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要約

ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT のステージ固有操作を使用します。

要約

再生医療の主な目的の 1 つは、生成、造血幹細胞 (造血) ひと多能性幹細胞 (hPSCs) 由来のメンテナンスです。最近まで、造血に hPSCs を区別するための努力は主に HSC 可能性を欠いて、代わりに卵黄嚢造血のような造血前駆細胞を生成しています。これらの結果の造血前駆細胞は、様々 な成人造血器疾患、リンパ系統の特にそれらの in vitro疾患モデル作製のためのユーティリティ限られている可能性があります。しかし、最近ここの概要ステージ固有分化プロトコルを使用して hPSCs からエリスロ骨髄リンパ多能決定的な造血前駆細胞を生成する方法を説明しました。基底膜マトリックス コーティング容器に hPSCs の酵素分解による胚様体 (EBs) が形成されています。EBs は、中胚葉に GSK3β 阻害剤の CHIR99021 でその後決定的な造血プログラムに指定されている組換え BMP4 によって区別されます。また、原始造血は PORCN 阻害剤の IWP2 によって指定されます。造血はさらに VEGF 組換え添加および支持造血サイトカインを介して駆動されます。このメソッドを使用して生成された結果の造血前駆細胞疾患と発達モデル、体外に使用される可能性があります。

概要

ひと多能性幹細胞 (hPSCs) ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) を包含として定義され、適切な成長条件下で自己更新を受けていない唯一のユニークな能力を持っています。また、あらゆる細胞に分化する能力が 3 つの胚葉から派生: 外胚葉、中胚葉、内胚葉の1。これらのユニークな能力のためは、hPSCs は、再生医療、疾患モデル作製、細胞ベースの治療2に偉大な約束を保持します。種類の細胞は、hPSCs から正常に分化されている、1 つの重要な課題は大人っぽい hPSC 由来造血幹細胞 (造血)、決定的な造血前駆細胞の in vitro仕様。

HPSCs から人間の HSCs の発展に 1 つの可能性があります障壁ヒト胚3で複数の造血プログラムの存在であります。現れる、「原始的な造血、」と呼ばれる最初のプログラムは胚の卵黄嚢の組織内で起きると巨核球、マクロファージ、赤芽球前駆細胞 (EryP フロン) の一時的な生産が最大の特徴です。特に、このプログラムは、造血に上昇を与えないもそれは T および B リンパ球前駆細胞に上昇を与えるが。ただし、卵黄嚢では、エリスロ骨髄前駆 (EMP4,5,6,7,8) など、制限された決定的な造血前駆細胞に上昇を与えるは一過性赤血球欠乏リンパ プライミング多能性前駆 (LMPP9)。ただし、EMPs でも LMPPs でもない、完全に多能性または成人レシピエントにおける HSC のような生着が可能です。対照的に、開発で後で古典的な定義の「決定的な」造血プログラムは、HSC を含むすべての成人造血系統に上昇を与える、適切な胚大動脈性腺発生地域で指定されます。これら胎児内決定的な造血細胞の仕様は、hemogenic (彼) 内皮3,10,11 から内皮-造血移行を介しての Notch 依存的ファッション ,12,13,14。溶解能力は別として潜在的な multilineage とこれらの細胞の依存性のノッチを EMP と (文献参照3,13 LMPP からこれらの決定的な造血前駆細胞を区別するために使用できます。).

HPSCs からプリミティブと決定的な造血仕様を支配する機構を理解することは可能性が高いさまざまな hPSC ラインの決定的な造血前駆細胞の再現性のある生産に不可欠。最近まで、プリミティブと決定的なの多能性造血前駆細胞を分離できれば hPSC 微分のプロトコルには、15,16,17,18がありませんでした。 19,20,21,22,23,24,25。最初に牛胎児血清 (FBS) および/または間質共培養を使用多くのアプローチ説明プリミティブと決定的な造血潜在的な15,16、混合 hPSC 分化の造血の可能性 17,19,22,23,25。さらに、造血無血清の多くのプロトコルは、港湾の造血潜在的な18,20,21, hPSCs から中胚葉の仕様は信号の要件を説明しています。24します。 ただし、これらのメソッドはまだ両方のプログラムの異種混合物に上昇を与えた、と臨床応用と理解の発達メカニズムの使用は限定される場合があります。

我々 は最近概説アクチビン/節点と hPSC から派生した中胚葉18,26 からプリミティブと決定的な造血仕様における WNT シグナルのステージ固有の信号要件を持つこれらの研究で構築して.ステージ固有 WNT 信号操作の使用は、専らプリミティブまたは決定的な造血前駆細胞26排他的のいずれかの仕様に、後者は特にユニークです。中胚葉仕様、中に PORCN 阻害剤 IWP2 とカノニカル WNT シグナル伝達の阻害の結果 CD43 の仕様で+ EryP フロン ・骨髄前駆細胞、リンパ球検出可能性のないです。対照的に、カノニカル WNT シグナル GSK3β 阻害剤、CHIR99021 と分化の段階で同じ刺激検出 CD43 の完全な不在で起因した+ EryP フロン、同時にリードしながらに、CD34 の仕様+CD43−彼。この人口が骨髄性、所有していたHBG-赤芽球と T リンパ球の可能性を表現します。以降の解析には、CD7327,28 ・ CD18428、その造血可能性の表現としてはノッチ依存28だったこれが識別されます。さらに、単一細胞のクローン性解析は、これらの決定的な造血系統の多能性の単一細胞28が由来することを示した。一緒に取られて、これらの研究は、純粋な原始造血前駆細胞や多能性 NOTCH 依存的決定的な造血前駆細胞、ステージ固有 WNT 操作ができますを示します。

ここでは、我々 は WNT シグナリング中胚葉のパターン形成とその下流の造血系統の試金の操作を介して排他的プリミティブまたは決定的な造血系細胞を生成する我々 の差別化戦略を概説します。このプロトコルは、再生医療用 hPSCs からプリミティブ型または決定的な造血前駆細胞の生産に興味を持っている研究者に大きな価値です。

プロトコル

1 試薬

  1. 取得細胞ライン; hESCs または hiPSCs 1、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) 29, OP9 DL4 実質 30 ,。 31.
  2. 試薬調製
    1. PBS でゼラチンの 0.1% の w/v ソリューションを準備します。オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい、早かった後 4 ° C で保管を。
      1. ゼラチン コーティングの容器を準備します。0.1% ゼラチン液 1.5 mL でコート 6 よく料理します。室温で 15 分間インキュベートします。使用の直前に残りのゼラチン液を吸い出しなさい
        2. 。
    2. 15 %v/v FBS と 1 x 抗生物質 IMDM、MEF メディアを準備します。使用する前に 2 mM L グルタミン 400 μ M monothioglycerol (MTG) と補完し、4 で保存 ° C
    3. は、20 %v/v ノックアウト血清交換 (KOSR) を含む DMEM/F12 のソリューションとして hPSC 培地、1 x 非必須アミノ酸 (NEAA)、1 x 抗生物質、55 μ M β-メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン 10 ng/mL bFGF を準備します。フィルター 2 μ m のフィルターで滅菌し、暗闇の中で保管して 4 ° C
    4. 5 %v/v KOSR DMEM/f12 キーと 4 mM 塩酸フィルター分注、2 μ m のフィルターで滅菌し、暗闇の中で保管して 4 のソリューションとして血清無料準備洗浄メディア ° C
    5. を作る 1 mg/mL DNase 私 DNase を溶解することによりソリューション私は氷のように冷たい、滅菌脱イオン水に 3-4 時間。フィルター 2 μ m のフィルターで滅菌し、-20 で因数を格納する ° C
    6. 洗浄メディアでストップ ソリューションの準備: 追加 10 %fbs と 10 μ G/ml DNase 私。ストップ ソリューションを用意する必要があります使用の直前にします
      7. 。
    7. の準備 (例えば マトリゲル、ここに至ってマットと呼ばれる) の基底膜マトリックス混合溶液
      。 注: 4、氷の上に準備とマットの混合物を使用してすべてのステップが実行必要があります ° C. 雪解けの 4 ° C で氷でマットは夜間に凍結します。10 mL を追加することでマットを 1:1 希釈冷たい IMDM と一晩 4 ° C で氷の寒さ。追加 20 mL とマットの混合物を希釈冷たい IMDM と一晩 4 ° C で氷の寒さ。中古冷蔵チューブに使用するまで-20 ° C でストア因数。使用する準備ができたら、解凍 4 ° C で一晩マットの混合物
      1. コート マット細胞培養皿
        。 注: コーティング マット板のすべてのステップは、氷の上行わなければなりません。事前に少なくとも 1 時間-20 ° C で 6、24 ウェル プレートを冷やします。コート プレートに準備ができたら、それらを氷の場所します。4 x 希釈マット、削除し、余分なソリューションを再使用の各ウェルをコートします。30-60 分間氷の上を残し、余分なマットを吸引します。ドライ コーティングの 72 h 以内 3 h 使用の最低 37 ° C 5% CO 2 インキュベーターでマット コーティング プレート.
    8. 10% の溶液を準備 3 4 4 遮光ボトルや店舗に 2 μ m のフィルターで滅菌フィルターのための 4 ° C で氷冷、蒸留水、脱イオン水で 10 %w/v BSA を溶解することにより牛血清アルブミン (BSA) ° C
    9. は、アスコルビン酸溶液を準備します。3 4 時々 溶解するまで旋回のため氷の上の冷たい、蒸留水、脱イオン水で L-アスコルビン酸の 5 mg/mL の溶液をゆっくりと溶解します。フィルター 2 μ m のフィルターで滅菌し、-20 で因数を格納する ° C
    10. は、IMDM:Ham の 75: 25 のソリューションを無血清分化 (SFD) メディアを準備 ' s F-12、0.5 %bsa、B27 と 0.5 x N2 サプリメント x 1 を追加。店で 4 ° c. の追加 1 x L グルタミン、50 μ g/mL アスコルビン酸、MTG、400 μ M 150 μ g/mL ホロ トランスフェリンのすぐ前を使用する
      11. 。
    11. 、メーカーごとの幹細胞の無血清培地 (例えば StemPro、ここに至って SP34 と呼ばれる) の準備 ' の指示。店で 4 ° c. の追加 1 x L グルタミン、50 μ g/mL アスコルビン酸、MTG、400 μ M 150 μ g/mL ホロ トランスフェリンのすぐ前を使用する
      12. 。
    12. は、最終濃度 0.2 %w/v 1:4 FBS:PBS 溶液中に溶解のコラゲナーゼ II によって 0.2% コラゲナーゼ II ソリューションを準備します。少なくとも 15 分フィルター 2 μ m フィルター ソリューションを殺菌し-20 で因数を格納 37 ° C の水浴中で溶ける ° C
    13. 5% の解決策として並べ替え蛍光活性化セル (FACS) バッファーを準備使用するすぐに事前 IMDM の FBS
      14. 。
    14. 準備 OP9 メディア α MEM, 20 %fbs, L-グルタミン, 2 mM のソリューションとして、1 x 抗生物質。フィルター 2 μ m のフィルターで滅菌し、4 で保存する ° C
    15. は、3 mL の前検体量、または 100 mL ボトルとしてセルロース ベースのメディア (例えば MethoCult、ここに至ってメックと呼ばれる) を取得します。到着時に 100 mL メックを使用している場合は分割 14 mL の円錐管に 2.5 mL 因数
      。 注: すべての因数は-20 ° C MeC 培地因数は直前に解凍する必要がありますに格納される必要がありますを使用します
      16. 。

