Thymectomie complète chez des rats adultes avec les non-invasive intubation endotrachéale

Résumé

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Résumé

Thymectomie néonatale chez les rongeurs est une procédure établie et fiable pour les études immunologiques. Toutefois, chez les rats adultes, les complications de l'hémorragie et de pneumothorax perturbation pleural peuvent entraîner un taux de mortalité significatif. Ce protocole est une méthode simple de thymectomie de rat qui utilise un mini-sternotomie et l'intubation endotrachéale. Intubation est réalisée avec une méthode non-invasive et facilement reproductible et permet une ventilation à pression positive pour empêcher un pneumothorax et une voie aérienne contrôlée qui permet suffisamment de temps pour la dissection minutieuse thymus de minimiser les perturbations pleural. Une incision sternale 1,5 cm diminue contact avec les vaisseaux médiastinaux et la plèvre, tout en offrant une visualisation complète du thymus. Après exposition du médiastin, le thymus est éliminé par dissection mousse sous grossissement. La cavité pleurale est ensuite scellée par la fermeture de suture des muscles trachéaux pré-suivi par l'application de la colle chirurgicale. Lethorax est alors fermé par la fermeture de suture du sternum, suivie d'une fermeture de suture de la peau. Tous thymectomies étaient complets comme en témoigne immunohistochimique (IHC) coloration du tissu médiastinale, et l'absence de lymphocytes T naïfs par cytométrie de flux, et la procédure a eu un taux de survie de 96%. Cette méthode convient lorsque thymectomie complet avec un minimum de complications est souhaitée pour d'autres études immunologiques chez les rats athymiques adultes.

Introduction

Depuis le début des années 1960, le thymus a été reconnu pour son rôle critique dans le développement de la tolérance immunologique centrale. Rongeur thymectomie se est avérée être une procédure indispensable dans la définition du rôle du thymus dans la différenciation des lymphocytes, une auto-tolérance, et immunotolérance dans le cadre de la transplantation d'allogreffes et les métastases tumorales. Retrait du thymus de rat permet études impliquant l'épuisement des lymphocytes T ou le transfert adoptif de populations de lymphocytes T définis sans la ré-émergence de cellules T naïves indigènes.

Thymectomies néonatale chez les rongeurs peuvent être accomplies en utilisant une technique d'aspiration à des résultats fiables ^1. Chez les rats adultes, cette technique est associée à un taux de mortalité d'environ 20% et se traduit souvent par une thymectomie ^deux incomplet. Pour atteindre constamment thymectomie complète chez les rats adultes, l'exposition ouverte du médiastin à travers une sternotomie médiane est nécessaire. Toutefois, cetteprocédure est associée à des complications qui incluent les blessures de la trachée, l'hémorragie et de pneumothorax conduisant à un taux de mortalité global allant de 1,5 à 6% ^{2- 4.}

Au cours des deux dernières décennies amélioration des techniques de Thymectomie ont diminué complications périopératoires et ont amélioré les taux de survie. L'intubation endotrachéale permet une ventilation à pression positive a diminué les taux de pneumothorax ^5. Méthodes d'intubation précédemment décrits plage de l'exposition ouverte à la trachée à des méthodes moins invasives utilisant la visualisation des cordes vocales directe. Les complications associées à la procédure d'intubation trachéale comprennent les blessures, vocal rupture du cordon, intubation oesophagienne involontaire, et l'hémorragie résultant de ponction cardiaque ou une lacération de la veine cave supérieure. En outre, près des lobes thymiques inférieurs à la plèvre peut entraîner un pneumothorax.

Nous décrivons ici une technique dethymectomie à travers une incision de 2 cm mini-invasive de la peau suite à une méthode simple de l'intubation endotrachéale en utilisant un angiocathéter émoussé-end et l'éclairage de la trachée transcutanée. La thymectomie implique une sternotomie 1,5 cm et d'une fermeture à trois couches avec application de colle chirurgicale pour sceller le médiastin et de minimiser l'incidence de l'hémorragie et de complications respiratoires. Cette méthode permet de manière fiable dans la thymectomie complète comme le montre la disparition de CD4 ⁺ et CD8 ⁺ des cellules T naïves suivant la thymectomie et l'absence de tissu thymique de coloration IHC. Temps opératoires et la mortalité péri-opératoire sont réduits au minimum.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures expérimentales impliquant l'utilisation de rats ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Comité de l'Université Duke.

