Eine einfache mechanische Verfahren Limbusstammzellinsuffizienzen in der Maus zum Erstellen

Zusammenfassung

Der folgende Artikel stellt eine einfache und reproduzierbare Technik effektiv zu einer nachhaltigen Mausmodell der Limbusstammzellinsuffizienzen (LSCD) erstellen. Dieses Tiermodell ist nützlich bei der Prüfung und die Wirksamkeit von Behandlungen für Limbus-Stammzellen Krankheiten verglichen.

Zusammenfassung

Limbusstammzellinsuffizienzen (LSCD) ist ein Zustand der Fehlfunktion oder den Verlust von Limbus-epithelialen Stammzellen, wonach das Hornhautepithel mit Bindehaut ersetzt wird. Die Patienten leiden unter wiederkehrenden Hornhautdefekte, Schmerzen, Entzündung und Verlust des Sehvermögens.

Zuvor wurde ein Mausmodell der LSCD beschrieben und im Vergleich zu zwei anderen Modellen. Das Ziel war, ein einheitliches Mausmodell der LSCD zu erzeugen, die beide ahmt den Phänotyp beim Menschen und lange genug dauert es möglich zu machen, um die Krankheit Pathophysiologie zu studieren und zu neuen Therapien zu bewerten. Hier wird die Technik näher beschrieben.

Ein motorisiertes Werkzeug mit einem rotierenden Grat wurde entwickelt, um die Rostringe von der Hornhautoberfläche zu entfernen oder das Pterygium Bett bei Patienten zu glätten. Es ist eine geeignete Vorrichtung die gewünschte LSCD Modell zu erstellen. Es ist ein leicht verfügbar, einfach zu bedienendes Werkzeug mit einer feinen Spitze, die es angemessen für die Arbeit an kleinen Augen macht, wiein Mäusen. Seine Anwendung verhindert eine unnötige Gefahr für das Auge und es zu unerwünschten Verletzungen führt nicht, wie es oft der Fall bei Modellen chemischen Verletzungen. Wie zu einem stumpfen Schaber gegenüber, entfernt sie das Epithel mit der Basalmembran. In diesem Protokoll wurde die Limbus-Bereich zweimal abgerieben, und dann das Ganze wurde Hornhautepithel von Limbus zu Limbus rasiert. Um Stroma Verletzungen zu vermeiden, wurde darauf geachtet, nicht die Hornhautoberfläche zu bürsten einmal wurde das Epithel bereits entfernt.

Einleitung

Das Hornhautepithel erforderlich, um die Klarheit und die Integrität der Hornhaut aufrechtzuerhalten. Es wird ständig während des gesamten Lebens durch die epithelialen Stammzellen in Limbus-einer schmalen Zone an der Verbindungsstelle der Hornhaut und der Bindehaut Wohnsitz erneuert. Diese sich selbst erneuernden Limbusstammzellen spielen eine entscheidende Rolle in der Hornhautepithel regenerierend, beide normal und nach der Verletzung. Eine teilweise oder vollständige Verarmung dieser Stammzellen wird bei rezidivierenden Hornhauterosionen, Schmerzen, Hornhautnarben und Neovaskularisation, Aussehen von Becherzellen zur Folge haben, und wenn sie nicht behandelt, Hornhautblindheit links. Dieser Zustand wird als Limbusstammzellinsuffizienzen (LSCD) bekannt und können idiopathische sein; erblich; oder durch chemische oder thermische Verletzungen erworben, langfristige Tragen von Kontaktlinsen, und eine chronische Entzündung ^1-6.

Forschung auf LSCD erfordert ein geeignetes Tiermodell, das nicht nur imitiert die Krankheit beim Menschen, sondern ist reproduzierbar und nachhaltig ist, mit dem mindestens eineBerg Verletzungen anderer Hornhaut- und Augenstrukturen. Dieses Modell ist notwendige Behandlungen zu beurteilen und die Krankheitsmechanismen auf molekularer und zellulärer Ebene zu klären. Wie zuvor ¹ beschrieben, mit der Verwendung einer rotierenden Fräse, kann man leicht ein Mausmodell der LSCD entwickeln, die die oben genannten Vorteile und bleibt für mindestens drei Monaten aufweist. Das Ziel dieser Studie ist es, eine einfache, reproduzierbare und nachhaltige Mausmodell der LSCD zu präsentieren.

Der sich drehende Grat ist ein handliches Werkzeug , das gleichmäßig das Epithel entfernt , ohne die zugrunde liegende ¹ Stroma zu verletzen. Es wurde ^{7, 8} in Wundheilungsstudien zu induzieren zentralen Hornhauterosion eingesetzt. Die hiermit präsentierte Technik LSCD in einer Maus zu schaffen, hat nicht vor berichtet. Zuvor Verfahren eingeführt in einer weniger einheitlichen das Epithel mit einem stumpfen Spatel Ergebnis Abschaben verletzungs insbesondere am Limbus-und eine variable Phänotyp ^{1, 9,} mit Wiederherstellung of normalen Hornhautepithel ^1. Im Gegensatz zu dem stumpfen Schaber, entfernt der Rotationsbohrer des epithelialen Basalmembran sowie ^{7, 8, 10.} Andere berichteten Verfahren Stammzellen abzutrennen, umfassen die Verwendung von Chemikalien, wie Natriumhydroxid, n-Heptanol, und Benzalkoniumchlorid, die nicht nur unerwünschte Schädigung zugrunde liegenden Augenstrukturen induzieren kann, sondern auch zu erheblichen Entzündung und nachfolgende kornealen opacification führen kann oder epithelialen Plattenepithelmetaplasie ^15.11. Der rotierende Grat ist nicht mit dieser schweren Komplikationen verbunden. Chirurgisch den Limbus Epithel entfernt, ¹⁰ allein oder mit der Verwendung von ^{Chemikalien, 11, 16,} ist schwieriger zu führen und ist nicht die beste Option bei Tieren mit kleinen Augen und einem dünnen Limbus Epithelien (wie Mäuse). Darüber hinaus kann überraschenderweise limbectomy noch etwas von dem Limbus Epithel hinter ¹⁰ verlassen.

Die unten beschriebene Technik wird in LSCD mit Neovaskularisierung eine Folged conjunctivalization, die die Darstellung der kompletten LSCD bei Patienten und dauert mindestens drei Monate ¹ nachahmt. Es ist geeignet für diejenigen, die darauf abzielen LSCD oder Wundheilung Pathophysiologie, Immunologie und mögliche Behandlungen bei Mäusen zu untersuchen. Gegebenenfalls mit einigen Modifikationen kann dieses Verfahren bei Ratten oder Kaninchen ¹⁰ durchgeführt werden. Da der Rotationsbohrer effizient das Epithel entfernt, kann es im Zusammenhang mit Hornhautepithels Abrasion / Verwundung und in jeder Behandlung benötigt oder Molekularbiologie Studien in jeder Forschung genutzt werden.

Protokoll

Alle Verfahren an Tieren durchgeführt, mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Aussagen für Tierversuche in der Vision Forschung entsprechen. Vierzehn vier- bis sechs Monate alten männlichen / weiblichen C57BL / 6J-Wildtyp-Mäusen wurden verwendet: zehn Mäuse für die Schadensmodell und vier als Kontrolltiere (unwounded Cornea).

1. Vorbereitung der Tiere

1. Anästhesieren eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 100 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin-Mischung. Nach der Anästhesie wirksam geworden ist, eine Prise der Spitze der Narkose Tiefe zu bestätigen; sollte das Tier nicht reagieren.
2. Untersuchen Sie das Auge unter einer Spaltlampe vor der Durchführung der Experimente das Fehlen einer früheren Verletzung der Hornhaut zu überprüfen.
3. Flößen Sie einen Tropfen von 1% Tetracainhydrochlorid auf das Auge. Nach 60 bis 90 Sekunden, testen Sie die Kornealreflex das Fehlen der Empfindung zu bestätigen. Proparacain-Hydrochlorid 0,5% können stattdessen verwendet werden.
4. Wenn der Verlust der Hornhautgefühl istsicher, sanft einen Rückgang von 5% PVP-Jod auf das Auge platzieren und auf das Haar um das Auge. Wischen Sie den Abfall nach 1 min aus oder verteilen es auf dem Haar um die Augen, das Haar zu verhindern, mit der Werkzeugspitze stören.

2. Abschleifen der Hornhautepithel

1. Tragen OP-Handschuhe und ein Kleid. Bereiten Sie die erforderlichen Werkzeuge: ein steriles Rotationsbohrer und ein Paar sterile Pinzette. Für eine bessere Kontrolle, verwenden gebogen Pinzette. Legen Sie die Werkzeuge auf einem sterilen Blatt während des Verfahrens.
2. Unter Verwendung der gebogenen Pinzette, stabilisieren das Auge durch den Deckel von der Nasenseite greifen und das Auge sanft proptosing. Vermeiden Sie zu viel Druck.
3. Unter einem Operationsmikroskop, rasieren 360 ° um den Limbus-Bereich zweimal die sterile Rotationsbohrer verwenden. Gehen Sie rund um den Limbus mit einer Geschwindigkeit von 5 - 6 Sekunden pro Runde.
   HINWEIS: Der Grat einer festen Geschwindigkeit hat. Doch für sie sollte verschärft werden vollständig bei der etablierten Geschwindigkeit, die "End-Mutter" zu drehen.
4. Entfernen Sie das gesamte Hornhautepithel von Limbus mit dem rotierenden Grat zu Limbus. Für bessere Ergebnisse, wobei das Werkzeug in einer kreisförmigen Art und Weise bewegen und halten es etwas parallel zur Hornhautoberfläche mit der lateralen Seite seiner Spitze zu arbeiten. Achten Sie darauf, nicht das Stroma zu verletzen, indem nicht wieder Bürsten der Bereiche, in denen das Epithel bereits entfernt wurde. Wenden Sie keinen Druck auf das Auge. Reinigen Sie die Pinselspitze nach Bedarf.
5. Flößen Sie einen Tropfen steriler phosphatgepufferter Salzlösung auf der Hornhaut und wischen Sie alle freistehende Epithellagen mit einem weichen Reinigungstuch.
6. Rasur die verbleibende Epithel, sofern vorhanden.
7. Achten Sie auf die Maus Schwanz während der Operation.
   HINWEIS: Wenn eine Bewegung stattfindet, hat die Narkose Tiefe verblasst und weitere Injektion erforderlich ist. Ein Drittel bis zwei Drittel des primären injizierte Volumen sollte ausreichen. Überdosierung Sie nicht das Tier mit dem Betäubungsmittel Medikamente.
8. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge, bevor sie auf einem anderen Auge mit.

3. Bestätigen Sie die komplette Epithelial Removal

1. Einen Tropfen von 1 mg / ml Fluorescein-Natrium auf die Hornhaut. Reinigen Sie die Hornhaut nach 30 Sekunden und untersuchen sie unter einem Mikroskop mit einem Blaufilter die vollständige Entfernung des Epithels zu überprüfen.
   HINWEIS: Die Hornhautbereiche mit Epithelfehler sind grün dargestellt.

4. Post-Betrieb Pflege

1. Legen Sie das Tier auf einer Heizdecke und halten Sie sie an einem sicheren Ort (zB in seinem Käfig) , während unter Rückgewinnung. Nicht eine unbewusste Tier in der Gesellschaft von bewußten halten.
2. Bewerben 1% Erythromycin Augensalbe. Dies wird auch Augentrockenheit verhindern. Weiterhin die Anwendung des Antibiotikums täglich für eine Woche.
3. Injizieren von 0,1 mg / kg subkutan Buprenorphin nach dem Eingriff und wieder nach 12 Stunden. Weiterhin die Injektion zweimal pro Tag für zwei Tage.
4. Beobachten Sie das Tier für 30 - 45 min, bis zur vollständigen Erholung von der Anästhesie.
   HINWEIS: Leichte Bewegung der Atemmuskulatur auf der ventralen Oberfläche zeigt Tier Wellness, während sie unter Genesung.

Ergebnisse

Innerhalb eines Monats nach dieser Technik durchgeführt wird , 100% der Cornea entwickelt oberflächlichen Neovaskularisation (Abbildung 1A. Fotos mit einer Kamera zu einer Spaltlampe unter einem hellen Bereich und Blaufilter verbunden genommen wurden). In 18/20 (90%) der Augen, beteiligt Neovaskularisierung die ganze Hornhautoberfläche (1A). In 2/20 (10%), Neovaskularisation wurde in drei von vier Quadranten kornealen beobachtet, aber es erreicht noch...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine reproduzierbare und relativ einfache Technik, ein Mausmodell von LSCD zu erstellen. Es gibt mehrere wichtige Aspekte dieses Modells, die erwähnenswert sind. Erstens, anders als Modelle , die ^{11 Chemikalien, 12,} beinhaltet die Schädigung in erster Linie das Oberflächenepithel (und Basalmembran) mit minimaler Beschädigung des darunterliegenden Hornhautstroma oder anderen intraokularen Strukturen. Somit gibt es nur begrenzte Entzündung und Vernarbung, von denen beide das Verfa...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover	Rumex International Co, Clearwater, FL	16-141	0.5 mm burr. Also available from other companies.
Surgical microscope	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M691
Digital camera	Nikon, Thailand
Nikon FS-2 slit lamp	Nikon, Japan
Polyclonal anti-CK12 antibody	Santa Cruz Blotechnology, CA,	SC-17101	1:100 concentration
Monoclonal anti-CK8 antibody	TROMA-I-s, Iowa City, IA	AB_531826	1:50 concentration