行動経験に続いて脳試料からの転写動態の網羅的解析

要約

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

要約

脳と長期記憶の統合の経験の符号化は、遺伝子転写に依存する。経験をコード内の特定の遺伝子の機能を同定することは、分子神経科学の主な目的の一つである。さらに、特定の動作で定義された遺伝子の機能的関連は、精神神経疾患の基礎を理解するための意味を持っている。堅牢な転写プログラムの誘導は、さまざまな行動の操作後のマウスの脳で観察されている。いくつかの遺伝的要素が異なる行動の操作に従い、異なる脳核内に再帰的に利用されているが、転写プログラムは、全体的な誘導の刺激、彼らは^1,2を研究されている構造に固有のものです。

この公報では、プロトコルは、行動操作に応じてマウスの脳の核から、堅牢で包括的な転写プロファイリングに記載されている。ザ·プロトコルは、急性コカイン経験以下の側坐核における遺伝子発現動態の分析の文脈において明らかにされる。 生体内での経験で定義されているに続いて、標的神経組織が ​​解剖されている。 RNA精製に続いて​​、複数の標的遺伝子の総合的なqPCR分析のためのマイクロ流体アレイの転写と使用率を反転させます。このプロトコルは、このような小さな脳試料または単一の細胞のような出発物質の制限量を総合的に分析（50〜500の遺伝子をアドレッシング）を目指している。

プロトコルは、複数のサンプルの平行分析（ 例えば単一細胞、製薬以下動的解析、ウイルスまたは行動摂動）が最も有利で ​​ある。ただし、プロトコルは、マイクロアレイまたはRNAseqによって全ゲノムの研究の前に、サンプルの特性評価および品質保証のために役立つだけでなく、全ゲノム研究から得られたデータの検証ができた。

概要

脳の動的な組織は、認知および行動の柔軟性を可能にします。経験は、脳³のニューロン間の接続の構造や強度の修飾を通してエンコードされます。この「経験依存可塑性」とは、シナプスの構造と強度⁴の修正のために必要なタンパク質を提供する遺伝子発現の特定のパターンの誘導の結果である。長期的な記憶の形成を仲介する遺伝子調節ネットワークの同定は、転写プログラムの主要な要素の識別のための記憶形成だけでなく、目標を規制する基本原則への洞察を提供することを期待して、分子神経科学の中心的信条です神経変性および神経精神障害の治療。転写プログラムは、Dのために重要である別の文字の遺伝子をコードし、それぞれが、時間的に定義された波のように展開シグナリング事象^1,2の結果の実装にifferent段階。それは、誘発された遺伝子の完全な補完を識別し、それらの誘導の動態に応じてそれらの潜在的な機能への洞察を得るように、詳細な時間的な時間スケールでの転写ダイナミクスに対処することが重要である。

薬物中毒は脳の^5,6における神経回路上の乱用薬物の長期的な効果によって引き起こされる経験依存可塑性の堅牢な形式です。薬への初期、急性暴露は、中毒の開発および慢性使用への移行につながる可能性がある。コンテキスト情報は、依存症の発達における重要な要素である。医薬品関連の環境手がかりは、薬物乱用者の心の中の重要な重要性が割り当てられます。過去の薬物経験の薬物乱用者に思い出させるコンテキスト情報があっても薬物暴露^7,8から禁欲長期間以下の薬物渇望に再発を誘導することができる。したがって中毒に大きな臨床上の挑戦-禁断症状が⁹沈静化した後、中毒者の傾向があっても、長い再発する。

コカインへの行動感作は、薬物中毒のメカニズムの研究に有用コカインの経験を単純なモデルである。乱用薬物への慢性曝露によって誘発される長期的な感作のためのこの広く研究されたモデルでは、げっ歯類は、まず生理食塩水の注射（腹腔内; IP）に慣らしている小説の環境で（彼らの自発運動を監視されているオープンフィールドチャンバー） ;彼らの活動は^10（ 図1）をモニタしながら、その後、彼らはオープンフィールドチャンバー内のコカインの毎日の注射を受ける。この行動パラダイムは、典型的には、PERVの形成を示す、コカイン注射の停止を以下ヶ月間維持され^、11（ベースライン活性を上記の8〜12倍）運動行動の堅牢感をもたらす薬物経験のasive記憶痕跡。

自然種（ 例えば摂食、性別）の成功に不可欠な行動を強化にかかわる報酬の神経回路は、薬物関連行動^12,13を補強するために乱用薬物によって利用されている。乱用薬物の経験が増強されることにより、分子·細胞メカニズムは、他の脳構造¹⁴内の宣言型または意味記憶の形成のメカニズムと類似していると思われる。そのため、行動感モデルの頑健性は経験依存可塑性のメカニズムを研究するための魅力的なモデル系になります。

側坐核（NAC）は、脳の報酬回路の中心積分器であり、広く中毒^5,6の発症と関連している。中毒の形成は、側坐核における新規タンパク質の転写に依存し、ロバスト明確に構造化転写プログラムの生産は、コカインの経験^15-19以下の側坐核において観察される。コカイン曝露に対する急性転写応答が強い誘導刺激に適応する、新たなタンパク質の産生を指示するために、複数のレベルで機能する可能性が高いこと薬剤^6,19-22への曝露によって誘発される構造的および電気生理学的変化の原因である。

脳における経験依存的可塑性の分子機構の研究を促進するために、プロトコルは、行動操作後の脳組織試料中の転写動態の包括的な分析のために記載されている。転写分析のためのマイクロ流体動的配列を用いて、コカインに対する行動感作 - プロトコルはミカンハダニ室で研究された行動の経験と関連して示されている。記載されているプロトコルは明らかにトンを研究に限定されるものではない彼は、行動感作のコンテキストで側坐核の核が、行動パラダイムと脳の多数の領域に適用することができる。実際に、このプロトコルは、脳の外側の身体組織に適用することができ、経験または生物の操作のさまざまな検討を行った。

プロトコルは、大きく4つの段階に分けられる。最初のステップでは、動物は、行動パラダイムに供される。第二工程において組織顕微解剖され;第三工程で - mRNAは、逆転写及びプローブし、精製し、そして最終工程でデータが分析される。

転写ダイナミクスを研究の文脈では、経験の正確なタイミングと定義は、おそらくコントロールする最も重要な実験パラメータである。このため、選択した私達の行動モデルは、の体験のパラメータに対する実験者の高レベルの制御を可能にするシステム、コカインに対する行動感作のものであるCE。経験依存可塑性や記憶形成の異なるモデルを正確なタイミングを有効にして対処する追加の行動パラダイムを利用できます。これらのモデルは、恐怖条件付け^23、急性環境エンリッチメント^24,25、新規オブジェクトの探査²⁶と暗い飼育²⁷以下の視覚体験が含まれています。それでも、コカインに対する行動感作は、コカインの経験^28を次の数ヶ月続く非常に普及したメモリ·トレースの作成 ​​、一貫して強固な行動操作である。

脳は、側坐核の手動マイクロダイセクションが続き、区分されている。これは、急速に準備脳スライスからの手動マイクロダイセクションは、行動パラダイムに関連する組織を抽出する最も信頼性が高く迅速な方法を提供することが私たちの経験をされており、経験を、組織の境界が明らかになり、容易に認識した。代わりに、細かいスライスがprepar可能性レーザーキャプチャーマイクロダイセクションが続く編、。この方法は、関心領域の高度に規定された描写を可能にしますが、それは、（このように不安定なmRNAの損失を危険にさらして）遅く面倒でコストのかかる専用の機器（レーザーキャプチャーセットアップを装着し、顕微鏡）が必要です。ここに定義されたプロトコルはまた、パッチピペット^29を使用して視覚的に同定された細胞の細胞質の手動吸引によって、単一細胞の転写分析に適合させることができる。それはほとんどの場合、組織内の細胞の亜集団のみが実際に経験に応答に関与している可能性が高いものの、記述されたプロトコルは、母集団平均を提供することに留意することが重要である。それは経験に応答する特定の細胞集団の中から選択的に転写をプロファイリングすることが重要であるが、これらのアプローチの議論は、現在の範囲を超えています。

mRNA精製のために、逆転写および定量PCR照会、組織を市販のキットを利用して、その後細い針、を通過させることにより破壊されている（詳細については、 表8を参照）。選択は、高品質のRNAと下流のアプリケーションから堅固な成果を保証抽出を確実にこれらの方法論、経験によって通知される。

プロトコルは、動的配列を用いたハイスループット定量PCRのために記載されているが、サンプルがエンドポイントPCR、低スループット定量PCR、遺伝子発現マイクロアレイまたは深いシーケンシングを使用して遺伝子発現についてプローブすることができる。ハイスループットqPCRには、動的配列を利用するための好みは、mRNAが行動パラダイムに従うことは、多くの場合、制限量のある脳核から得ているという事実によるものである。動的配列は、単一の実験で並列多数のサンプルからの転写物の効率的な総合的な分析を可能にするプラットフォームを提供します。マイクロ流体システム（一般機関投資PUの初期捕捉した後、rchase）、実験は実行することが比較的安価である。この分析に続いて、試料の更なる問い合わせは、品質保証のための総合的なリファレンスを提供する動的な配列で（マイクロアレイまたはRNAseqによって）は、新規転写産物を検索するために、より高価なプラットフォームを使用して実行することができた。最後に、データ分析のために、標準的なアプローチが利用される。発生する可能性がある問題について具体的なポインタはプロトコルの文章で説明します。

このプロトコルは、複数の条件との複製を研究、関心のある彼らのシステムの徹底的な調査に興味を持って研究者のために最も適しています。プロトコルは、すでに彼らは繰り返しクエリするに興味を持っている関心のある50〜500の遺伝子のサブセット（マイクロアレイまたはRNAseq実験により）で磨いてきた研究者に最適です。

プロトコル

注：プロトコルは、エルサレムのヘブライ大学の動物ケアのガイドラインに従っています。

ACSF溶液の調製

1. 適切な水の添加またはNaClで〜300mOsmで/ Lに浸透圧をもたらし、 表1に記載したように、OのddH ₂で1リットルを加えます。ACSF溶液を調製（> 18MΩ純度）。

2。機器とルームセットアップ

コカイン誘発自発運動行動の監視のための装置は、内部光源、ファンとカメラ（または赤外線センサ）で配線行動チャンバー（50×45センチ）で構成され、内側のパースペックスボックス（30×30cm）に中を搭載そのマウスは、それらの運動を監視しながら自由に移動することができる。行動試験は、通常の明/暗サイクルで、ライトの前に1時間に上のライトの後に1時間の間オフに実行する必要があります。動物は、毎日同じ時間に一貫して訓練されるべきである。

1. 監視およびマウスの運動行動を記録するための適切なシステムにカメラや赤外線システムを接続します。
2. 嗅覚キュー偏りを防ぐために、適切な消毒を確実にするために、マウス機能、および/または臭気の除去試薬が提供する消毒剤と各試行の後にチャンバーを清掃してください。

重要：取り扱い中にマウスは、静かで穏やかで、注意してください。

3動物の準備

1. ハウス5 C57BL6雄マウス;規格や地元の動物の要件に応じて12時間の明/暗サイクルと食料と水を自由に部屋の中でケージ当たり（6-12週齢体重〜25〜35グラム）、、委員会の指導とプロトコルをケア。実験を開始する前に、マウスを計量し、データを記録します。コカインは、後にマウスの体重に応じて投与される。
2. 最初のトライアルを開始する前に、行動の部屋に30分マウスを含むすべてのケージを転送します。
3. すべてを慣らす実験に用いたマウスは、注射剤の取り扱いや行動のセットアップで監視する実験者。以下に説明するようにこれを250μlの生理食塩水の3つの連続した​​毎日の腹腔内注射によって達成される。
4. 250μlの生理食塩水の腹腔内注射を管理します。すぐに注射した後、15分間の運動活性を監視するために行動チャンバー内にマウスを置きます。毎日同じ時間に、3日間連続してこのアクションを繰り返します。
5. 4日目に、二つのグループにマウスを分ける。生理食塩水中の2mg / mlでコカインの原液を準備します。 （ - 30グラムのマウスが300μlのを受け取るのに対し、250μlのを注入する25グラムのマウス用など ）、マウスの重量に応じて実験群にコカイン溶液（最終的に20mg / kg）を単回注射を管理します。対照群には生理食塩水を管理します。すぐに注射後、自発運動のモニタリング（typicための行動チャンバー内で20分間、マウスを置き同盟国は、最初の15分）を監視されている。
6. コカイン注射の後、異なる時点（注射後0、1、2、4、8および24時間）で、マウスを屠殺。重要なことは、参照マウス（0時点）はこの日のいずれかの注射を受けることはありませんことを確認してください。 、その重要性は、参照グループの反復を含むことが必須である。

側坐核の4解剖

1. コカイン/生理食塩水注射後の適当な時間にイソフルランでマウスを麻酔。イソフルランは、直接部屋から排気されなければならない。したがって、この手順は、化学ドラフト内で行われるべきである。
2. 後足反射をテストすることによって麻酔深度を監視します。動物が引っ込め反応を誘発するために足をつまむ。反射を示している動物は、麻酔の外科的レベルではなく、安楽死させる状態ではありません。
3. 脳の抽出：
   1. 断頭によりマウスを安楽死させる。
   <李>頭蓋骨の中心より肌を削除し、鋭いハサミで頭蓋骨を切った。
   2. 脊髄は、脳（大後頭孔）に入る時点でのはさみを挿入し、2本の横方向のカットを行う。
   3. 同じ観点から、矢状縫合に沿って長い矢状カットをする。嗅球に到達すると、左に右にクリップ。
   4. 鉗子を使用すると、しっかりと頭蓋骨の各半分を把握し、側に引いて、上に押すか、脳に損傷を与えないように注意しながら、慎重に頭蓋骨を削除します。
   5. 反転したマイクロスプーンへらを使って、脳神経を切断しながら、脳を除去します。
4. 寒さと硬化する1〜2分間、氷冷ACSF溶液中で脳を置きます。
5. ビブラトームステージに、ACSFから脳を取り外し、ペーパータオルで余分な水分を吸い上げ、小脳と脳の他の部分との間に冠状カットを作成して、脳を接着、上に向けて頭側の部分と。
6. NACを切削：
   1. ビブラトームのスライスチャンバー内の氷のように冷たい温度でのACSFのソリューションを維持します。側坐核（NAC）まで、200μmの時のセクションが明確にパクシーノスフランクリンマウス脳アトラス（ブレグマから約1.8ミリメートルの前方に応じて識別され、脳梁、前交連の位置や形状の形状に注意を払い、心室だけでなく、脳切片の全体的な形態）。この時点では、NACは解剖され、そこから2400μmのセクションを作成します。
   2. ステレオスコープの下では、スライスから側坐核領域を切開する細かい刃を使用しています。側坐核の定義はパクシーノスフランクリンマウス脳アトラスに応じており、便利に組織上のブレードの4素早いパスで適切なセクションで解剖することができた。 （ 図2）。
   3. RNA EXTRまで-80℃でマイクロチューブや店舗で900μlのトリゾール溶解試薬ですぐに側坐核セクションを配置アクション。

5。RNA抽出およびcDNA逆転写

1. 核を含むチューブは、室温でトリゾール溶解試薬のセクションを側坐核解凍し、組織が完全に均質化された（少なくとも15〜20倍）になるまで、25 G針に接続された1mlシリンジでライセートをホモジナイズする。最初の数ラウンドは困難であり、針の先端に入ることができる小さな断片にそれを打破するために、管の壁に対して組織を押して必要とする。
2. 均質化を確実にするために、1分間12,000×gでQIA​​シュレッダーミニスピンカラムや遠心にライセートをピペット。
3. ピペットでライセートを新しいマイクロチューブに、製造業者の指示に従ってRNAを抽出。使用するまで-80℃でRNAを保存してください。
4. 、RNA濃度を測定するバイオアナライザまたは同等の装置を使用して整合性と品質を分析。 rのcDNA調製の各ラウンドのために100〜500 ngのRNAを使用してくださいandomのヘキサマープライマー。

6。プライマーデザインとプライマーのテスト

1. mRNA転写物の定量PCRに最適なプライマー対は、（ 図3）、これらの要件は、次のとおりです。良いプライマーの選択：
   1. デザインプライマーはもはや17-28塩基よりも含有していない。彼らはミスプライミングを促進するようにヌクレオチド反復を避けてください。
   2. 56-68°C（最適には60〜64℃）の間の融解温度（T _m）を有する設計プライマー。プライマーペア内のT _mは 、互いに1℃以内であるべきである。
   3. 製品サイズは、理想的には80〜150bpの間であるべきであることに注意してください。
   4. ゲノムDNAの汚染物質の増幅を避けるために、プライマーの少なくとも一つは、エクソン - エクソンジャンクショ​​ンをカバーしたり、アンプリコンは、大きなイントロン（イントロンスパニング）が含まれていることを確認してください。
   5. プライマーの設計を改善するために、（例については、表2を参照）プライマー3に基づいて信頼性の高いソフトウェアを使用してください。
2. 広報のテストimers：プライマーの特異性および効率性を確保するために、制御のqPCR反応は行われるべきである。
   1. （関連するすべてのプライマー対のためのcDNAテンプレートを含む）は、正のサンプルを使用してcDNAを滴定（ 例えば 、10 ngの〜の初期濃度からの8つの3倍希釈）、重複する並列反応で。反応に使用される溶液内の汚染のために制御し、無鋳型対照を含めます。
   2. 式を使用して、プライマー効率を計算する^{：（10（ - 1 /勾配）-1）×100、}最適な傾きの曲線となるように- 3.333（ すなわち ^{、10（1 - / 3.333）=} 2）（ 図4）。
   3. 増幅の特異性を決定します。オフターゲット増幅が明らかな偏差frのように表示されます。一方、具体的な増幅は、増幅産物のすべての融解曲線に共通の単一の顕著なピークによって実証される単一の大きなピークがオム。

7 qPCR分析

1. プリ増幅：
   1. 総合的qPCR分析は、プライマー対の多数のRNAの量を制限する並列クエリに基づいている。したがって、前増幅ステップが不可欠である。このステップでは、cDNAは、（800プライマー対まで）将来のサンプルを照会するために利用されるすべてのプライマーの混合物で予備増幅の14-18サイクルを受ける。
   2. 特定標的増幅（STA）のために50μMのTE（低いEDTA）内のすべてのプライマーを希釈する。
   3. プールは一緒に、50μMのプライマーの全てを1μlを800アッセイまで、STA反応に含まれるように設定します。
   4. 表3に記載したようにSTAのためのプレミックス及び試料を調製する。増幅される必要があるサンプル数の110％用のミックスを調製することにより、エラーを許可。
   5. 各サンプルのアリコート3.75μlのSTAプレミックス。 1.25μl添加各cDNAの。
   6. 10秒間の反応および遠心分離機を混合する渦。
   7. 表4に示されるように、サーマルサイクラーとサイクルのSTA反応を置きます。
2. エキソヌクレアーゼI（ExoI）処理：
   1. 表5に示されるように、エキソIを希釈する。
   2. 各5μlのSTA反応に希釈しExoI（4 U /μl）を2μl加え、ボルテックス、スピンダウン（> 6,000×g）で、サーマルサイクラー内の場所37 °Cで30分間、次いで15分間80℃にて。
   3. テストのために適切な濃度に最終製品を希釈する。利用TEバッファー（7μlのTSAサンプルに43μlのTEバッファーを追加）。
   4. -20℃で希釈されたSTAの製品を保管したり、すぐに使用しています。
3. 定量PCR用のプライマーとサンプルの設定：
   1. 表6に示すようにサンプルを調製します。実験のために選択されたチップに応じてミックスを調製し、必要に応じてサンプルを追加します。
   2. 阿木20秒以上のサンプルミックス·ソリューションをTATEと、少なくとも30秒間遠心（> 6,000×g）で。チップがローディングのための準備ができるまで準備反応は、4℃で短期間保存することができる。
   3. 表7に記載されるようなアッセイを準備します。
   4. すべてのコンポーネントをスピンダウンするために、少なくとも30秒間（> 6,000×g）で20秒遠心最低アッセイミックスを攪拌。
      重要：徹底的にボルテックスし、遠心分離チップインレットにピペッティングする前に、すべてのサンプルおよびアッセイ溶液は。そうしないと、データ品質の低下をもたらし得る。
      注：各プライマーの最終濃度は、入口において、5μM及び最終反応における500nmである。
4. プライミングおよび動的配列IFC（集積流体回路）チップのロード。 IFCチップ（ ふぃぎゅのマイクロ流体チャンバを加圧するために使用される制御線液（鉱油）のためのサンプルおよびアッセイのための入口、ならびに指定された注入口（アキュムレータ）を有している）4A再。
   1. チップ上の各アキュムレータに制御線流体を注入します。
   2. チップの下から青い保護フィルムを取り外し、廃棄します。
   3. 適切なIFCコントローラー（48.48ダイナミックアレイIFCまたは96.96ダイナミックアレイIFCのためのIFCコントローラHX用のコントローラMX）にチップを置き、その後48.48ダイナミックアレイIFCや総理（136X）のために総理（113X）スクリプトを実行するプライムチップへの順序で96.96ダイナミックアレイIFCのためのスクリプト。
   4. スクリプトが終了すると、IFCコントローラからプライミングチップを取り外します。
   5. ピペット各アッセイミックスを5μlとそれらの入口に各サンプルミックスを5μl。
   6. IFCコントローラにチップを返します。
   7. IFCコントローラソフトウェアを使用すると、48.48ダイナミックアレイIFCのロードミックス（113X）スクリプトを実行する）、または96.96ダイナミックアレイIFCはチップにサンプルおよびアッセイをロードするためのミックス（136X）スクリプトをロードします。ロードミックススクリプトが終了すると、負荷を取り除くIFCコントローラからエドチップ。
   8. 融解曲線分析を含めて、（製造業者のガイドラインに従って）新しいチップランを作成し、サーマルサイクラー上のチップをロードします。サーマルサイクラーソフトウェアを使用して、反応チャンバーが正しく認識されていることを確認し、反応が完了するまで実行することができます。

