Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Ultrasonic vocalizations (USVs) in mice differ depending on age, sex, condition, and genetic background. Using two ultrasound emitters broadcasting simultaneously in different locations, this two-choice test can evaluate murine recognition and preference responses to different characteristics of USVs.

Özet

Mice emit ultrasonic vocalizations (USVs) during a variety of conditions, such as pup isolation and adult social interactions. These USVs differ with age, sex, condition, and genetic background of the emitting animal. Although many studies have characterized these differences, whether receiver mice can discriminate among objectively different USVs and show preferences for particular sound traits remains to be elucidated. To determine whether mice can discriminate between different characteristics of USVs, a playback experiment was developed recently, in which preference responses of mice to two different USVs could be evaluated in the form of a place preference.

First, USVs from mice were recorded. Then, the recorded USVs were edited, trimmed accordingly, and exported as stereophonic sound files. Next, the USV amplitudes generated by the two ultrasound emitters used in the experiment were adjusted to the same sound pressure level. Nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitters were used to play the USVs back. Finally, to investigate the preference of subject mice to selected USVs, pairs of two differing USV signals were played back simultaneously in a two-choice test box. By repeatedly entering a defined zone near an ultrasound emitter and searching the wire mesh in front of the emitter, the mouse reveals its preference for one sound over another. This model allows comparing the attractiveness of the various features of mouse USVs, in various contexts.

Giriş

Birçok hayvan tür içi iletişim için vokalizasyonlar kullanımı. Fare Mus musculus, iletişim sinyalinin önemli bir tip 20 kHz daha yüksek frekansları var ultrasonik sesler çıkarma (USVs) 'dir. Farelerde yaydığı USVs erkek-dişi, 1-4 kadın-kadın 1, 5, ve erkek-erkek 1, 6 etkileşimleri sosyal tanıma bir bileşeni olarak kabul edilir. USVs onlar onu yavru-alma davranışı artırır annelerinden, izole edildiğinde de yavruların yaydığı ve bu nedenle hayatta 7 yavru vardır. Çok sayıda rapor az 10 belgelenmiştir analiz ve fare USVs 8, 9, davranışsal tepkileri ve alıcı hayvanın nöral mekanizmalarını kategorize rağmen 11. Ikinci USVs çeşitli özellikleri biyolojik önemini açıklamak gereklidir. Bu mekanizmaları ortaya çıkarmak için, oynatma deneyi etkin bir yöntemdir. Yeni çalma çalışmaları dişi olduğunu ortaya koymuşturfareler USVs 12 çekici ve onların ebeveynleri 13, 14 farklı erkeklerden USVs tercih.

Bu makalede, farelerde USV tercihini değerlendirmek için kullanılan oynatma testi açıklar. İki seçmeli test kutusu Şekil 1 'de gösterildiği gibi olan iki farklı USVs, bir test muhafazanın iki bölmenin aynı anda oynatılabilir geliştirilmiştir. Test kutusunun Bu tür üç alt-haznelerde test alanı bölünerek ses kirlenmesini önler kurşun duvarlar kullanılmıştır. Ultrason yayıcılar dışında her oda bulunmaktadır. Odalar ve ultrason yayıcılar arasındaki duvarda tel örgü ile kaplı delikler vardır. Fareler üç oda serbestçe hareket ve ultrason yayıcılar tarafından kayıttan USVs yanıt sanki bir "örgü arıyor" davranışı gösterebilir. Bu testte, fareler, bir ses yayıcı veya başka yakın farklı süreli dönemler için kalır. Bu parametreler hassas bir measu elde etmek için kaydedilebilir ses tercihi yeniden.

Geri USVs oynatmak için, nanokristal silikon termo-akustik yayıcılar (yani, "nc-Si yayıcı") daha önceki çalışmalarda 15-17 olarak kullanıldı. Bu cihazlar, bir ince film ısıtıcı elektrot, bir nano gözenekli silikon katman ve tek-kristalli silikon gofret oluşmaktadır. Dijital ses dosyası bir analog sinyale dönüştürülür ve daha sonra ısıtıcı elektrot geçirilir. Cihaz, düşük distorsiyon ile önemli ses basıncı içine çıkan voltaj bağımlı termal sinyalleri dönüştürür. Mekanik titreşimlerin bağlı ortak ses jeneratörleri, bir diyaframa gerek kalmadan sesi üretebileceği aksine bu cihaz, bu benzersizdir. Verici 20 160 kHz (Şekil 2) frekanslarda düz bir ses basınç düzeyi sergiler ve süresi, sıklığı ve ses basınç seviyesi 15, 18, ​​19 açısından çok doğru bir dijital kaydedilen fare USVs üretebilir.

Şekil 3 de gösterilen temsili bir deneyde ve_content ">, C57BL / 6 (B6) dişi BALB / c (BALB) arasında değişen erkek USVs ve arka plan gürültüsünü seçmesine izin verildi. Buna ek olarak, Şekil 4 ila B6 ve BALB kadın seçilmesini Bir BALB ve B6 erkek eş zamanlı USV kayıttan yürütme, bir önceki çalışmada bildirildiği gibi 14. erkek USVs özellikleri B6 arasında farklılık ve BALB 20 suşları. Bu sonuçlara göre, USVs çekiciliği mevcut protokolü ile değerlendirilebilir gösterildiği gibi, hangi sesler, canlı birey kaydedilen akustik analiz ve diğer bireylere çalınır.

Protokol

Tüm işlemler Azabu Üniversitesi Etik Kurulu tarafından kabul edildi. Bütün deneyler, bir ses geçirmez bir hücre içinde gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvan hazırlanması

  1. Kayıt için erkekler
    1. Çiftleşme yaşanan cinsel olgun erkek fareler edinin.
  2. Kadın Konular
    1. (- Eski 12 hafta genellikle 8) kafes başına 2 ila 5 littermates ile yer olan bakire dişi farelerin edinin.
    2. McLean 21 göre, test öncesi östrus siklusunun fazını belirlemek için günlük vajinal smear edinin. Bakım sahte gebeliği önlemek için vajinal stimülasyon en aza indirmek için önlemler alınmalıdır.
    3. Nelson 22 göre Giemsa ile leke leke ve varlığı ya da lökositler, kornifıye epitel hücreleri ve çekirdekli epitel hücrelerinin yokluğunda göre östrus döngüsü faz belirler.

2. Cihazlar (Şekil 1)

_content "> figure-protocol-957
Şekil İki seçenek Testi Box ve Cihazların 1. şematik. Fareler kendileri ve nötr bölge arasında bulunan küçük kapıdan odaları A ve B erişebilirsiniz. İki seçim kutusu ve iki ultrason yayıcılar bir ses geçirmez odasının zemininde yerleştirilir. Mikrofon ses geçirmez odasının içine askıya alınır. Kısaltma:. PC, kişisel bilgisayar bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Kayıt için
    1. Bir USB A / D dönüştürücüsü kullanılarak bir PC'ye ultrasonik kondansatör mikrofon bağlayın.
    2. "7" A / D dönüştürücüsü kazanç düzeyini ayarlayın.
    3. Ses yakalama yazılımı kullanarak 400 kHz örnekleme hızı ile 16-bit formatında dosyalar Tutanak akustik veriler.
  2. Oynatma için
    1. Bir D / kullanarak PC'ye bağlayın A dönüştürücüUSB arabirimi.
    2. Bir zayıflatıcı yoluyla D iki amplifikatörler / A dönüştürücü bağlayın. (Ikincisi cihaz aşırı önlemek için hizmet vermektedir.)
    3. Her amplifikatör ultrason yayıcı bağlayın.

3. USV Kayıt

  1. Yanağında bir 6 cm çapında delik ve 0.5 cm tel örgü ile kaplı delik olan bir bir küçük (17 x 10 x 11 cm) erkek fare veya orta ölçekli (21 x 14 x 13 cm) kafes yerleştirin. Orta ölçekli bir kafes kullanırken, alanını azaltmak için kafesin merkezi boyunca bir bölüm oluşturun.
  2. Kayıtları kirletebilir hışırtı sesleri önlemek için kafes içinde yatak kullanmayın.
  3. Örgü yanında bir mikrofon yerleştirin.
  4. Adım 2.1 gösterilen kayıt kurulumu ile ultrasonik seslendirme izleme başlayın.
  5. Erkek fare ile kafese ostrus veya diöstrüste ya bir cinsel olgun kadın fare yerleştirin.
  6. 5 dakika - 3 Kayıt USVs.

