. Δ D se mide en unidades de disipación (DU), uno DU = 10 ^-6 unidades relativas).

Resultados

El fago demostró actividad lítica contra todas las cepas ensayadas de S. aureus, incluyendo cepas de MRSA, tal como se indica por la prueba de la mancha fago. Tamaños de placa generalmente variaron de 5 a 15 mm. No se encontró actividad contra otros-cultivos de ensayo (Tabla 1).

Un crecimiento normal de S. aureus ATCC 12600 en un medio NZY en un agitador-incubador a 37 ° C se muestra en la Figura 1A (una curva marcada por círculos vac...

Discusión

Es bien sabido que los fagos se pueden utilizar como sondas de biosensores para patógenos bacterianos ^28. Se demuestra en este trabajo que fago junto con anticuerpos PBP 2a puede ser utilizada para resolver el viejo problema: las cepas resistentes y sensibles a antibióticos discriminación rápidos.

Se encontró sin embargo esos fagos de estafilococos no modificados normales no son adecuados para la detección de bacterias con dispositivos QCM, a pesar de que las bacterias se un...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools