A citometria de fluxo para avaliar o estado de cromatina em células T

Resumo

A citometria de fluxo pode ser utilizado para avaliar o estado da cromatina nas células T. Este protocolo permite que os cientistas interpretar evidência de descondensação da cromatina durante a activação das células T demonstrou por um aumento na intensidade de fluorescência média (IFM) de anticorpos fluorescentes Histona H3

Resumo

Durante uma resposta imunitária adequada, as células T em repouso, tornam-se activas sobre a apresentação do antigénio ao seu receptor de células T específico para o antigénio. Isto leva a proliferação clonal de células T apenas aquelas que levam um receptor que reconhece o antigénio. Descondensação da cromatina é uma indicação da activação de células T e é necessária para as células T a adquirir a capacidade de proliferar após acoplamento antigénio. Esta mudança na condensação da cromatina pode ser detectada utilizando anticorpos criados contra as proteínas de histona. Estes anticorpos não podem se ligar aos seus epitopos em células T naive, assim como eles podem, em células T ativadas. Nós descrevemos como manchar simultaneamente específicos de células T, marcadores de superfície viabilidade pista com uma mancha de células mortas solucionáveis, e medir o estado de cromatina via coloração intracelular de proteínas histona H3. As células coradas foram analisadas por citometria de fluxo e estado condensação da cromatina é medida como a intensidade média da fluorescência (IMF) de a mancha Histona H3. Chromatna descondensação durante a activação da célula T é demonstrada como um aumento do MFI

Introdução

Citometria de fluxo é uma tecnologia baseada em laser desenvolvido para a análise de múltiplos parâmetros físicos e em populações de células fluorescentes. Esta tecnologia funciona como células suspensas numa corrente de fluido de encontro um laser, marcadores fluorescentes excitantes sobre ou no interior das células. Estes marcadores então emitir luz que é detectada e quantificada por tubos fotomultiplicadores. Enquanto citometria de fluxo tem sido tradicionalmente usado para identificar populações de células, que tem provado ser uma tecnologia útil quando se estuda uma matriz de propriedades de células, incluindo a integridade da membrana celular, interacções proteína-proteína e proteína tráfico ^1-3. Nós desenvolvemos um protocolo que permite que esta tecnologia a ser utilizada para detectar o estado da cromatina em células T como eles são activados in vitro ^4. Temos também utilizado este protocolo para investigar o mecanismo de ativação induzida cromatina descondensação de células T ^5.

T activatio celularn e proliferação são críticos para uma resposta imunitária adequada. As células T, um subconjunto de linfócitos específicos dentro do sistema imune, são necessárias para as respostas imunitárias adequadas e o desenvolvimento de memória imunológica. A activação é iniciada quando um antigénio é apresentado no contexto do complexo principal de compatibilidade com o receptor de células T (TCR), localizado na superfície extracelular das células T quiescentes (revisto em ^6). Isto desencadeia uma série de acontecimentos moleculares dinâmicas e altamente ordenados dentro de células T que culminam num aumento da concentração intracelular de Ca2 + ⁷ e a translocação nuclear de factores de transcrição necessários para a activação (revisto em ^8-10). Uma vez activadas, as células T ganhar a capacidade para responder a Interleucina-2 (IL-2), um factor de crescimento potente que utiliza a JAK (Janus Kinase) / STAT (sinal do transdutor e activador da transcrição) via para conduzir a proliferação clonal de T activadas ¹¹ células. Resumidamente, a IL-2 estimulaçãoresulta na fosforilação de proteínas STAT, uma família de factores de transcrição latentes citosólicas. Uma vez fosforilada, as proteínas STAT dimerizar, translocar para o núcleo e dirigir a expressão de genes, incluindo os envolvidos na progressão do ciclo celular. Em células T, a IL-2 através de sinais de STAT5, que é necessário para a proliferação de células T ^12,13.

A fim de alcançar a expansão clonal de células T activadas, as células que não sofreram antigénio-TCR acoplamento (células T naive), deve ter um mecanismo para ignorar os efeitos potentes da IL-2. Isto é conseguido através da regulação do estado de cromatina. Células T naive possuir um cromatina condensada que proíbe acoplamento ADN-STAT5 em resposta à estimulação de IL-2. Após a ativação, decondenses cromatina e STAT5 pode acessar os promotores dos genes-alvo, permitindo a proliferação clonal ^4. Curiosamente, esta mudança de status da cromatina não é dependente de modificação epigenética de histona proteins (para revisão, ver ¹⁴⁾ como observamos nenhuma mudança global na modificação das histonas durante a ativação das células T ^4.

Durante a realização destes estudos, descobrimos que os anticorpos produzidos contra proteínas histonas também tiveram dificuldade em acessar seus epitopos em células ingênuo, mas que após a ativação poderia mais facilmente vincular os seus epítopos ^4. Assim, a ligação do anticorpo para histonas serve como uma leitura para o estado de condensação da cromatina. Aqui apresenta-se a método para utilizar a citometria de fluxo para detectar anticorpos Histona H3 fluorescente conjugada, a fim de avaliar o estado da cromatina nas células T. Condensação da cromatina numa população de células é medido como a intensidade média de fluorescência (IMF) de Histona H3 coloração. No contexto da activação das células T, o MFI de Histona H3 de coloração aumenta, significando a descondensação de cromatina. Além de medir o estado da cromatina via intracelular coloração histona H3, este protocolo também Incorporates superfície coloração e uma mancha solucionáveis ​​por células vivas, que permitam uma análise de subpopulações de células.

Protocolo

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo animal foi aprovada pelo (número Permit: A3242-01) Comitê Animal Care Institucional e Use Universidade Furman. Todos os materiais e equipamento utilizados no presente protocolo podem ser encontrados na Tabela de materiais e equipamentos, enquanto que os tampões usados ​​podem ser encontrados na Tabela de tampões e soluções.

1. suspensão única célula de linfócitos de rato baços

1. Sacrifício camundongos através de _asfixia com CO2. Confirme a eutanásia por deslocamento cervical.
   Nota: Use os baços de dois 6-8 semanas de idade camundongos isogênicos (por exemplo, C57B / 6) do mesmo sexo. Tipicamente, dois baços são processados.
2. Pulverize os animais profusamente com uma solução de etanol a 70% e orientar de modo que a cabeça está virada para a esquerda.
3. Usando fórceps, levantar a pele do animal para cima e para fora a partir de tele corpo. Com uma tesoura, um pequeno entalhe cortado através da pele perto do abdómen do animal. Utilizando os dedos, puxam-se os lados do entalhe para expor o peritoneu do pescoço para o início das patas traseiras. O baço deve ser visível diretamente abaixo do peritônio.
4. Usando fórceps, levantar o peritoneu e fazer uma pequena incisão para expor o baço. Remover o baço com uma pinça e usar a tesoura para arreliar fora qualquer adiposo e tecido conjuntivo.
5. Colocar o baço em um tubo de 50 ml contendo 10 ml de PBS suplementado com 2% de Soro Fetal Bovino (daqui em diante referida como PBS + 2%). Mantenha o tubo em gelo até estar pronto para iniciar a suspensão de células individuais.
   Nota: A recuperação típica é de entre 60-90 milhões de células por baço, e tipicamente, são necessários 2 milhões de células por amostra. Realiza todas as seguintes etapas em um capuz de cultura de tecidos.
6. Decantar os baços em uma estéril 100 mm prato de cultura de tecidos.
7. Obter duas lâminas de microscópio fosco e segure tele desliza de modo que as duas superfícies viradas para dentro fosco em bruto em direcção um ao outro. Molhar as lâminas na + 2% de solução PBS derramado na placa de Petri.
8. Segurar o baço entre as superfícies foscas das lâminas, com as bordas ainda submersas, e moer suavemente o baço, movendo as lâminas e para trás de encontro uns aos outros (Figura 1A). As células vão cair na placa de Petri. Continue moagem até que todas as células foram liberados e os restos do baço aparecem em branco (Figura 1B).
9. Desenha-se a suspensão de células em uma pipeta e filtrá-la lentamente através de um filtro de 70 um para um novo tubo de 50 ml estéril cónico. Note-se que pequenas pedaços de polpa vermelha estará presente no filtro (Figura 2A).
   1. Se o filtro sobe, levante suavemente-lo um pouco para permitir que o líquido escorrer através de e coloque o filtro de volta no tubo de 50 ml e continuar, repetindo este processo conforme necessário. Se o processamento de mais de 5 spleens, pode ser necessário dividir-se em dois lotes e utilizar um filtro para cada novo.
10. Usando a parte de batente de uma seringa de 3 ml de pressionar suavemente a polpa vermelha contendo as restantes células através do filtro (Figura 2B). Certifique-se de pressionar a parte inferior do filtro ambos os lados e para assegurar que toda a polpa vermelha passou através do filtro (Figura 2C).
11. Adicionar 10 mlof PBS + 2% para a cultura de tecidos prato e usar isso para lavar o slides, seringa rolha, e prato para recuperar as células restantes. Passe esta através do mesmo filtro de células 70 mm no tubo cônico de 50 mL. Repita este passo, conforme necessário.
12. Centrifugar a suspensão de células filtrada a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
13. Gentilmente decantar e desprezar o sobrenadante, cuidado para não perturbar o sedimento. Uma quantidade vestigial de PBS + 2% será deixado no tubo. Tapar o tubo e apertar o sedimento até o pelete é ressuspenso completamente.
14. Lisar glóbulos vermelhos por anúncioDing 2 mL de ACK Tampão de Lise (0,15 M NH ₄ Cl, 1 KHCO ₃ mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,2, armazenar a 4 ° C) por cada baço ao tubo cónico e rodar e inverter o tubo para assegurar que todas as células entrar em contacto com o tampão ACK. Agite suavemente o tubo durante 1 min a RT.
15. Levar o volume da suspensão de células para 50 ml por adição de PBS + 2% do tubo para neutralizar o tampão ACK. Inverter o tubo 10 vezes e centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, a 4 ° C. Após a centrifugação é completa, o sedimento deve ser branco (Figura 3).
16. Gentilmente decantar e desprezar o sobrenadante, cuidado para não perturbar o sedimento. Deixar uma quantidade vestigial de PBS + 2% no tubo, a tampa do tubo, e agite o sedimento para ressuspender-lo.
17. Adicionar 10 ml de meio de células T [10% FBS, HEPES 10 mM (pH 7,0), 2 mM de GlutaMax, piruvato 1 mM de sódio, aminoácidos não essenciais 1x, 1x penicilina / estreptomicina e 50 mM de β-mercaptoetanol], e mais ressuspender o sedimento por delicadamentepipetando para cima e para baixo. Depois filtra-se a suspensão através de um novo filtro de 70 um para um novo tubo de 50 ml.
18. Use outros 5-10 ml de meio de células T para enxaguar o tubo original e esta passar através do filtro de 70 um para o tubo contendo o resto das células filtradas. Se o processamento de mais de dois baços, o volume de meio de células T pode ser aumentada para maximizar a recuperação.
19. Manter as células em gelo até estar pronto para ser manchada. As células devem ser contados e viabilidade acessado.
    1. Para contar as células, combinar 3 ml de células com 24 ml de PBS + 2% e 3 ml de 0,4% de azul de tripano. Carga de 10 ml desta em cada câmara de um hemocitômetro Neubauer melhorada. A viabilidade, tal como avaliado por exclusão de azul de tripano, é tipicamente entre 85-95%.