4. Test Kutusu

  1. Akrilik kurulu (Şekil 1) kullanarak test kutusu oluşturun.
    Not: (x 20 35 ve x 20 cm yüksek) üç bölümlerinde ayrılmıştır Test kutusu: nötr bölge (15 x 20 cm) ve odalar A ve B (20 x 10 cm, her biri). Odalar A ve B'nin her bir 0,5 cm tel örgü ile kaplıdır 4 cm çapında bir delik vardır. Delikler ve örgü nötr bölge ve odaların A ve B arasındaki odalar A ve B her iki ucunda olun kapıları (5 x 5 cm her) bulunur
  2. Ses kaçak Her örgü çevresinde kutuya onları mühürleme, lastik levhalar kullanılarak, örgü bakan tarafı hariç, her ultrason yayıcı izole önlemek için.
  3. Ses yalıtımı için odalar A ve B arasındaki duvarın her iki tarafında yerleştirin kurşun mühürler.

5. Ses Oynatma için hazırlanıyor

  1. Çalma Sounds Yaratılış
    1. Dijital ses düzenleme yazılımı kullanılarak kaydedilen dosyadan USV bir 20 saniye segmenti yakalayın.
    2. Seçin ve hiçbir arka plan yakalamaimkb 20 saniye USV segmenti dosyasından (0.35 sn). Gürültü segmenti tekrarlayarak 20 sn arka plan gürültü dosyası oluşturun.
    3. "Sol kulakta" ve diğer dosya için bir dosya ile tek bir stereo ses dosyası olarak dışa, aynı anda iki ses dosyalarını oynatmak için "sağ kulak."
    4. 40 kHz kesme gibi yüksek geçiren filtre kullanarak ses dosyalarını Filtre.
    5. Post-processing yazılımında gürültü azaltma aracı kullanarak gürültüyü azaltın. Seçin ve gürültü azaltma profilinde hiçbir USVs içeren dosyanın bir bölümünü yakalama ve seviye 40 ile gürültü azaltma çalıştırın.
  2. Çalma Sounds kalibrasyonu
    1. Ultrason yayıcılar ve mikrofon arasındaki boşluk 10 cm olduğundan emin olun.
    2. Ultrason yayıcılar gelen ses basınç seviyelerini kalibre etmek için, Adım 2.1 anlatılan yapılandırmayı kullanarak ultrasonik izleme gerçekleştirin. Desibel mikrofon (dB) ses basıncı seviyesini ölçün.
    3. Usizayıflatıcı ve amplifikatörler ng Adım 3 kaydedilen erkek USVs aynı ses basınç seviyesi ultrason yayıcılar tarafından oluşturulan USVs ses seviyesini ayarlamak.
    4. İki ultrason yayıcılar ve USVs ve arka plan gürültüsü oluşan bir ses dosyası kullanırken, iki ultrason yayıcılar davranış testi yapmadan önce bir kalibrasyon sesi (örneğin, 75 kHz saf ton) kullanarak aynı ses basınç seviyesi sergiler onaylayın.
    5. USVs iki akarsu oluşan bir ses dosyası üreten yaparken, testten önce, aynı seviyede iki üretilen ses basınç seviyelerini ayarlamak.

6. İki seçenekli test

  1. Test kutusunun kafes arkasında ultrason yayıcılar yerleştirin.
  2. Akrilik kurulu ile oda A ve B kapıları kapatın ve 30 dakika boyunca nötr bölgeye dişi konuyu alıştırarak. Fare kaçabilir önlemek için akrilik kurulu ile kutuyu örtün.
  3. Bir CC kullanarak video kaydını başlatmakD kamera kutusunun üzerinde monte edilmiş. Fotoğraf makinesi (değil, Şekil 1 'de gösterilen) her üç bölmeden alanı kaplamaktadır.
  4. Kapıyı ve kapak kartını çıkarın ve kadın ses bölgeleri de dahil olmak üzere serbestçe deney kutusu, keşfetmenizi sağlayacak.
  5. Kadın hem de kafesleri araştırmış ve nötr bölgeye geri döndü sonra, 5 ya da 10 dakika boyunca art arda 20 sn ses dosyası oynamaya başlayın.
  6. 5 veya 10 dakika boyunca davranışsal izleme yapıyoruz.
  7. Önceki konudan biriken istenmeyen koku ipuçları azaltmak% 70 etanol ile testler arasındaki deney kafesleri temizlemek için.
  8. Ultrason yayıcılar A yerini Anahtarı ve B rastgele odaları A veya B yönünde içsel bir yan etkisini önlemek için önyargı