2。HPSCs の中胚葉分化

MEFs に
  1. 、hPSC の成長細胞株の 5% CO 2 と 37 ° C の定温器で、70-80% の confluency
    。 注: hPSCs はシャープ、未分化の境界線を持つ必要があります
    2. 。
  2. 準備マット コーティング容器、hPSCs を通過する前に 24 h.
    注: マット コーティング 6 よく料理の総数は hPSC ラインで異なります。通常、6 も 3品で MEFs に合流 hPSCs の 6 ウェル皿あたり十分です。 後続の区別に使用するどのように多くのマット コーティング 6 よく料理を決定する最初の分化前に、合流 hPSCs:MAT 井戸 (1:4、1:3、1:2 など) の縦横比の異なる
    1. 実行試みフィーダー枯渇します
      。 注: hPSCs、マットの上にメッキ後 24 h はセルのサイズで約 10-20 細胞の塊で、80-90% の合流をする必要があります
      2. 。
  3. HPSC メディアを吸引し、37 ° C 0.25% トリプシン-EDTA 各 1分間吸引も、各ウェルに 1 mL 停止メディアを追加 1 mL を追加。細胞スクレーパーを使用して、プレートから細胞をこすり取る。各ウェルに 1 mL 洗浄バッファーを追加します。
    1. 2 mL の血清ピペットを使い、カップ刻んだ 3 - 5 回細胞の大きな塊を分割し、50 mL の円錐管にセルを転送します。遠心分離機の 330 x g で 5 分間で hPSCs
  4. HPSC メディア 2 mL と同等の容量のセルも使用するマット コーティング容器のあたりに再懸濁します。容器に hPSCs の 2 mL/井戸を追加し、5% CO 2 と 37 ° C のインキュベーターで一晩インキュベートします
    5. 。
  5. 24 h 後、メディアを吸引し、37 ° C 0.05% で置き換えます 1 分トリプシン-EDTA トリプシン-EDTA の吸引し、1 mL 停止メディアを追加します。細胞スクレーパーと積極的に細胞をこすり取る。各ウェルに 1 mL 洗浄メディアを追加します。2 mL の血清ピペットを使い、カップ刻んだセル 1-2 回と 50 mL の円錐管に転送します。220 x g で 5 分間で細胞を遠心
    注: トリプシン-EDTA 処理翔の時間の長さld は、hPSC 行ごとに治験責任医師によって決定されます。トリプシン処理は、可能な限りの単一細胞解離を引き起こすことがなく適用されるべき。この手順はマット コーティング プレートからのすべての hPSCs をデタッチする必要がありますが単一細胞解離にはなりません。結果 EBs 平均 6-10 セルである必要があります
    6. 。
  6. は、メディアを吸い出しなさい。5 mL の血清ピペットを使用して、軽く 20 mL 洗浄メディアで細胞を再懸濁します。220 x g で 5 分間遠心
  7. には、0 日目メディア (表 1) での EBs 優しく再懸濁します。2 mL の 10 mL の血清ピペットを使用して 6 ウェル低付着性細胞培養皿の各ウェルに EBs を含む分化培を調剤します。37 ° C 5% CO 2 5% O 2 (複数ガス) インキュベーターにします
    。 注: 0 日メディア: SFD 培地 10 ng/mL BMP4 (表 1)。HPSCs のすべての 2 つのプレート、1 つ 6 ウェル低付着性細胞培養皿を使用します
    8. 。
  8. 24 h 後に、2 mL 1 日 1 メディア (表 1) を追加します。複数のガスのインキュベーターで一晩細胞をインキュベートします
    。 注: 1 日目メディア: SFD 培地 10 ng/mL BMP4 と (表 1) 各ウェルに 10 ng/mL bFGF
    9. 。
  9. 18 時間後、慎重に 5 mL の血清ピペット 100 x g で 5 分間洗浄でのスピンと EBs の収穫、全体の文化を組み合わせて 10 mL IMDM。100 x g で 5 分間吸引メディアでスピンします
    。 注: 文化の残骸が残ります。低速 (100 x g) でこの遠心分離のステップが残骸が削除されます
    10. 。
  10. 日 2 メディア (表 1) を添加した SFD メディアで EBs を優しく再懸濁し、6 も低付着性細胞培養プレートによくあたり 2 mL を調剤します。30 のための 37 ° C マルチガス インキュベーターで孵化させなさい
    注: 2 日目メディア: 10 ng/mL BMP4 と 5 ng/mL bFGF 適切な WNT アゴニストやアンタゴニスト (表 1)。
    1. 追加 3 μ M 決定的な造血前駆細胞を指定する CHIR99021。また、3 μ M を追加 IWP2、1 ng/mL アクチビン A 原始造血前駆細胞を指定します
      2. 。
  11. 造血前駆仕様のセクション 3 に続行します
。