1. Préparation de la canule d'intubation trachéale

1. Coupez l'extrémité de l'aiguille d'une aiguille de 14 G angiocathether 2 pouces avec une pince coupante.
2. Pincez la lumière de l'aiguille fermé avec une pince à bec effilé.
3. Couper la section pincé vers le bord de la partie ouverte-lumière avec une pince coupante, puis couper les bords des deux côtés de la fin restant à 30-45 ° angle au bord de l'aiguille.
4. Placez la partie inférieure de 3 à 4 mm de la canule dans la zone ouverte de pinces à joint coulissant droites et tirez vers le haut jusqu'à une courbe à la hausse légère a été formé à la fin.
   NOTE: Cela facilitera diriger le cathéter dans la trachée (Figure 1).
5. Utilisez du papier abrasif fin pour lisser les bords à l'extrémité de la canule.
6. Retour l'instrument émoussé dans la tubulure de angiocathéter. Assurez-vous que le tube est légèrement plus courte que l'aiguille émoussée.

Procédures 2. Pré-chirurgicales

1. Mettre en place le site pour la procédure en plaçant un microscope opératoire réglé à un grossissement de 10X sur la zone d'exploitation.
2. Placez un coussin chauffant sur la zone d'exploitation et couvrir avec un tampon absorbant propre.
3. Configuration d'un rythme cardiaque et un moniteur d'oxygénation du sang à proximité de la zone d'opération chirurgicale.
4. Peser le rat pour les médicaments posologie en fonction du poids (par exemple, l'analgésie postopératoire, antibiotiques, anticorps ou de lymphocytes ozone).
   NOTE: typique rats adultes pèsent entre 350 à 450 g.
5. Sedate le rat vaporisé avec 3% d'isoflurane-O ₂ (3 L / min) en utilisant une chambre d'induction évacué vers un système d'évacuation des gaz d'anesthésie déchets contenant du charbon activé. Laisser 5 min pour induction de l'anesthésie pour fournir une anesthésie profonde nécessaire à l'intubation endotrachéale.
6. Administrer Carprofène ou Meloxicane (4,4 mg / kg) sous-cutanée chez le rat avant de procéder à l'intubation et la chirurgie.
7. Utilisez une tondeuse électrique se raser le cou et la poitrine du rat anesthésié avant l'intubation.

3. intubation

1. Préparer la configuration d'intubation en frottant une petite quantité de lubrification (par exemple, gel KY) sur l'extrémité de la canule d'intubation. Allumer le ventilateur à commencer l'écoulement de gaz à travers le tube isoflurane du connecteur.
2. Transférer le rat de l'appareil d'intubation et suspendre le rat sur ​​la barre métallique par ses dents d'incisive supérieure (figure 2A).
   NOTE: Certains appareils d'intubation peuvent être achetés en ligne. Le modèle présenté ici est fait maison en utilisant une feuille acrylique moulée autour des sections d'un morceau lombaire 2 x 4 pouces utilisant une torche au butane, et des renforts sont attachés avec du chloroforme. Le bar (ou fil métallique) est fixé par des trous de forage de plus de ruban de masquage mis sur le side de l'acrylique pour prévenir l'éclatement ou de fissuration.
3. Trans-éclairer le cou du rat par le positionnement d'une source de lumière souple à haute intensité de 1 à 2 cm de la surface ventrale du cou (figure 2B).
4. Utilisez une paire de pinces étudiants modèle standard de tirer la langue doucement vers le haut et sur le côté des dents du bas. Saisir la langue entre le pouce et l'index d'une main tout en plaçant la surface intérieure d'un côté plat de la pince contre l'extrémité inférieure de la langue. Appuyez sur le ventre pour exposer l'épiglotte et l'ouverture du larynx (figure 2C).
5. Visualiser les cordes vocales et guider la retroussé, extrémité émoussée de la canule d'intubation en avant à travers la glotte ouverte dans la trachée jusqu'à ce que le moyeu de la angiocathéter touche les incisives.
6. Retirez le stylet de métal, et fixer le tube d'anesthésie à l'ouverture de angiocathéter pour commencer la ventilation à l'isoflurane.
   NOTE: Le flo typique d'oxygènetaux w pour le ventilateur est de 3 L / min avec 3% d'isoflurane.
   1. Régler le ventilateur à une vitesse de 60 respirations / min dans un mode de ventilateur volumique contrôlée qui permet d'obtenir une pression de ~ 12 à 14 mmHg. Utilisez une pression expiratoire positive (PEEP) de 3 cm H ₂ O.
7. Observez l'expansion de la paroi thoracique bilatérale en synchronisation avec le ventilateur pour assurer un placement correct de la sonde endotrachéale.
8. Appliquer pommade ophtalmique vétérinaire recommandé aux yeux du rat pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
9. Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux du rat pour empêcher sec sous anesthésie.
10. Fixer la sonde endotrachéale à la tête du rat avec une bande de ruban de tissu. Assurer la connexion entre la sonde endotrachéale et le tube d'entrée anesthésique.
11. Fixez l'oxygénation du sang et moniteur de fréquence cardiaque au pied du rat et de commencer la surveillance. Confirmez anesthésie adéquate en confirmant qu'il n'y a pas de réaction àe-pincement.

4. thoracotomie et Thymectomie

1. Suivez technique aseptique standard pour l'ensemble de la procédure.
   1. Nettoyez la zone et d'exploitation table de travail et désinfecter avec une solution d'éthanol à 70%.
   2. Utiliser des gants chirurgicaux stériles pendant la procédure, et l'autoclave tous les instruments et les matériaux utilisés lors de la procédure.
   3. Appliquer providone-iode à toute la région de la poitrine et laisser sécher. Ensuite, nettoyer la surface de la peau avec 70% d'éthanol sur de la gaze. Couvrir le rat avec une pellicule de plastique transparent découper un trou pour exposer le champ opératoire stérile.
2. Identifier la fourchette sternale dans la région thoracique supérieure. Faire une incision médiane 2 cm à travers la peau à partir de 2 à 3 mm au-dessus de la fourchette sternale et se étendant distalement ligne médiane le long du sternum aide de ciseaux Shea épointées.
3. Effectuez une sternotomie 1,5 cm médian de la fourchette sternale utiliser à nouveau des ciseaux Shea épointées. KEEP le bord inférieur de la paire de ciseaux juste sous le sternum et avance lentement.
4. Insérez un petit écarteur Alm juste en dessous du sternum séparé et se ouvrent pour révéler les muscles de la sangle pré-trachéale (sterno et les muscles sternothyroid). Séparer les muscles de la sangle pré-trachéales utilisant une pince Graefe contondants. NOTE: A ce stade, la trachée peut être vu, et le tube d'intubation doit être visualisé intérieur de la trachée.
5. Placez les dents de la petite enrouleur Alm sous les muscles de la sangle et séparés sternum. Ouvrez l'enrouleur pour exposer la face supérieure du thymus.
6. Utilisez pince fine Dumont pour libérer les bords latéraux du tissu de thymus et exposer les lobes thymiques inférieurs.
7. Tirez doucement le thymus supérieurement dans le site de l'incision ouverte, en prenant soin d'éviter tout contact avec la veine cave, sous-clavière et carotide navires supérieurs, et de minimiser les perturbations de la plèvre délicat entre le thymus et les poumons.
8. Comme til thymique vaisseaux sont disséqués et révélé, utiliser des micro-ciseaux pour les diviser. Utilisez un coton-tige pour maintenir la pression sur les navires pour l'hémostase si nécessaire.
9. Livrer les lobes thymiques inférieurs dans l'incision, puis lyser fortement les attaches postérieures. Retirez le thymus intact et inspecter soigneusement le thymus retiré pour toutes les sections manquantes.
   Remarque: Les petits ganglions lymphatiques thoraciques peuvent être visualisées entourant le thymus et sont souvent difficiles à différencier de tissu thymique. Ceux-ci seront rondes noeuds discrets avec une apparence similaire à tissu thymique mais ne seront pas en continuité avec le thymus.
10. Retirer l'écarteur Alm et fermer les muscles sterno et sternothyoid avec deux interrompu 5-0 sutures Maxon.
11. Ajouter 2 gouttes de grade chirurgical adhésif tissulaire à base de cyanoacrylate pour les sutures à sceller le médiastin sous ventilation à pression positive.
    NOTE: Ce sera de diminuer l'incidence de pneumothorax et l'hématome.
12. Fermez le sternum avec deux interrompu 4-0 sutures de soie sur une aiguille de coupe. Insérez l'aiguille à travers des espaces entre les nervures, en prenant soin de guider l'aiguille juste sous le sternum afin d'éviter la couche de muscle sous-jacent.
13. Fermez la couche de la peau avec un exécutant 4-0 Nylon suture. Cesser l'isoflurane à ce stade de raccourcir la période de récupération de l'anesthésie post-opératoire.
14. Nettoyez le site d'incision et la peau environnante avec de la gaze saline humidifié.
15. Appliquer plusieurs gouttes de bupivicaïne (0,25%) pour l'anesthésie locale, suivie de 1-2 gouttes de colle cyanoacrylate sur l'incision pour sceller l'incision.
16. Continuer à ventiler jusqu'à ce que le rat montre des signes de l'effort respiratoire indépendant et commence à se déplacer ses extrémités. Extuber le rat et lui permettre de récupérer sous étroite surveillance dans une cage placée sur un coussin chauffant.
17. Administrer buprénorphine (0,01 à 0,05 mg / kg) sous-cutanée chez le rat immédiatement post-opératoire et répéter tous les 8-12 h pour 48 h post-opératoire (normalement 5 doses au total). À 24 et 48 h post-opératoire, administrer ou Carprofène Meloxicane (4,4 mg / kg) par voie sous cutanée (trois doses totales, y compris la dose pré-opératoire).
18. Continuer à surveiller jusqu'à ce que le rat se déplace autour de la cage. Au moindre signe de détresse respiratoire, effectuez re-intubation et re-exploration de la poitrine.
    1. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal.
    2. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
19. Retirez les sutures de la couche de la peau 1 semaine post-opératoire.

Résultats

Cette procédure a été réalisée sur des rats Lewis adultes (n = 26). La durée de fonctionnement moyenne était de 15 ± 3 minutes. Il n'y avait aucune mortalité peropératoire. Le temps moyen d'intubation - de placement de rat sur l'appareil d'intubation de l'établissement de ventilation - était de 45 ± 5 s. 24 rats avaient un rétablissement complet de l'opération sans aucun signe de difficultés respiratoires ou une hémorragie en jour post-opératoire (POD) 14. Un rat difficultés re...

Discussion

Le présent protocole pour thymectomie complète fournit une approche minimalement invasive avec une incision de fermeture à trois couches avec l'application de la colle chirurgicale conçue pour minimiser les complications. L'élimination complète du thymus a été démontré par la perte de cellules T naïves et par coloration IHC de tissu lymphoïde médiastinale pour la cytokératine.

La procédure de thymectomie de rat adulte a été compliquée par des taux de mortalité alla...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
2" 14-gauge angiocatheter
Operating microscope	Zeiss
Warming pad
Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)
Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)			See Figure 2
Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Small animal ventilator with tubing	CWE	12-02000 (ventilator)and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)
High-intensity Fiber-Optic Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fine straight scissors	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tipped Shea scissors	Fine Science Tools	14105-12
Small Alm retractor (for sternum)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon sutures	Ethicon
4-0 Silk sutures (with cutting needle)	Ethicon
6-0 Nylon suture	Ethicon
Cyanoacrylate glue (Endermil)
Lubrication gel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35