В Vivo миРНК трансфекции и Нокдаун гена в спинного мозга через Rapid неинвазивной поясничного Intrathecal инъекций у мышей

Резюме

В настоящем докладе описывается простой и быстрый метод интратекальной прокол иглой для локализованной трансфекции миРНК в поясничном спинном мозге у мышей под короткий прочного легкой анестезией.

Аннотация

Этот отчет описывает шаг за шагом руководство по технике острых интратекальных инъекций иглой в неинвазивной образом, то есть не зависит от катетера имплантации. Технический ограничение этого хирургического метода заключается в изяществом руках. Инъекция является быстрым, особенно для обученного экспериментатора, и с тех тканей нарушение с этой техникой минимальна, повторные инъекции возможны, причем иммунная реакция на иностранных инструментов (. Например катетер) не происходит, тем самым давая лучшее и более конкретные зачитал спинного модуляции мозга. Поскольку применение вещества в значительной степени ограничивается целевой области спинного мозга, препараты не должны применяться в больших дозах, и что более важно нежелательные воздействия на другие ткани, как это наблюдалось с системной доставки, может быть обойдена ^{1, 2.} Кроме того, этот метод сочетать с трансфекции в естественных нуклеиновых кислот с помощью polyethylenimине (PEI) реагент ^3, который обеспечивает огромную универсальность для изучения функции спинного через доставку фармакологических агентов, а также ген, РНК и белка модуляторов.

Введение

Спинной мозг является очень важным центр в различных ключевых биологических процессов и физиологических функций, в том числе обработки и передачи болевых (ноцицептивных) входов ^4-7. Различные экспериментальные методы были разработаны, чтобы облегчить фармакологическое модуляцию спинного мозга, таких как хронической имплантации интратекальных катетеров ^8, спинного мозга, микроинъекции и интратекального введения иглы ^9. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, и в зависимости от эксперимента парадигмы одна техника может быть более подходящим, чем другие. В то время как хроническая имплантация интратекальных катетеров легко осуществимо в крысу, этот метод очень трудно в мыши, учитывая ограничения на размер. Успех составляет очень низкий и дефицит моторных часто происходят из-за громоздких присутствии катетера в строго ограниченном субдуральной пространства в мыши. Кроме того, долгосрочные поставки наркотиков оказывается из-за частого свертыванияхронически имплантировали катетеры. Наконец, иммунные реакции являются общими.

Эти проблемы можно обойти с помощью метода острой интратекального инъекции через иглу в отсутствии preimplanted катетера, который позволяет быстро и анатомически ограниченное применение препаратов и реагентов к спинного мозга у мышей. Этот способ полностью сохраняет преимущества интратекального доставки по сравнению с другими системными способами доставки (например, орального, внутривенного, внутрибрюшинного, и т.д.), такие как специфичности спинного модуляции, которая позволяет уменьшенные дозы и предел побочных эффектов, а также способности обеспечивать вещества не обычно не пересекают гематоэнцефалический барьер, так как во время интратекальной инъекции, игла вводится между твердой мозговой оболочки и спинного мозга. Важно отметить, однако, по сравнению с другими методами интратекального доставки, интратекального метод инъекционной иглы является наименее инвазивным, позволяя многочисленные применения вже животное, не причинив никакого значительного повреждения тканей или вызывая иммунную реакцию из-за имплантации инородного материала. Тем не менее, это требует технических навыков для очень точного нацеливания иглы, чтобы позволить эффективность.

Здесь мы визуально продемонстрировать способ достижения оптимального показатель успеха для специально нацеленные на поясничную область спинного мозга. Место инъекции, которая выбрана в этом эксперименте является паз между L5 и L6 позвоночных колонке, рядом с котором спинной мозг заканчивается, чтобы свести к минимуму возможность повреждения позвоночника. Кроме того, мы демонстрируем использование этой техники, чтобы сбить генов в спинном мозге с помощью миРНК.

протокол

Все процедуры использования животных были в соответствии с этическими принципами, установленными местной руководящего органа (Regierungspräsidium Карлсруэ, Карлсруэ, Германия).

1. Подготовка миРНК / PEI комплекса

Комплексное решение миРНК / PEI получают, используя инструкции производителя следующим образом:

1. Решение: Развести необходимое количество миРНК стерильной водой (при необходимости) до четверти конечного объема и разбавить этот вопрос с 10% раствором глюкозы до половины конечного объема. Vortex мягко или перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Оптимальное количество миРНК должна быть определена опытным путем, но 1 мкг миРНК в 10 мкл раствора комплекса на животное является хорошей отправной точкой для оптимизации.
2. Раствор В: Разбавить необходимое объем реагента PEI стерильной водой до четверти конечного объема и разбавленной этот вопрос с 10% раствором глюкозы до половины конечного объема. Vortex GEntly или перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
   Примечание: количество реагента PEI определяет ионный баланс в комплексе, который влияет на эффективность трансфекции. Аналогичным образом оптимальное количество раствора PEI должна быть определена эмпирически. В наших руках, оптимальное количество составляет 0,12 мкл PEI раствора на 1 мкг миРНК.
3. Смешайте раствор А с раствором Б все сразу, вихрь мягко.
4. Инкубируйте смешанного раствора в течение 15 мин при комнатной температуре перед использованием. Этот комплекс стабилен в течение 2 ч при комнатной температуре и в течение 24 ч при 4 ° С.

2. Интратекальное впрыска

1. Обезболить мышь с 3% изофлуран, пока он не показывает никаких признаков рефлекса. Кроме того, проверьте, хвоста и / или лапы пинч рефлекса для дальнейшего обеспечения состояние наркоза.
2. Бритье около 2 см ² меха на заднем конце животного у основания хвоста для лучшего визуализации во время введения иглы.
3. Наведите курсор вносовой обтекатель для продолжения администрации изофлурана во время процедуры, уменьшить изофлурана до 1,5%, и покрывать глаза мыши с глаз смазки.
4. Подготовка готов к использованию миРНК смешанный раствор с использованием 25 мкл Hamilton шприц, прикрепленный к 30 G 0,5 в иглу.
5. Найдите остистый процесс L6, которая должна быть самым видным один и исправить, нажав на нее мягко столбец позвоночных вокруг этой области.
6. Осторожно вставьте иглу между паз L5 и L6 позвонков и наблюдать за хвост фильме как этот знак указывает на успешный выход иглы в интрадуральной пространстве.
   Совет: Использование ноготь, нужно быть в состоянии определить местонахождение паз, а также.
7. После того, как наблюдается хвост фильм, не сразу, а тщательно закрепите положение иглы с одной стороны и впрыснуть нужного объема вещества с другой стороны медленно.
   Совет: объем между 5-10 мкл является оптимальным как объем менее 5 &# 181; л ненадежно и объем больше, чем 10 мкл приводит к слишком много давления.
8. После инъекции выполняется, переместите мышь обратно в клетку, чтобы оправиться от наркоза.
9. Повторите этот инъекции по крайней мере еще два раза каждые 24 ч, чтобы достичь оптимального понижающей регуляции гена-мишени.

Результаты

Для того чтобы проиллюстрировать успешную инъекции, мы выполнили эту технику с использованием быстрого Зеленый FCF краситель у взрослых C57BL6 мышей (8-10 недель). Животное было позволено восстановить в течение нескольких минут после инъекции, чтобы обеспечить достаточно времени для красит...

Обсуждение

Таким образом, вышеописанная методика интратекальных инъекций иглы является эффективным, быстро, в частности, локализованные и неразрушающий. Технически, наиболее важным аспектом этой процедуры является точка введения иглы в канавку. Очень важно, чтобы эта процедура делается с очень ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
In Vivo-jetPEI	Polyplus	201-10G
WAVE1 siRNA	Santa Cruz	sc-36832
Control siRNA-A	Santa Cruz	sc-37007
Anti-ß-Tubulin III antibody	Sigma	T2200
Anti-WAVE1 antibody	R&D Systems	AF5514
Fast green dye	Sigma	F-7252
Isoflurane	Baxter
Isoflurane setup	Dräger Lübeck
Shaver	Wella
Hamilton syringe Gastight 1702	Hamilton
30 G 1/2 in 13 mm Needle	BD Microlance	304000
Microscope Leica MS5	Leica
WAVE1 forward primer for qRT-PCR	Sigma		cacagagcctcaggacagg
WAVE1 reversed primer for qRT-PCR	Sigma		cttttcaccaacggcatctt
FastStart Essential DNA Green Master	Roche	6402712001