3. CD34 の仕様 + 造血前駆細胞

  1. 30 時間後の分化の日 3 血清学的 2 mL ピペットを使い、EBs を分離します。50 mL の円錐管に移し、遠心分離機の 330 x g で 5 分は軽く再懸濁します、IMDM の 10 mL で洗浄します。330 x g で 5 分間で再び細胞を遠心
  2. 日 3 メディア (表 2) で EBs を再懸濁します、低付着性 6 ウェル プレートの各ウェルに 2 mL を分注します。72 h の 37 ° C マルチガス インキュベーター内のセルを孵化させなさい
    注: 3 日目メディア: SP34、15 の VEGF の ng/mL と 5 ng/mL bFGF (表 2) を添加しました。分化の 3 日目で収穫されるメディアの pH は (すなわち 黄色-オレンジ色のメディア) 変わって大幅場合は、ウェルあたりより多くのメディアを追加します。また、0 日目にウェルあたり少ない EBs を使用します
    3. 。
  3. 後 72 時間培養の日 6 メディア (表 2) の 2 mL を各ウェルに追加します。追加 48 h の 37 ° C のマルチガス インキュベーターで孵化させなさい
    注: 6 日目メディア: SP34 培地 15 ng/mL VEGF、5 ng/mL bFGF、200 ng/mL SCF、4 IU EPO、20 ng/mL IL 6、10 ng/mL、IL 11、50 ng/mL IGF-1 (表 2)。場合はより多くのメディアは、ステップ 3.1 で追加された、その追加メディアの相当額 3.2 で、最終的なサイトカイン濃度は変わりません
    4. 。
  4. は、分化の 8 日目で CHIR99021 扱われる EBs を分離します。セクション 4 に進みます
    5. 。
  5. IWP2-50 mL の円錐管への分化は 8 日扱われる EBs を収穫しています。330 x g で 5 分間遠心は優しく日 8 メディア (表 2) に再懸濁します。低付着性料理 37 ° C 5% CO 2 インキュベーターで 24 時間インキュベートします。セクション 4 に進みます
    。 注: 8 日目メディア: SP34 培地 100 ng/mL SCF、2 IU EPO、10 ng/mL IL 6、5 ng/mL IL 11、25 ng/mL IGF-1、30 ng/mL TPO、10 ng/mL、Flt3 L、30 ng/mL IL 3 (表 2).

4。EBs の解離・造血前駆細胞分離酵素

  1. 50 mL の円錐形に血清ピペットを使い、EBs の分離管。330 x g で 5 分吸引、上澄みを離れて間遠心します
    2. 。
  2. は、EBs に 0.25% トリプシン-EDTA の 2 mL を追加します。停止液を 8 分追加 5 ml 37 ° C の水浴中 5 s. 加温の渦。330 x g で 5 分吸引、上澄みを離れて間遠心します
    3. 。
  3. は、コラゲナーゼ II の 5 mL の EBs を再懸濁します。渦 5 s と 37 ° C の水浴で孵化させなさい。60 分、5 の渦後 s、停止液を 5 mL を追加。上清を 5 分吸引 330 x g でスピンします
    4. 。 FACS バッファーの
  4. で 1 mL では、細胞を再懸濁します。40 μ m の細胞ストレーナーをセルを通過します。これはいずれかの微量細胞塊を削除します
    5. 。
  5. のセルをカウントします。14 mL の円錐管に分注 1 x 10 の 6 セル。FACS バッファーに 5 × 10 6 セル/ml の濃度で細胞再懸濁します 5 分 330 x g でセルをスピンします。流れフローサイトメトリーによるカラー コントロールの各条件のセルの因数とプールの 10%。暗闇の中、氷の上で 30 分間抗体で細胞をインキュベートします
    。 : 注 テーブルの材料 に蛍光体の組み合わせを提案しました。
    1. の IWP2 処理細胞、抗 CD34 とアンチ CD43 抗体を使用します
      2. 。
    2. の CHIR99021 処理細胞、反 CD184 反-CD73、アンチ CD43 抗 CD34 抗体を使用します
      3. 。
  6. FACS バッファーを使用して 2 回細胞をすすいでください。330 x g でスピンの 5 分は、最終 5 x 10 6 セル/mL の濃度で細胞を再懸濁します
    7. 。 フローサイトメトリーによる細胞は
  7. 分析または分離。プリミティブの造血前駆細胞 CD34 と CD43 式 ( 図 2 a) を分析します。決定的なの造血前駆細胞の分離、彼 (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) によって FACS ( 図 2 b)。チルドの FACS バッファーを含む管内細胞を収集します
    8. 。 決定的な造血の可能性を評価するために
  8. 彼の分離、内皮-造血遷移のセクション 5 または T リンパ球の試金のためのセクション 7。プリミティブの造血 CFC アッセイのセクション 6 に進みます
    9. 。

5。内皮-造血遷移

  1. スピン分離 CD34 + CD43 − CD73 − CD184 − 330 x g で 5 分間で細胞再懸濁します彼の細胞で 200,000 セル/mL (メディア表 2)。96 ウェル低付着性細胞培養プレートで 50 μ L の因数でセルを配布します。37 ° C 5% CO 2 5% O 2 マルチガス インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします
    。 注: 彼はメディア: 10 ng/mL IL-6、5 ng/mL IL-11、25 ng/mL 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L、30 ng/mL IL 3 IGF-1、2 IU EPO 100 ng/mL SCF 5 ng/mL bFGF 5 ng/mL VEGF 添加 SP34 メディア、10 ng/mL BMP4、20 ng/mL SHH、10 μ g/mL アンジオテンシン II および 2 x 10 5 セル/mL (表 2) で 100 μ M ロサルタン カリウム。
  2. (ステップ 1.2.7.1 参照) 24 ウェルでマット コーティングのプレートを必要に応じて準備します
    3. 。
  3. セル一晩 6-10 セルの塊に集計されます。細胞細胞のそれぞれの 50 μ L のボリューム、そっと次の朝、24 ウェル マット コーティング プレートの中心にセルを転送します。セルがアタッチされるまで優しく 4-6 時間、37 ° C マルチガス インキュベーターでプレートを配置します
    4. 。 セルを接続した後、
  4. は各ウェルに新鮮なメディアの 1 つの mL を追加します。造血細胞が表示されるまで、37 ° C 5% CO 2 5% O 2 マルチガス インキュベーターでセルを孵化させなさい (通常 5-7 日; 図 2 D)。光学顕微鏡下で 100 倍の倍率を視覚化します
    5. 。
  5. 優しく細胞から彼のメディアを削除することによって決定的な造血前駆細胞を収穫します。このメディアを 40 μ m の細胞のストレーナを通過し、収集します。よく付着性のセル、追加 0.5 mL 0.25% トリプシン-EDTA のセルに 5 分追加 0.5 mL ストップ ソリューションを各ウェルの 37 ° C で孵化させなさいと。すべての付着をプールに同じ 40 μ m セル ストレーナーを介して細胞と非付着性のセルを一緒に通過します。330 x g で 5 分間で回転
    1. この大量培養の CFC の可能性を評価するためのセクション 6 に進みます
      2. 。
  6. FACS バッファーで 2 回洗浄を行う。330 x g で 5 分間で回転
  7. では、5 x 10 6 セル/mL で FACS バッファー内細胞を再懸濁します。暗闇の中で氷の上で 30 分間抗 CD45、抗 CD34 抗体で細胞を染色 (fluorophores が付いている テーブルの材料 を提案).
  8. は、FACS バッファーで 2 回洗浄します。330 x g で 5 分間で回転
  9. 分離 CD34 + CD45 ( 図 2 e) FACS による細胞の +。チルドの FACS バッファーにセルを並べ替えします
    10. 。
  10. 決定的な CD34 を評価 + CD45 + 造血前駆細胞として必要な (セクション 6、7 節のリンパの可能性または別の自主測定で CFC アッセイ).

6。CFC アッセイ

  1. CFC アッセイ用各サンプルのメックの因数を解凍
    2. 。
  2. は、4.5、4.7、5.5、または 5.9 を測定した (ステップするには) をメックにセルを追加します。渦徹底的にさせ製造業者に従って、空気の泡を散らすまでの 5-10 分略、メック文化 ' の指示。16 を使用 ½ 3 mL の注射器の針のゲージ、MeC の 2 mL を慎重に削除します
    。 注: 一般的なめっきの密度の範囲 1,000-20,000 セル/ml 予想される前駆頻度に応じてします
    3. 。
  3. は、慎重に 1 mL 各 2 35 mm ティッシュの培養皿のメック細胞の混合物を分配します。軽くタップ、皿を回転させて 35 mm 料理メックを均等に配る。15 cm 培養皿に上記料理の各場所は、水で満たされました。37 ° C 5% CO 2 インキュベーターで孵化させなさい
    4. 。
  4. は、40 倍の倍率を使用して光学顕微鏡を使用するカルチャのメックを視覚化します。得られる様々 なフロンを定量化します。原始的な CFC アッセイ ( 図 2) をめっき後 8-10 日を分析します。めっき後 14 日決定的な CFC アッセイを分析します。 図 2 階 に見られる代表的な CFC アッセイ コロニー形態
    5. 。

7。確立決定的な造血潜在的に T 細胞アッセイ

  1. , を 100 mm 培養皿 30 合流まで細胞の成長 OP9 DL4 の 31 , 32.
    1. 雪解け OP9 DL4 細胞 T 細胞試金をめっき前に 72 96 h。10 mL OP9 メディアで DL4 OP9 細胞を再懸濁し、10 cm のプレートに分注します。37 ° C 5% CO 2 インキュベーターで 70-90% 合流まで成長します
      2. 。 100 mm ディッシュから DL4 OP9 細胞を収穫する
    2. メディアを取り出し、0.25 %5 mL を追加 5 分トリプシン-EDTA 停止 5 mL OP9 メディアとトリプシン活性。スピン再懸濁します 5 分 330 x g でセル 1 mL OP9 メディア内のセルとセルをカウントします
      。 注: 合流する OP9 DL4 セルの 1 つの 10 cm プレートになります約 10 x 10 6 細胞 OP9 DL4
      3. 。
    3. プレート 2 x 10 6 12 mL OP9 細胞 T 細胞アッセイする前に 48 h 24 ウェル皿 (0.5 mL/ウェル) にメディア。37 ° C 5% CO 2 インキュベーターで成長です
      4. 。
  2. OP9 DL4 細胞 OP9 培地の 1 に (、4.5、4.7、5.5、または 5.9 の手順で得られた) を試金するため 2,000-10,000 のセルを追加: 30 ng/mL SCF (最初 6 日のみ)、5 ng/mL IL-7、5 ng/mL FLT3 L. インキュベート 37 ° C 5% CO 2 社ubator。このステップでメディアの変更は発生しません
    3. 。
  3. すべての 4 - 5 日間、通過 6 よく料理に新鮮な OP9 DL4 の間質細胞に T 細胞の前駆細胞。1 mL ピペットで細胞をカップ刻んだし、塊を削除する 40 μ m のフィルターを通過します。330 の x g で 5 分間吸引メディア オフで回転します。新鮮な OP9 培地 5 IL-7 の ng/mL と 5 ng/mL Flt3-L は、新鮮な DL4 OP9 細胞上の場所の 2 mL の細胞を再懸濁します
    。 注: 通過、前に 48 h 12 mL OP9 メディアに 2 × 10 6 新鮮な OP9 DL4 細胞をプレートし、6 よく料理に 2 mL/ウェルを配布します
    4. 。
  4. 精力的に共培養の少なくとも 21 日後カップ刻んだ細胞と細胞の残骸を削除する 40 μ m のフィルターを通過します。5 分間 330 x g でスピンし、上清を吸引します
    5. 。
  5. 冷たい FACS バッファーで 2 回洗浄します。330 x g で 5 分間で回転
  6. では、5 x 10 6 セル/mL で FACS バッファー内細胞を再懸濁します。(推奨される蛍光体の組み合わせは、テーブルの材料) 暗闇の中で氷の上で 30 分間抗 CD8 抗 cd4 抗体、抗 CD56 抗 CD45 抗体で染色細胞。分析からの残骸を削除するライブ/死細胞染色 (DAPI、等) を適用します
    7. 。
  7. は、FACS バッファーで 2 回洗浄します。330 x g で 5 分間で回転
  8. T リンパ球前駆細胞 ( 図 3) の存在を評価する流れの cytometer を使用して細胞を分析します
    9. 。

結果

HPSCs からプリミティブと決定的な造血前駆細胞の誘導を描いた回路図は図 1に示します。中胚葉分化、造血前駆仕様に続いての 2 ~ 3 日中に発生するカノニカル WNT によるパターニングします。

代表フローサイトメトリーによる解析とコロニー形成 hPSC 由来造血分化文化のセルロースの試金は

ディスカッション

このプロトコルでは、プリミティブ型または決定的な造血前駆細胞の分化の急速、血清無料、実質無料のメソッドについて説明します。プリミティブ型または決定的な造血前駆細胞の中胚葉性仕様は、一意にカノニカル WNT シグナルの小分子阻害剤を悪用当社のプロトコルを使用して確実に実現できます。CHIR9902133 GSK3β 阻害剤によるステージ固有 wnt シグナルの活性化を生?...

開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は、血液部門内科学、ワシントン州大学医科大学院によってサポートされています。CD は、国民の中心、肺および血の協会からの T32HL007088 によって支えられました。CMS は、血液学者賞のアメリカの社会によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD)Corning10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell ratedGemini Bioproducts100-500
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30396.03
L-glutamine, 200 mM solutionLife Technologies25030-081
Penicillin-streptomycinLife Technologies15070-063
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies25200056
0.05% Trypsin-EDTALife Technologies25300054
Gelatin, porcine skin, Type ASigma-AldrichG1890
Alpha-MEMLife Technologies12000-022
DMEM-F12Corning10-092-CV
Knock-out serum replacementLife Technologies10828028"KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA)Life Technologies11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solutionLife Technologies21985023
Hydrochloric acidSigma-AldrichH1758
Fraction V, Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1605
Ham's F12Corning10-080
N2 supplementLife Technologies17502048
B27 supplement, no vitamin ALife Technologies12587010
Stempro-34 (SP34)Life Technologies10639011"SP34"
Growth factor reduced MatrigelCorning354230"MAT"
L-absorbic acidSigma-AldrichA4403
Human serum transferrinSigma-Aldrich10652202001
Monothioglycerol (MTG)Sigma-AldrichM6145
Collagenase BRoche11088831001
Collagenase IILife Technologies17101015
DNaseICalbiochem260913
Phosphate Buffered Saline (PBS)Life Technologies14190144
bFGFR&D Systems233-FB
BMP4R&D Systems314-BP
Activin AR&D Systems338-AC
VEGFR&D Systems293-VE
SCFR&D Systems255-SC
IGF-1R&D Systems291-G1
IL-3R&D Systems203-IL
IL-6R&D Systems206-IL
IL-7R&D Systems207-IL
IL-11R&D Systems218-1L
TPOR&D Systems288-TP
EPOPeprotech100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L)R&D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
Angiotensin IISigma-AldrichA9525
Losartan PotassiumTocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4BD Biosciences560650Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8BD Biosciences561950Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12BD Biosciences340441Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12BD Biosciences348801Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10BD Biosciences555475Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1BD Biosciences557833Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1BD Biosciences642284Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159BD Biosciences555518Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2BD Biosciences550257Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5BD Biosciences555976Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)BD Biosciences564907Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cellsHolmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034Stemcell Technologies4034"MeC"
Milli-Q water purification systemEMD Millipore
5% CO2 incubatorSet at 37 C
Multigas incubatorSet at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plateCorning353046
24 well tissue culture plateCorning353226
6 well low-adherence tissue culture plateCorning3471
24 well low-adherence tissue culture plateCorning3473
35 mm tissue culture dishesCorning353001
Blunt-end needle, 16 gaugeCorning305198
3 cc syringesCorning309657
5 mL polypropylene test tubeCorning352063
5 mL polystyrene test tubeCorning352058
15 mL polypropylene conicalCorning430791
50 mL polypropylene conicalCorning430921
2 mL serological pipetteCorning357507
5 mL serological pipetteCorning4487
10 mL serological pipetteCorning4488
25 mL serological pipetteCorning4489
Cell scrapersCorning353085
2.0 mL cryovialsCorning430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainerCorning352235
40 µM cell strainerCorning352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo softwareTreeStar
Water bathSet at 37 C
0.22 µM filtration systemCorning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

参考文献

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