2. Viabilidade e coloração da superfície

1. Células de pellets por centrifugação durante 10 min a 300 xg, a 4 ° C. Ressuspender as células em meio de células T a uma concentração de 1 x 10 ⁷ células / ml. Transfer de 2 milhões de células (100 ml) para um poço de uma placa de 96 poços de cultura de tecido de fundo em U.
2. Centrifugar a placa de 96 poços durante 10 min a 300 xg, a 4 ° C.
3. Remover o sobrenadante de cada cavidade por um movimento súbito líquido dentro da placa bem na pia (o sedimento de células permanecerá no poço) e secando a placa sobre uma toalha de papel limpa. Lavam-se as células por ressuspensão em 200 ul de PBS seguido de centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Executar todas as lavagens desta maneira salvo indicação em contrário.
   Nota: Não use PBS + 2%, uma vez que irá interferir com a mancha PI solucionáveis.
4. Remover o sobrenadante por um movimento súbito da placa e adicionar 100 mL de mancha comercial recentemente preparada (por exemplo, células mortas mancha vermelha fixável) a cada poço.
   1. Adicione a mancha por diluição da solução stock de 01:10 corante reactivo em DMSO seguido por uma diluição de 1:10 em PBS. Incubar a placa a 4 ° C durante 30 minutos ao abrigo da luz.
5. Centrifugar a pfinal durante 10 min a 300 xg, a 4 ° C. Neste ponto para a frente, executar todo o trabalho com a placa com a cultura de tecidos capô luz.
6. Remover o sobrenadante por um movimento súbito da placa e, em seguida adicionar 100 ml de solução de bloqueio de Fc. Faça solução bloco Fc diluindo Fc solução estoque bloco 1: 100 em PBS.
7. Anticorpos diluído para ser utilizado para a coloração de superfície (por exemplo, anti-CD4 ou anti-CD8) em PBS e adicionar 100 ml a cada poço. Incubar a placa de 96 poços durante 30 min a 4 ° C protegida da luz.
   Nota: anticorpos mancha de superfície devem ser tituladas para o desempenho ideal. Normalmente, utilizam uma diluição de 1: 400, por protocolo do fabricante: 200 ou 1.

3. A coloração intracelular para histona H3

1. Após a incubação, a mancha da superfície, lavar as células duas vezes em PBS.
2. Após a última lavagem, adicionar 100 uL de paraformaldeído a 4% a cada poço. Incubar a placa de 96 poços durante 5 min à TA. Faça paraformaldeído a 4% por diluting 16% de paraformaldeído em PBS. Faça deste fresco.
3. Lavar as células duas vezes em PBS.
4. Adicione solução Perm / bloco (solução estoque é Perm PBS + 2% + 0,02% de Triton X-100, armazenar a 4 ° C) através da combinação de 2 ml de soro de coelho normal por 100 ml de solução de estoque de Perm. Faça o suficiente para 60 ml / amostra.
5. Adicionar 40 ml Perm / Bloco a cada amostra bem e misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo, tomando cuidado para não fazer bolhas. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 45 min no escuro. Salve restante Perm / Bloco para a etapa 3.6.
6. Dilui-se conjugado anticorpo fluorescentemente Histona H3K4me1 em solução Perm / Bloco reservados na etapa 3,5 e adicionar 10 ul desta diluição para cada cavidade. Misture cuidado pipetando para cima e para baixo. Incubar a placa de 96 poços no escuro durante 1 hora a 4 ° C.
   Nota: Utilizar um anticorpo conjugado H3K4me1 utilizando o kit de conjugação com R-Ficoeritrina, seguindo as instruções do fabricante.
7. Lavar as células duas vezes em PBS + 2%.
8. Volte a suspender as células em 200ul de PBS + 2% e transferir as amostras para tubos FACS para análise de citometria de fluxo. As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C no escuro. Para resultados óptimos analisar as amostras dentro de dois dias. Isoladamente amostras coradas pode ser utilizada citometria de fluxo como controles de compensação.

Resultados

Os linfócitos de um C57B / 6 de ratinho foram processados ​​para uma suspensão de célula única de acordo com o protocolo e contadas utilizando um hemocitómetro padrão. As células foram semeadas em triplicado, a 2 x 10 ⁶ / mL em meio de células T em 15 ml de tubos cónicos e não tratada, ou foram estimuladas com 1 mg / anticorpos anti-CD3 solúvel ml (4C11 clone) durante 3 h a 37 ° C em numa incubadora de cultura de tecidos padrão. As células mortas foram coradas e, em seguida, as células foram então superfície manchada utilizando anticorpos FITC-CD8 e CD4-APC acordo com o protocolo. Acessibilidade histona foi analisada através de citometria de fluxo (Figura 4). Em células T CD4 ^{+ e} CD8 + naive ambas, a intensidade de fluorescência média (IFM) é baixo, o que significa um estado cromatina condensada. Como as células são activadas com anti-CD3 os aumentos IFM significativamente (p <0,001, teste t de Student), indicando que tem descondensada cromatina.

Figura 1. Técnica para o processamento de baços numa suspensão de células isoladas usando lâminas de microscópio fosco. (A) O baço é pressionado contra as superfícies foscas de duas lâminas de microscópio. (B) Os slides são movidos frente e para trás uns contra os outros linfócitos liberam em uma placa de Petri de 100 milímetros até os restos do baço são brancos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Utilizando uma seringa a rolha prima restante polpa vermelha através de um filtro de células de 70 mm. (A), polpa vermelha do baço remanescente após um i s transformados em uma suspensão de células única e passada através do filtro de células de 70 mm. (B) A parte de batente de uma seringa de 3 ml é utilizada para pressionar suavemente restante polpa vermelha através do filtro de células. (C) Depois de utilizar a seringa, deve haver praticamente nenhuma polpa vermelha deixado no filtro de células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. ACK lise das células vermelhas do sangue. (A) A centrifugação de uma suspensão de células única produzida a partir de um único baço de ratinho antes da lise ACK. (B) Depois de ACK lise dos glóbulos vermelhos do sangue, o sedimento de células deve ser de cor branca.obter = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Os resultados representativos do protocolo. Esquema (A) utilizado para analisar gating estado da cromatina em linfócitos ^T CD4 +. (B e C), as células T foram deixados sem tratamento ou activada com anticorpos 1 mg / ml de anti-CD3 solúvel, durante 3 horas (em triplicado). As células foram depois analisadas por citometria de fluxo para determinar a condensação da cromatina em ^células CD4 + (B) e as células ^CD8 + (C). Os dados são a média ± desvio padrão da intensidade média de fluorescência de coloração H3K4me1. * p <0,001 (teste t de Student) Por favor, clique here para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1:. Resolução de Problemas Uma referência rápida para problemas comuns e possíveis soluções.

Discussão

Foi desenvolvido um protocolo que permite a avaliação de condensação da cromatina nas células T. Baseia-se na simples observação de que anticorpos de histona H3 não podem acessar seus epítopos prontamente nas células ingênuo, mas após a ativação das células T, estes mesmos anticorpos são capazes de se ligar aos seus epítopos. Ao comparar a coloração Histona H3 MFI de entre grupos de tratamento, o grau relativo de condensação ou descondensação pode ser determinada. Temos utilizado este protocolo para determinar o status de condensação relativa durante o desenvolvimento de timócitos e durante a activação das células T ^4. Temos também utilizado este protocolo para investigar os mecanismos que controlam o processo descondensação ^5.

Este protocolo baseia-se na utilização de um anticorpo de histona H3 para detectar o estado de condensação da cromatina. Uma vez que não existe qualquer alteração global na modificação da histona durante a activação das células T ^4, que é capaz de usar um anticorpo para avaliar H3K4me1 cromatinaestado neste protocolo. Nós usamos anticorpos produzidos contra inalterado histona H3; No entanto, o sinal produzido foi muito mais fraca global. Em nossa experiência, os anticorpos produzidos contra modificado histona H3 funcionam melhor em imunofluorescência e ensaios de citometria de fluxo, enquanto anticorpos contra inalterado histona H3 funcionam melhor em Western blot. Deve ser notado que é também possível a utilização de anticorpos dirigidos contra outras proteínas histona, embora não se tenha tentado-lo.

As etapas de anticorpos Perm / Bloco e histona H3 são as etapas mais críticas do protocolo. A quantidade de solução de Perm / Bloco utilizado tem de ser optimizado de cada vez a solução estoque é feita Perm. Isto pode ser feito comparando o desempenho de diferentes diluições da solução de reserva. Uma experiência típica envolve a comparação estado da cromatina em células T naive para aqueles activado durante 3 horas (Figura 4). Deve-se escolher a diluição que produz a maior mudança na MFI maiso período de tempo analisado. A solução-mãe pode ser diluída em PBS + 2% para diminuir Perm / Bloco primeira força por ressuspensão das células na medida em 100 ml de PBS + 2% após o passo 3.4 e, em seguida, adicionando o Perm / Bloco no passo 3.5. Uma experiência piloto similar deve ser usado para testar diferentes diluições do conjugado de anticorpo de histona H3 fluorescentemente cada vez que um novo lote de anticorpo é marcado. Estes passos são especialmente críticos para detecção com sucesso de diferenças de condensação no início da activação das células T (por exemplo, dentro de 3 horas de activação). Ocasionalmente, existem células que não recebem permeabilizadas e, assim, não vai manchar com o anticorpo histona H3. Isso pode acontecer se as células não são suspensas de novo bem ao adicionar o Perm / Bloco ou se o Perm / Bloco não é forte o suficiente. Estas células aparece como eventos pressionados contra o eixo ao visualizar um histograma de Histona H3 coloração. Uma vez que estes eventos irão distorcer a IMF, em geral, esses eventos podem ser omitidos da análise por Gating a distribuição normal de células positivas histona H3. Assistência adicionais podem ser encontradas no Guia de Solução de Problemas (Tabela 1).

A inclusão de uma coloração celular morto fixável permite a avaliação da viabilidade celular no ensaio. Isto é absolutamente crítico durante a manipulação de activação das células T, pois certos estímulos podem induzir a morte celular. Em tal caso, o anticorpo pode ligar-se Histona H3 histonas em células mortas de forma diferente do que as células vivas, que conduz a erros de interpretação dos resultados.

Este protocolo é concebido para ser utilizado no formato de placa de 96 poços, o que permite uma análise de alto rendimento de estado da cromatina. Um baço de um 6-8 semanas de idade do rato fêmea tipicamente renderá entre 60-90000000 células usando o protocolo. Uma vez que o protocolo de coloração requer 2 milhões de células por amostra, pode-se facilmente ensaiar vários grupos de tratamento e os pontos de tempo, em triplicado, com um único baço em uma única placa de 96 poços. É possível perform o protocolo com menos células por amostra; No entanto, devido ao número de passos de centrifugação e a inerente perda de células em cada uma destas etapas, não é aconselhável para diminuir o número de células por muito. Nós completamos com sucesso o protocolo com 1 milhão de células por amostra.

Nós usamos esse protocolo para examinar o status da cromatina em células auxiliares ^T CD4 + ^e CD8 + T citotóxicas. Isto é possível porque o protocolo padrão inclui a coloração da superfície. O protocolo pode ser facilmente adaptado para o exame da cromatina em outras subpopulações de linfócitos usando anticorpos contra marcadores de superfície específica populacional. Este protocolo pode também ser facilmente adaptada para outros tipos de células, desde que anticorpos que reconhecem marcadores de superfície relevantes são condições de fixação / permeabilização disponíveis e adequados são conhecidos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm tissue culture dish	BD Biosciences	353003
Precleaned frosted microscope slides	Fisher Scientific	12-550-343
Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh	Fisher Scientific	22363548
3mL syringe, Luer-Lok tip	BD	309585
Falcon 50mL polypropylene conical tube	Corning	352098
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit	Life Technologies	L23102	Life Technologies sells versions of this kit with different colors
Fc Block	BD Biosciences	553142
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Normal rabbit serum	Sigma-Aldrich	R9133
Anti-H3K4me1 antibody	Abcam	ab8895
R-Phycoerythrin conjugation kit	Abcam	ab102919	Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used