8。データ解析

1. 品質保証：データ品質を確保するために、（上述のように）希釈曲線をアドレスすることによって、プライマーの品質を確認する。アンプリコンの融解曲線を見ることによって、増幅の特異性を監視し、のピークが最適にしっかりと^29を一致させて下さい。
2. 可視化：ハイスループット定量PCRにより得られた大量のデータの視覚化のために、使用するソフトウェアがその中で発現が色分けされた強度であり、ヒートマップを生成した。また、並んで散布図のような単一遺伝子の転写ダイナミクスを表示します。
3. 出版：出版で遺伝子発現の結果は、それがその妥当性、正確性、正しい解釈、および再現性を確保するためのqPCR実験のために報告されなければならない最低限の情報を詳述し、定量的リアルタイムPCR実験の出版のためにMIQEガイドラインに従うことをお勧めします。

結果

このプロトコルを適用して得られた結果の質は、決定的なパラメータの数に依存する。適切な実験計画は経験がテストされるように、実験用マウスに最小限の妨害になります（この例では、コカインにさらされること）が彼らの最近の歴史の中で最も支配的な経験になりますので、堅牢で特異的転写になりますプログラム。 図1に、核はマウスから解剖され、分析される側坐核れ...

ディスカッション

行動パラダイム以下の脳組織からの遺伝子発現の特徴付けは、成功によって異なります。行動パラダイムの間のマウスの1）慎重な取り扱い;目的の組織の2）迅速かつ正確な解剖; RNAの完全性を確保するための3）RNAセーフ対策; 4）慎重なプライマーと実験レイアウトの計画だけでなく、qPCR分析の準備のために細部にまで精度と注意。

記載された手順の目的は、行動の経験?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Virusol	Oriek Medical	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGEN	73404
QIAshredder	QIAGEN	79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Invitrogen	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogen	1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm)			Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm)			Self assembled
Camera and video recorder	Campden Inst.	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Vibratome	Campden Inst.	7000SMZ-2
Bioanalyzer	Agilent Technologies	The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspoon spatula	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression	Fluidigm	BMK-M-96.96