L'isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells

Riepilogo

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Abstract

La femmina tratto riproduttivo (FRT) mucosa sistema immunitario serve come la prima linea di difesa. Una migliore conoscenza della mucosa genitale è quindi essenziale per comprendere la patogenicità dei diversi agenti patogeni, tra cui l'HIV. Gamma Delta cellule (GD) T sono il prototipo delle cellule T "non convenzionali" e rappresentano una parte relativamente piccola sottogruppo di cellule T definite dalla loro espressione dei recettori delle cellule T eterodimeriche (TCR) composte da catene di gamma e delta. Questo li distingue dalle cellule T classici e molto meglio noti CD4 ⁺ helper e le cellule CD8 ⁺ T citotossici che sono definiti da TCR alfa-beta. cellule T GD spesso mostrano la localizzazione tessuto-specifica e sono arricchiti in epitelio. le cellule T GD orchestrare le risposte immunitarie a infiammazione, la sorveglianza del tumore, malattie infettive, e autoimmunità.

Qui, vi presentiamo un metodo per isolare ed analizzare riproducibile endocervicali intraepiteliale linfociti T GD umani. noi ettarove utilizzati campioni cytobrush endocervicali da donne che partecipano alle donne Interagency HIV Infection Study (WIHS). La conoscenza GD cellule T interazioni durante le condizioni in cui vi è un insulto alla mucosa vaginale potrebbe essere applicata a qualsiasi studio clinico in cui la vulnerabilità della mucosa è rivolta, compreso lo sviluppo di oltre microbicides.In vaginale, la conoscenza di risposte delle cellule della mucosa GD T ha possibilità di applicazione di GD T cell-based terapia immunitaria nel trattamento delle malattie infettive.

Introduzione

Abbiamo sviluppato la metodologia di utilizzo di campioni endocervicali pennello per valutare le cellule T GD intraepiteliali. Il canale endocervicale è rivestito da un singolo strato di epitelio colonnare. Linfociti intraepiteliali rappresentano linfociti di prima linea che risiedono all'interno dello strato epiteliale che può rapidamente avviare risposte immunitarie su di incontrare microbi patogeni ^{7, 8.} Comprendere gli eventi immunologici del vano intraepiteliale endocervicale è importante per la progettazione di strategie efficaci per prevenire le infezioni, compreso l'HIV.

Il nostro metodo può essere applicato per i campioni endocervicali umane appena raccolti, nonché le cellule endocervicali congelati per esplorare ulteriormente il ruolo delle cellule T GD intraepiteliale nelle donne con infezione da HIV o a rischio di infezione da HIV. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di scoprire nuovi eventi immunologici nel vano intraepiteliale endocervicale e evaluatle risposte delle cellule T e GD come marker di vulnerabilità della mucosa nelle donne con infezione da HIV.

Le lacune sostanziali nella conoscenza intorno FGT immunità sono in parte a causa della difficoltà di raccolta e l'elaborazione dei campioni delle mucose con successo. Inoltre, il complesso eterogeneità delle cellule immunitarie mucosali, e la loro interconnessione tra loro, sono sfide importanti per identificare misurazioni clinicamente rilevanti che riflettono lo stato e la capacità del sistema immunitario. Abbiamo sviluppato un metodo per ottenere cellule altamente purificate intraepiteliali GD T che possono essere ulteriormente analizzate utilizzando altamente multiplex, tecnologie unicellulari che possono essere critiche per l'identificazione dei meccanismi alla base della FRT immunità.

Protocollo

attività di studio ha avuto luogo presso l'Università di Unità di Ricerca HIV Miami, in collaborazione con l'HIV Interagency Studi delle Donne Miami (WIHS) e il Miami Center for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (Università di Miami Miller School of Medicine) l'approvazione è stata ottenuta prima per il reclutamento e le eventuali procedure di valutazione o di studio correlati.

Raccolta del campione 1. endocervicale Brush

NOTA: I partecipanti sono stati sottoposti a un esame vaginale eseguito da MD addestrato o il ginecologo e la raccolta dei linfociti intraepiteliali sono stati eseguiti in esame con lo speculum inserendo cytobrush.

1. caratteristiche dei partecipanti
   1. Reclutare donne partecipanti che sono tra i 18 ei 45 anni di età, sessualmente attivi, non è incinta e non sui farmaci contraccettivi o con un dispositivo intrauterino.
   2. Prima di un esame vaginale, hanno i partecipanti sono sottoposti a un pareggio 10 ml di sangue in verdevacutainer eparina top per l'isolamento delle cellule periferiche mononucleate del sangue (PBMC). per servire come controllo per endocervicale analisi intraepiteliale ^9.
2. Raccolta dei campioni endocervicali
   1. Inserire uno speculum sterile di dimensioni adeguate in vagina senza lubrificazione. Utilizzare acqua calda per facilitare l'inserimento del speculum e garza sterile per pulire il muco. La posizione del speculum consente la completa visualizzazione del sistema operativo e portio.
   2. Inserire la spazzola endocervicale nel canale endocervicale fino a quando solo le setole più vicini alla mano sono visibili. Ruotare il pennello in senso orario per 360 °. Trasferire la spazzola in un tubo da 15 ml contenente 5 ml di mezzo IMDM.
   3. Subito dopo la raccolta, posizionare il tubo contenente cytobrush sul ghiaccio. Per ottenere elevata vitalità delle cellule intraepiteliali raccolti, consegnare il cytobrush al laboratorio e processo entro 1 ora.

2. Endocervicale Sample Processing Cytobrush

1. Tubo Vortex contenente cytobrush endocervicale applicare 4 colpi (10 sec) brevi.
2. Centrifugare la provetta contenente cytobrush, per 10 min a 250 x g.
3. Rimuovere con attenzione il cytobrush dal tubo (non disturbare il pellet sul fondo della provetta) e aggiungere 1 ml di mezzi IMDM e posizionare il tubo in ghiaccio.
4. Posizionare il cytobrush sul setaccio cella 100 mm superiore del tubo 50 ml.
5. Lavare il cytobrush con 20 ml IMDM.
6. provetta da centrifuga per 10 minuti a 250 x g.
7. Decantare il surnatante e le cellule in pellet risospendere in 1 ml IMDM e si combinano con il pellet già ri-sospensione descritto in 2.3.
8. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato ¹⁰ o contare le cellule utilizzando emocitometro combinando 10 ml di sospensione cellulare con 10 ml di colorante blu trypan. Delicatamente pipettare su e giù dieci volte per mescolare le cellule e colorante. Carico di 10 microlitridella miscela nell'apertura di una delle due camere emocitometro. Contare tutte le celle in cinque aree della griglia. Tenere un conteggio separato delle cellule vitali e non vitali. Determinare la vitalità cellulare utilizzando la seguente formula:% di cellule vitali = cellule non vitali x 100 / totale cellule numero delle cellule.
   Determinare la concentrazione successiva cellule per ml (e il numero totale di cellule) usando i seguenti calcoli. Totale cellule per ml = x cellule totali contate (fattore di diluizione / numero di piazza contate) x 10.000 cellule / ml.
9. Congelare isolate cellule endocervicali utilizzando media congelamento contenente il 10% di DMSO e il 90% FBS.

3. Citometria a Flusso

1. Risospendere 1-3 x 10 ⁵ cellule endocervicali in 100 microlitri di buffer FACS (PBS contenente 1% di albumina sierica bovina
2. Aggiungere 1 ml / 10 ⁶ Live / Dead fissabile giallo Morto kit cellulare Stain e anticorpi per marcatori di superficie alle concentrazioni descritte nella tabella 1.
3. Incubare le cellule per 30 minuti a + 4 ° C, al riparo dalla luce.
4. Aggiungere 1 mL FACS tampone e le cellule e provette da centrifuga per 5 min a 350 xg
5. Risospendere pellet cellulare in 300 microlitri di 1% paraformaldeide.
6. Preparare controlli compensazione utilizzando perline e anticorpi utilizzati per la colorazione aggiungendo 100 ml di tampone FACS e una goccia delle perle e la stessa concentrazione di anticorpi usati per la colorazione del campione.
7. Acquisire perline colorate e campioni su un citofluorimetro, dotato di 405 nm, 488 nm e 635 nm laser.