7. İstatistiksel Analizler

  1. Aşağıdaki parametreleri analiz, davranışsal olay puanlama yazılımı kullanarak: Her odada kayıtlarının toplam sayısını; Her orta bölgesinde toplam kalış süresi; Her ses bölgedeki toplam kalış süresi; veultrason vericisinin önünde her örgü arama toplam süresi. Şekil 1 "orta bölge" ve ne anlama geldiğini göstermektedir "sesi bölge."
    Not: durumlarda fare iki bölge arasında bir ayrım çizgisinin (Şekil 1, kesikli çizgi), başın yönüne göre karar vermeden kalır burada. Baş örgü tarafı karşı karşıya, bu ses bölgesinde kalmak olarak puanlanır.
  2. Her davranış parametre için, 0.05 anlamlılık düzeyinde odalar A yanıtları ve B bir Wilcoxon signed-rank testi kullanılarak, ya da eşleştirilmiş t-test karşılaştırın.

Sonuçlar

USVs Şekil 3'te gösterilen tipik bir deneyde ses çalma olarak kullanıldı, bir BALB-erkek (20 saniyede 161 hece), hem de arka plan gürültü kaydedilir. Bu deneyde, 7 dişi B6 fareler 9 haftalık oldukları zaman kullanıldı . Sesleri oynatmak için kadın yanıtın test en süresini belirlemek için, davranışsal parametreler toplam 10 dk testi zaman ilk ve son beş dakika için ayrı ayrı analiz edildi.

Birincisi, hiçbir yan bias.The sonuçları da arkaplan g?...

Tartışmalar

Here, the results of a representative test showed that female mice can discriminate between artificial male USVs and background noise (Figure 3). The conclusion to be drawn from these results is that the discrimination signal is reflected in the duration of stay in the room and sound zone, and in the duration of searching the mesh in the first 5 min of testing, but not in the second 5 min (Figure 3C, E and F). These data indicate that mice become habituated to the playback sounds, possib...

Açıklamalar

The authors declare that they have no competing interests.

Teşekkürler

Bu çalışma ile desteklenmiştir Hibe-Aid AA'ya JSPS Fellows için; Hibeler-in-Aid Bilimsel Araştırmalar JSPS Fellows Yenilikçi Alanları (No. 4501 ve No. 25132712) TK üzerine tarafından; ve Azabu Üniversitesi. Şekil 2 tarafından verilen bir araştırma projesi hibe ile Kihara, T., Harada, T., ve Koshida, N. Gofret-uyumlu imalat ve nanokristal silikon ısının neden ultrason yayıcılar özellikleri yeniden basıldı edilir. Sensörler ve Aktüatörler A: Fiziksel, hacim 125, Elsevier, s. 426, (2006), Elsevier izniyle.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Soundproof chamberMuromachi Kikai
Small cageCLEA JapanCL-0113-1
Middle cageCLEA JapanCL-0103-1
Ultrasound condenser microphonesAvisoft BioacousticsCM16/CMPA
A/D converterAvisoft BioacousticsUltraSoundGate116H
Audio softwareAvisoft BioacousticsRECORDER USGH
Adobe Audition 3.0 / Audio editing softwareAdobe SystemsAdobe Audition 3.0
Nc-Si emitterOriginalnot commercially available but it is planned to be so in near future
D/A converterNational InstrumentsNI USB-6251 BNC
AttenuatorOriginal
AmplifierYamatake
PCWindows 7 professionalIntel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system
Event recorder Excel-macro / Event-scoring softwareoriginalProgrammed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto
CCD Camera
Rubber plates (made of elastomer resin)Tokyo bouonTI-75BK B4Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3
Giemsa's azur eosin methylene blue solutionMerck Millipore1.09204.0500

