저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

Ultrasonic vocalizations (USVs) in mice differ depending on age, sex, condition, and genetic background. Using two ultrasound emitters broadcasting simultaneously in different locations, this two-choice test can evaluate murine recognition and preference responses to different characteristics of USVs.

초록

Mice emit ultrasonic vocalizations (USVs) during a variety of conditions, such as pup isolation and adult social interactions. These USVs differ with age, sex, condition, and genetic background of the emitting animal. Although many studies have characterized these differences, whether receiver mice can discriminate among objectively different USVs and show preferences for particular sound traits remains to be elucidated. To determine whether mice can discriminate between different characteristics of USVs, a playback experiment was developed recently, in which preference responses of mice to two different USVs could be evaluated in the form of a place preference.

First, USVs from mice were recorded. Then, the recorded USVs were edited, trimmed accordingly, and exported as stereophonic sound files. Next, the USV amplitudes generated by the two ultrasound emitters used in the experiment were adjusted to the same sound pressure level. Nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitters were used to play the USVs back. Finally, to investigate the preference of subject mice to selected USVs, pairs of two differing USV signals were played back simultaneously in a two-choice test box. By repeatedly entering a defined zone near an ultrasound emitter and searching the wire mesh in front of the emitter, the mouse reveals its preference for one sound over another. This model allows comparing the attractiveness of the various features of mouse USVs, in various contexts.

서문

많은 동물 종자 간 통신을위한 발성을 사용합니다. 마우스 뮤스의 musculus에서 통신 신호의 하나의 중요한 유형은 20 kHz의보다 높은 주파수가 초음파 발성 (USVs)이다. 마우스에 의해 방출 USVs는 남성 여성, 1-4 여성 - 여성 1, 5, 남성 - 남성 (1), (6) 상호 작용의 사회 인식의 구성 요소로 간주됩니다. USVs는 그녀의 강아지 - 검색 행동을 증가 어머니로부터 분리되는 경우도 새끼에 의해 방출, 따라서 생존 7 강아지 있습니다. 많은 보고서가 적은 10에 설명 된 분석 마우스 USVs 8, 9, 행동 반응 및 수신 동물의 신경 메커니즘을 분류하고 있지만 11. 후자 USVs의 다양한 특성의 생물학적 의미를 명확하게 할 필요가있다. 이러한 메커니즘을 나타 내기 위해, 재생 실험 효율적인 방법이다. 최근 재생 연구는 여성의 것으로 밝혀졌다마우스는 USVs (12)에 매료되어, 그들은 그들의 부모 (13), (14)에서 다른 남성에서 USVs을 선호.

이 문서에서는 마우스의 USV 환경을 평가하는 데 사용되는 재생 테스트를 설명합니다. 두 선택 테스트 박스가도 1에 도시 된 두 개의 다른 USVs는 테스트 케이스의 두 구획을 동시에 재생할 수있는 개발되었다. 시험 상자의이 유형은 세 개의 서브 - 챔버에서 검사 영역을 분할하여 음성 오염을 방지 납 벽을 사용하여. 초음파 방출은 각 객실 외부에 있습니다. 객실과 초음파 이미 터 사이의 벽에서 철망으로 덮여 구멍이 있습니다. 마우스는 3 방에서 자유롭게 이동하고, 초음파 에미 터에 의해 재생 USVs에 응답하는 것처럼, "메시 검색"동작을 보여줄 수있다. 이 시험에서, 생쥐는 하나의 사운드 이미 터 또는 서로 근접 상이한 지속 기간까지. 이러한 매개 변수는 민감한 measu를 얻을 기록 할 수 있습니다 사운드 환경 설정의 재.

다시 USVs를 재생하려면, 나노 결정 실리콘 열 음향 방출 (즉, "NC-시 터")는 이전의 연구 15-17에서 사용 하였다. 이러한 장치는 박막 가열기 전극, 나노 다공성 실리콘 층과 단결정 실리콘 웨이퍼로 구성된다. 디지털 사운드 파일을 아날로그 신호로 변환 한 후 히터 전극을 통과한다. 장치는 낮은 왜곡과 상당한 음압으로 인한 전위 의존성 열 신호를 변환한다. 기계적 진동에 의존하는 일반적인 소리 발생기,이 진동판의 필요없이 음향을 재생 달리이 장치는 점에서 독특하다. 이미 터 (20)로부터 160 kHz에서 (도 2)까지의 주파수에서 평면 음압 레벨을 나타내고, 그리고 시간, 주파수 및 음압 레벨 15, 18, ​​19의 측면에서 매우 정확하게 디지털 기록 뮤린 USVs를 재생할 수있다.

도 3에 도시 된 대표적인 실험에서 ve_content은 ">, C57BL / 6 (B6) 암컷 BALB / C (BALB) 사이 남성 USVs 및 배경 잡음을 선택하는 것이 허용되었다. 또한,도 4는 사이 B6 및 BALB 암컷의 선택을 도시 BALB 및 B6 남성에서 동시 USV의 플레이는 이전의 연구에서보고 된 14. 남성 USVs의 특성은 B6 사이의 차이와 BALB 20 종자. 이러한 결과에 의해, USVs의 매력은 본 프로토콜로 평가 될 수있다 바와 같이, 하는 소리, 라이브 개인으로부터 기록 된 음향 분석 및 기타 개인 재생됩니다.

프로토콜

모든 절차가 아자 부 대학의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 모든 실험은 방음 실에서 실시 하였다.

1. 동물 준비

  1. 녹음을위한 남성
    1. 짝짓기 경험이 성적으로 성숙한 수컷 마우스를 가져옵니다.
  2. 여성 주제
    1. (- 오래된 12 주 보통 8) 케이지 당 2-5 한배 새끼와 함께 보관 된 처녀 암컷 마우스를 가져옵니다.
    2. 매 클린 (21)에 따라, 검사 전 발정주기의 위상을 결정하기 위해 매일 질 얼룩을 얻습니다. 주의 pseudopregnancy 않도록 질 자극을 최소화하기 위해주의해야한다.
    3. 넬슨 (22)에있어서, 김사와 얼룩 얼룩 및 존재 또는 백혈구, 각질화 된 상피 세포, 상피 세포 및 핵의 유무에 기초하여 발정주기의 위상을 결정한다.

2. 장치 (그림 1)

_content "> figure-protocol-579
그림 두 선택 테스트 상자 및 장치의 도식. 마우스는 그들과 중립 지역 ​​사이에있는 작은 문을 통해 방 A와 B에 액세스 할 수 있습니다. 두 선택 상자와 두 초음파 방사체는 방음 실의 바닥에 배치된다. 마이크는 방음 실 내부에 일시 중단됩니다. 약기 :. PC, 개인용 컴퓨터 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 기록
    1. USB의 A / D 컨버터를 이용하여 PC에 초음파 콘덴서 마이크로폰을 연결한다.
    2. "7"에 대한 A / D 컨버터의 이득 레벨을 설정한다.
    3. 오디오 캡처 소프트웨어를 사용하여 400 kHz의 샘플링 레이트를 갖는 16 비트 포맷 파일의 레코드 데이터 탄성.
  2. 재생
    1. D / 사용하여 PC에 컨버터를 연결USB 인터페이스.
    2. 감쇠기를 통해 D에 두 앰프 / A 컨버터를 연결합니다. (후자의 디바이스는 과부하를 방지하는 역할을한다.)
    3. 각 앰프에 초음파 이미 터를 연결합니다.

3. USV 기록

  1. 측벽에 6cm 직경의 구멍과 0.5 CM 철망으로 덮여 구멍에 소형 (17 × 10 X 11cm)에 남성 마우스 또는 중간 크기 (21 X 14 X 13cm) 케이지를 놓습니다. 중형 케이지를 사용할 때, 면적을 감소시키는 케이지의 중심을 가로 질러 파티션을 구성.
  2. 녹음을 오염시킬 수 부스럭 거리는 소음을 방지하기 위해 새장에 침대를 사용하지 마십시오.
  3. 메시 옆에 마이크를 배치합니다.
  4. 2.1 단계에 표시된 녹화 설정과 초음파 발성 모니터링을 시작합니다.
  5. 남성 마우스와 케이지에 metestrus 또는 diestrus 중 하나의 성적으로 성숙한 여성 마우스를 놓습니다.
  6. 5 분 - 3 녹음 USVs.

4. TEST 박스

  1. 아크릴 보드 (그림 1)를 사용하여 테스트 상자를 구축 할 수 있습니다.
    참고 : (× 20 ​​(35), 및 X 20cm 높이)를 세 구획으로 나누어 져 시험 상자 : 중립 지역 (15 X 20cm), 객실 A와 B (20 × 10cm, 각각). 방 및 B는 각각 0.5 ㎝ 철망으로 덮여 4cm 직경 홀을 갖는다. 구멍 메시는 중립 지역 및 객실 A와 B 사이의 객실 A와 B의 각 끝에 확인 게이트 (5 × 5cm 각)에 위치
  2. 사운드 누설은 각 메시의 둘레 상자로 밀봉 고무 플레이트를 사용하여, 메쉬에 대향 측면을 제외한 각 초음파 방사기를 절연 방지한다.
  3. 방음을위한 객실 A와 B 사이의 벽의 양쪽에 배치 리드 씰.

5. 사운드 재생을위한 준비

  1. 재생 사운드의 창조
    1. 디지털 오디오 편집 소프트웨어를 사용하여 기록 된 파일로부터 USV의 20 초 세그먼트를 캡처.
    2. 선택하지 않고 배경을 캡처이세 20 초 USV 세그먼트 파일에서 (0.35 초). 소음 세그먼트를 반복하여 20 초 배경 잡음 파일을 만듭니다.
    3. "왼쪽 귀"를 위해 다른 파일을 하나의 파일로, 하나의 스테레오 사운드 파일로 내보낼, 동시에 두 개의 사운드 파일을 재생하려면 "오른쪽 귀."
    4. 40 kHz의 컷오프와 같은 고역 통과 필터를 사용하여 사운드 파일을 필터링.
    5. 후 처리 소프트웨어의 노이즈 감소 도구를 사용하여 소음을 줄일 수 있습니다. 선택하고 노이즈 감소 프로파일과 더 USVs가없는 파일의 세그먼트를 캡처하고, 40 레벨과 노이즈 감소를 실행합니다.
  2. 재생 사운드의 교정
    1. 초음파 이미 터와 마이크 사이의 공간이 10cm 있는지 확인합니다.
    2. 에미 터에서 초음파의 음압 레벨을 교정하는 단계 2.1에 기재된 구성을 사용하여 초음파 모니터링을 수행한다. 데시벨 마이크 (dB)로 음압 레벨을 측정합니다.
    3. USI감쇠기 및 증폭기 겨, 3 단계에서 기록한 남성 USVs 동일한 음압 레벨 초음파 에미 터에 의해 발생 USVs의 볼륨을 조정한다.
    4. 두 초음파 에미 터 및 USVs 및 배경 잡음으로 구성된 사운드 파일을 사용하는 경우, 두 초음파 방출기 행동 시험을 수행하기 전에 보정 사운드 (예를 들어, 75 kHz의 순음)를 사용하여 동일한 음압 레벨을 나타내는 것을 확인한다.
    5. USVs 두 스트림으로 구성된 사운드 파일을 재생하는 경우, 실험 전에, 동일한 레벨로 생성 된 두 음압 레벨을 조정한다.

6. 두 선택 테스트

  1. 시험 상자의 메쉬 뒤에 초음파 이미 터를 놓습니다.
  2. 아크릴 보드와 함께 객실 A와 B에 문을 닫고 30 분 동안 중립 영역에 여성의 주제를 길들. 마우스를 탈출 할 수있는 방지하기 위해 아크릴 보드 상자를 커버.
  3. CC를 사용하여 비디오 녹화를 시작합니다D 카메라는 상자 위에 장착. 카메라 (하지 그림 1)은 세 개의 구획의 영역을 다루고 있습니다.
  4. 게이트와 커버 보드를 제거하고 여성의 사운드 영역을 포함하여 자유롭게 테스트 상자를 탐색 할 수 있습니다.
  5. 여성 모두 메쉬를 조사하였으며, 중성 영역으로 돌아 오면, 5 또는 10 분 동안 20 초 반복 사운드 파일을 재생 시작한다.
  6. 5 또는 10 분 동안 행동 모니터링을 실시한다.
  7. 이전 대상에서 침착 원하지 않는 후각 신호를 감소 70 % 에탄올과 시험 사이의 테스트 새장을 청소합니다.
  8. 초음파의 이미 터의 위치를​​ 랜덤하게 전환 B 실 또는 B. 향해 고유 측 바이어스 효과를 피하기

7. 통계 분석

  1. 다음 매개 변수를 분석, 행동 이벤트 득점 소프트웨어를 사용하여 각 방에있는 항목의 총 수를; 각각의 중간 영역에서 체류 전체 기간; 각 사운드 영역에서 체류 전체 기간; 과초음파 방출의 앞에 각 메시의 검색의 총 시간. 그림 1은 "중간 영역"과 무엇을 의미하는지 설명 "사운드 영역을 설정합니다."
    참고 경우 마우스 두 영역 사이의 분할 선 (도 1, 점선)의 머리 방향으로의 위치 결정을 유지한다. 헤드 측 메시에 직면했을 때, 그것은 사운드 존에서 머물 얻었된다.
  2. 각각의 행동 매개 변수에 대해 0.05의 유의 수준을 갖춘 객실에 대한 반응과 B 윌 콕슨 부호 순위 테스트를 사용하여, 또는 쌍 T의 -tests를 비교합니다.

결과

USVs는도 3에 도시 된 대표적인 실험에서 사운드 재생으로 사용 하였다 한 BALB-남성 (20 초 당 161 음절)뿐만 아니라 배경 잡음에서 기록 하였다.이 실험에서, 7 여성 B6 마우스는 9 주령에 사용 하였다 . 사운드를 재생하기 위해 여성의 응답 테스트의 가장 시간을 결정하기 위해, 행동 파라미터는 총 10 분의 시험 시간의 처음과 마지막 다섯 분 동안 별도로 분석 하였다.

토론

Here, the results of a representative test showed that female mice can discriminate between artificial male USVs and background noise (Figure 3). The conclusion to be drawn from these results is that the discrimination signal is reflected in the duration of stay in the room and sound zone, and in the duration of searching the mesh in the first 5 min of testing, but not in the second 5 min (Figure 3C, E and F). These data indicate that mice become habituated to the playback sounds, possib...

공개

The authors declare that they have no competing interests.

감사의 말

이 작품은에 의해 지원되었다 그랜트 - 에이드에서 AA에 JSPS 휄로우; 보조금 인 원조 과학 연구에 대한 JSPS 휄로우위한 혁신적인 분야 (제 4501 호 및 제 25132712) TK에에 의해; 와 아자 부 대학. 그림 2에 의해 수여 연구 프로젝트 부여하여 키하라, 토니, 하라다, T., Koshida, N. 웨이퍼 호환 제조 및 나노 결정 실리콘 열 유도 초음파 이미 터의 특성에서 다시 인쇄됩니다. 센서 및 액추에이터 :에서 물리적 볼륨 (125), 엘스 비어, P. (426), (2006), 엘스 비어의 허가.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Soundproof chamberMuromachi Kikai
Small cageCLEA JapanCL-0113-1
Middle cageCLEA JapanCL-0103-1
Ultrasound condenser microphonesAvisoft BioacousticsCM16/CMPA
A/D converterAvisoft BioacousticsUltraSoundGate116H
Audio softwareAvisoft BioacousticsRECORDER USGH
Adobe Audition 3.0 / Audio editing softwareAdobe SystemsAdobe Audition 3.0
Nc-Si emitterOriginalnot commercially available but it is planned to be so in near future
D/A converterNational InstrumentsNI USB-6251 BNC
AttenuatorOriginal
AmplifierYamatake
PCWindows 7 professionalIntel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system
Event recorder Excel-macro / Event-scoring softwareoriginalProgrammed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto
CCD Camera
Rubber plates (made of elastomer resin)Tokyo bouonTI-75BK B4Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3
Giemsa's azur eosin methylene blue solutionMerck Millipore1.09204.0500

참고문헌

  1. Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PLoS One. 2 (4), e351 (2007).
  2. Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T+tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10 (1), 44-56 (2010).
  3. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
  4. Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PLoS One. 9 (5), e97244 (2014).
  5. Amato, F. R., Moles, A. Ultrasonic vocalizations as an index of social memory in female mice. Behav. Neurosci. 115 (4), 834-840 (2001).
  6. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
  7. Ehret, G. Infant rodent ultrasounds–a gate to the understanding of sound communication. Behav. Genet. 35 (1), 19-29 (2005).
  8. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (1), e386 (2005).
  9. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46 (1), 28-34 (2007).
  10. Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136 (6), 3401 (2014).
  11. Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PLoS One. 9 (1), e85405 (2014).
  12. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic ‘songs’ with approach behaviour. Biol. Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
  13. Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice, Mus musculus musculus. Anim. Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
  14. Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in iice. PloS one. 9 (2), e87186 (2014).
  15. Uematsu, A., et al. Maternal approaches to pup ultrasonic vocalizations produced by a nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitter. Brain Res. 1163, 91-99 (2007).
  16. Okabe, S., et al. The effects of social experience and gonadal hormones on retrieving behavior of mice and their responses to pup ultrasonic vocalizations. Zoolog. Sci. 27 (10), 790-795 (2010).
  17. Okabe, S., et al. Pup odor and ultrasonic vocalizations synergistically stimulate maternal attention in mice. Behav. Neurosci. 127 (3), 432-438 (2013).
  18. Shinoda, H., Nakajima, T., Ueno, K., Koshida, N. Thermally induced ultrasonic emission from porous silicon. Nature. 400 (6747), 853-855 (1999).
  19. Kihara, T., Harada, T., Koshida, N. Wafer-compatible fabrication and characteristics of nanocrystalline silicon thermally induced ultrasound emitters. Sensor. Actuat. A-Phys. 125 (2), 422-428 (2006).
  20. Kikusui, T., et al. Cross fostering experiments suggest that mice songs are innate. PloS One. 6 (3), e17721 (2011).
  21. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389 (2012).
  22. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  23. Tomihara, K., et al. Effect of ER-beta gene disruption on estrogenic regulation of anxiety in female mice. Physiol. Behav. 96 (2), 300-306 (2009).
  24. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R. Hearing loss associated with the modifier of deaf waddler (mdfw) locus corresponds with age-related hearing loss in 12 inbred strains of mice. Hear. Res. 154 (1-2), 45-53 (2001).
  25. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  26. Grimsley, J. M., Monaghan, J. J., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PLoS One. 6 (3), e17460 (2011).
  27. Sugimoto, H., et al. A role for strain differences in waveforms of ultrasonic vocalizations during male-female interaction. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  28. Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PLoS One. 7 (7), e40782 (2012).
  29. Wang, H., Liang, S., Burgdorf, J., Wess, J., Yeomans, J. Ultrasonic vocalizations induced by sex and amphetamine in M2, M4, M5 muscarinic and D2 dopamine receptor knockout mice. PLoS One. 3 (4), (2008).
  30. Moles, A., Kieffer, B. L., D'Amato, F. R. Deficit in attachment behavior in mice lacking the mu-opioid receptor gene. Science. 304 (5679), 1983-1986 (2004).
  31. Hiramoto, T., et al. Tbx1: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse. Hum. Mol. Genet. 20 (24), 4775-4785 (2011).
  32. Ey, E., et al. Absence of deficits in social behaviors and ultrasonic vocalizations in later generations of mice lacking neuroligin4. Genes Brain Behav. , (2012).
  33. Roy, S., Watkins, N., Heck, D. Comprehensive analysis of ultrasonic vocalizations in a mouse model of fragile X syndrome reveals limited, call type specific deficits. PLoS One. 7 (9), e44816 (2012).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

103BALB cC57BL 6

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유