L'isolamento delle cellule 4. endocervicale Gamma Delta T

1. Isolamento tallone magnetico
   1. Risospendere endocervicale pellet cellulare (≤ 10 ⁷ cellule totali), descritto in 2.6, in 40 ml di tampone incluso nel kit di Gamma Delta microperla TCR fa riferimento la tabella di materiali e reagenti.
   2. Seguire le istruzioni del kit per il protocollo di colorazione in due fasi: in primo luogo, ingegnoh anti-TCR gamma delta Hapten-anticorpo e la seconda, con l'anti-aptenici microsfere-FITC
   3. Dopo incubazione di 15 min a 4-8 ° C, lavare le cellule aggiungendo 1 ml di tampone e centrifugare a 300 xg per 10 min. Decantare il supernatante invertendo la provetta, e toccare secco con l'aiuto di un foglio di carta.
   4. Risospendere il pellet cellulare in 500 ml di condizione di buffer e preparare la colonna magnetica ponendolo in separatore magnetico appropriata secondo il protocollo del fornitore.
   5. Applicare sospensione cellulare nella colonna e raccogliere le cellule senza etichetta che attraversano e lavare colonna 3x con adeguate quantità di tampone (500 mL). Eseguire fasi di lavaggio aggiungendo tampone tre volte, ogni volta dopo il serbatoio colonna è vuota. Raccogliere dell'effluente totale. Questa è la frazione di cellule senza etichetta, negativo
   6. Rimuovere la colonna formano il separatore magnetico e pipetta 1 ml di tampone sulla colonna e subito scovare frazione con l'etichetta magneticamentecellule cato applicando saldamente lo stantuffo fornita con la colonna.
      NOTA: Isolated Gamma Delta cellule T sono già fluorescente macchiato per analisi di flusso-citometria da magneticamente etichettati microsfere anti-aptene sono coniugati con FITC fluorescenti colorante.
2. cell sorting
   1. Per l'ordinamento delle cellule, le cellule endocervicali etichette con Die vitalità e pannello di anticorpi come descritto nel paragrafo 3.
   2. Impostare varchi elettronici sul vivo, CD45 ⁺ CD3 ⁺ e delta gamma cellule positive e effettuare una cernita delle cellule.

Risultati

Recentemente, abbiamo analizzato intraepiteliale cellule T GD endocervicali e siamo stati il primo a riferire circa la perdita di cellule endocervicale T gamma delta in donne infette da HIV ^{9, 11.} Qui, descriviamo il protocollo per isolare e analizzare il sottogruppo di cellule T gamma delta endocervicale. Come mostrato in figura 1, le cellule T GD possono essere facilmente rilevati nei campioni di cellule endoce...

Discussione

Valutazione della vulnerabilità femminile della mucosa del tratto genitale inferiore è una componente essenziale di studi clinici che affrontano il rischio di acquisizione e trasmissione del virus HIV. Tipicamente FGT vulnerabilità alle infezioni da HIV è valutata misurando immunomodulatori solubili nelle secrezioni genitali (citochine, chemochine e peptidi antimicrobici) ^{12, 13.} Tuttavia, questi marcatori sono solo indicative di infiammazione vaginale, sono...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytobrush Plus GT	(CareFusion, San Diego, CA, USA
IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium	ThermoFisher Scientific	12440061
Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter	496178
DMSO, Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650
FBS, Fetal Bovine Serum	Invitrogen, Gibco	26140-079
PBS	Invitrogen, Gibco	10010023
BSA	Sigma Aldrich	A-9647
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit	Life Technologies,	L349S9
1% paraformaldehyde	Sigma Aldrich	D6148
Fortessa flow cytometer	Becton Dickinson
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42
ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)	Life Technologies	A10346
anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit	Milteny Miltenyi Biotec Inc.	130-050-701
MS column		103-042-201
MACS separator		4124