Referanslar

  1. Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PLoS One. 2 (4), e351 (2007).
  2. Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T+tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10 (1), 44-56 (2010).
  3. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
  4. Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PLoS One. 9 (5), e97244 (2014).
  5. Amato, F. R., Moles, A. Ultrasonic vocalizations as an index of social memory in female mice. Behav. Neurosci. 115 (4), 834-840 (2001).
  6. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
  7. Ehret, G. Infant rodent ultrasounds–a gate to the understanding of sound communication. Behav. Genet. 35 (1), 19-29 (2005).
  8. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (1), e386 (2005).
  9. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46 (1), 28-34 (2007).
  10. Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136 (6), 3401 (2014).
  11. Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PLoS One. 9 (1), e85405 (2014).
  12. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic ‘songs’ with approach behaviour. Biol. Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
  13. Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice, Mus musculus musculus. Anim. Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
  14. Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in iice. PloS one. 9 (2), e87186 (2014).
  15. Uematsu, A., et al. Maternal approaches to pup ultrasonic vocalizations produced by a nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitter. Brain Res. 1163, 91-99 (2007).
  16. Okabe, S., et al. The effects of social experience and gonadal hormones on retrieving behavior of mice and their responses to pup ultrasonic vocalizations. Zoolog. Sci. 27 (10), 790-795 (2010).
  17. Okabe, S., et al. Pup odor and ultrasonic vocalizations synergistically stimulate maternal attention in mice. Behav. Neurosci. 127 (3), 432-438 (2013).
  18. Shinoda, H., Nakajima, T., Ueno, K., Koshida, N. Thermally induced ultrasonic emission from porous silicon. Nature. 400 (6747), 853-855 (1999).
  19. Kihara, T., Harada, T., Koshida, N. Wafer-compatible fabrication and characteristics of nanocrystalline silicon thermally induced ultrasound emitters. Sensor. Actuat. A-Phys. 125 (2), 422-428 (2006).
  20. Kikusui, T., et al. Cross fostering experiments suggest that mice songs are innate. PloS One. 6 (3), e17721 (2011).
  21. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389 (2012).
  22. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  23. Tomihara, K., et al. Effect of ER-beta gene disruption on estrogenic regulation of anxiety in female mice. Physiol. Behav. 96 (2), 300-306 (2009).
  24. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R. Hearing loss associated with the modifier of deaf waddler (mdfw) locus corresponds with age-related hearing loss in 12 inbred strains of mice. Hear. Res. 154 (1-2), 45-53 (2001).
  25. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  26. Grimsley, J. M., Monaghan, J. J., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PLoS One. 6 (3), e17460 (2011).
  27. Sugimoto, H., et al. A role for strain differences in waveforms of ultrasonic vocalizations during male-female interaction. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  28. Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PLoS One. 7 (7), e40782 (2012).
  29. Wang, H., Liang, S., Burgdorf, J., Wess, J., Yeomans, J. Ultrasonic vocalizations induced by sex and amphetamine in M2, M4, M5 muscarinic and D2 dopamine receptor knockout mice. PLoS One. 3 (4), (2008).
  30. Moles, A., Kieffer, B. L., D'Amato, F. R. Deficit in attachment behavior in mice lacking the mu-opioid receptor gene. Science. 304 (5679), 1983-1986 (2004).
  31. Hiramoto, T., et al. Tbx1: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse. Hum. Mol. Genet. 20 (24), 4775-4785 (2011).
  32. Ey, E., et al. Absence of deficits in social behaviors and ultrasonic vocalizations in later generations of mice lacking neuroligin4. Genes Brain Behav. , (2012).
  33. Roy, S., Watkins, N., Heck, D. Comprehensive analysis of ultrasonic vocalizations in a mouse model of fragile X syndrome reveals limited, call type specific deficits. PLoS One. 7 (9), e44816 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

DavranSay 103Ultrasonik seslendirmeMate se imicinsel se imsosyal tan mayavru izolasyon a rBALB c fareleriC57BL 6 farelerultrason yay c

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır