Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

Özet

Rejeneratif tıp için önemli amaçlarından biri üretimi ve hematopoetik kök hücre (HSCs) insan pluripotent kök hücrelerden (hPSCs) elde edilen bakımı sağlamaktır. Yakın zamana kadar hPSCs HSCs ayırt etmek için çabaları ağırlıklı olarak HSC potansiyel eksikliği ve bunun yerine sarısı sac hematopoiesis benzer hematopoetik ataları üretilip. Elde edilen bu hematopoetik ataları yarar vitro hastalığı modelleme çeşitli yetişkin hematopoetik bozukluklar, özellikle de lenfoid soy için sınırlı olabilir. Ancak, son zamanlarda erythro-myelo-lenfoid multilineage kesin hematopoetik ataları burada anahat bir sahne özel yönlendirilmiş ayırt etme protokolünü kullanarak hPSCs oluşturmak için yöntemleri anlatmıştık. Enzimatik ayrılma hPSCs membran matris kaplı plasticware Tarih, embryoid organları (EBs) oluşur. EBs farklı mesoderm için kesin hematopoetik programa GSK3β inhibitörü, CHIR99021 daha sonra belirtilen rekombinant BMP4 tarafından. Alternatif olarak, ilkel hematopoiesis PORCN inhibitörü, IWP2 belirtilir. Hematopoiesis daha fazla rekombinant VEGF eklenmesi ve destekleyici hematopoetik sitokinler sürülür. Bu yöntem kullanılarak oluşturulan elde edilen hematopoetik ataları hastalık ve gelişimsel modelleme, içinde vitroiçin kullanılmak üzere potansiyeline sahiptir.

Giriş

İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs) insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) ve İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) kapsayan olarak tanımlanır ve uygun büyüme koşullarda kendini yenileme geçiren sadece benzersiz yeteneği var, Ama aynı zamanda, tüm hücre türleri ayırt etmek için kapasite elde edilen üç germ katmanlardan: endoderm, mesoderm ve ektoderm1. Bu benzersiz yetenekleri nedeniyle hPSCs rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve hücre tabanlı terapiler2büyük sözü tutun. Birden çok hücre tipleri başarıyla hPSCs farklılaşmış iken, bir önemli sorun sadece yetişkin gibi hPSC kaynaklı hematopoetik kök hücre (HSCs) ve kesin hematopoetik ataları vitro belirtimidir.

Bir büyük olasılıkla insan HSCs geliştirilmesi için hPSCs gelen insan embriyo3içinde birden çok hematopoetik program varlığı engeldir. Ortaya çıkıyor, "ilkel hematopoiesis," olarak adlandırdığı ilk programı içinde extraembryonic sarısı sac doku kaynaklı ve geçici üretiminin erythroblast ataları (EryP-CFC), makrofajlar ve megakaryocytes tarafından en iyi karakterizedir. Özellikle, bu bilgisayar programı does değil vermek artış HSCs için ne o does vermek artış T ve B lenfoid ataları için. Ancak, sarısı sac geçici erythro myeloid yaratıcı (EMP4,5,6,7,8) gibi sınırlı kesin hematopoetik ataları ortaya çıkmasına ve erythroid-eksik lenfoid astarlanmalıdır multipotent progenitör (LMPP9). Ancak, tam olarak multipotent veya yetişkin alıcılar HSC benzeri engraftment yeteneğine ne EMP'leri ne de LMPPs. Buna ek olarak, daha sonra gelişmede, embriyonun uygun, HSC dahil olmak üzere tüm yetişkin hematopoetik soy için sebebiyet veren aort-erbezi-mesonephros bölgesinde klasik tanımlamak "kesin" hematopoetik bilgisayar programı belirtilir. Endotel-için-hematopoetik geçişe hemogenic endotel (o)3,10,11 üzerinden bir çentik bağımlı moda bu içi embriyonik kesin hematopoetik hücreler tayini oluşur ,12,13,14. Sulandırma kapasitesi dışında EMP ve (gözden başvuruları3' te,13 LMPP bu kesin hematopoetik ataları ayırmak için multilineage potansiyel ve çentik-bağımlılık bu hücre kullanılabilir ).

HPSCs ilkel ve kesin hematopoetik belirtiminden yöneten mechanism(s) anlama olası hPSC hatları çeşitli genelinde kesin hematopoetik ataları tekrarlanabilir üretimi için önemlidir. Yakın zamana kadar multipotent ilkel ve kesin hematopoetik ataları ayrı hPSC farklılaşma protokolleri15,16,17,18yoktu, 19,20,21,22,23,24,25. Pek çok yaklaşım fetal sığır serum (FBS) ve/veya stromal ortak kültür ilk kullanarak ilkel kesin hematopoetik potansiyel15,ve16karışımları ile hPSC farklılaşma potansiyeli hematopoetik özetlenen, 17,19,22,23,25. Ayrıca, birçok serum-Alerjik hematopoetik protokolleri mesoderm hematopoetik potansiyel18,20,21, liman hPSCs üzerinden tayini için sinyal gereksinimleri tarif var 24. ancak, bu yöntemleri hala her iki program heterojen karışımları için doğuran gibi kullanımları klinik uygulamaları ve anlayış gelişimsel mekanizmaları sınırlı olabilir.

Biz son zamanlarda AKTİVİN/NODAL ve hPSC elde edilen mesoderm18,26 hematopoetik belirtiminde ilkel ve kesin WNT sinyal için sahne özel sinyal gereksinimleri ana hatlarıyla bu çalışmalar, yerleşik . İkincisi özellikle benzersiz sahne özgü WNT sinyal işleme kullanımı sadece ilkel ya da sadece kesin hematopoetik ataları26belirtimi için sağlar. Sırasında mesoderm belirtimi, kurallı WNT sinyal PORCN inhibitörü IWP2 ile inhibisyon CD43 belirtiminde sonuç+ EryP-CFC ve hiçbir tespit lenfoid potansiyeli ile Miyeloid ataları. Keskin aksine, kurallı WNT GSK3β inhibitörü ile CHIR99021, farklılaşma aynı aşaması sırasında sinyal stimülasyon tespit CD43 tam yokluğunda sonuçlandı.+ aynı anda lider ise EryP-CFC, için CD34 tayini+CD43− o. Bu nüfus sahip Miyeloid, HBG-erythroid ve T-lenfoid potansiyeli ifade etmek. Daha sonraki analizler bu CD7327,28 ve CD18428ve hematopoetik potansiyel ifadesi eksik olarak ÇENTİK bağımlı28olduğunu tespit etti. Ayrıca, tek hücreli klonal analizleri bu kesin hematopoetik soy multipotent tek hücreleri28elde edilebilir gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar sahne özgü WNT sinyal işleme saf ilkel hematopoetik ataları veya multipotent ÇENTİK bağımlı kesin hematopoetik ataları belirtebilirsiniz gösteriyor.

Burada, biz sadece ilkel veya kesin hematopoetik ataları, kurallı WNT Mezodermal desenlendirme ve onların aşağı akım hematopoetik soyu sırasında deneyleri sinyal manipülasyonu yoluyla verir bizim farklılaşma strateji anahat. Bu ilkel veya kesin hematopoetik ataları hPSCs rejeneratif tıp uygulamaları için gelen üretiminde ilgilenen araştırmacılar için çok değerli bir protokoldür.

Protokol

1. reaktifler

  1. elde edilir hücre çizgileri; hESCs veya hiPSCs 1, fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) 29, OP9-DL4 stroma 30 , 31.
  2. reaktif hazırlık
    1. PBS içinde jelatin % 0,1 w/v çözeltisi hazırlamak. Tarafından ısıyla sterilize ve aliquoting sonra 4 ° C'de depolayın.
      1. Hazırla jelatin kaplı plasticware. 6-iyi yemekleri 1,5 mL %0,1 jelatin çözeltisi ile kat. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Kullanımdan hemen önce kalan jelatin çözüm Aspire edin.
    2. % 15 v/v FBS ve 1 x antibiyotik ile IMDM yaparak MEF ortam hazırlamak. Ek 2 mM L-glutamin ve 400 µM monothioglycerol (MTG) ile kullanımdan önce ve depolamak saat 4'te ° C.
    3. HPSC kültür ortamı olarak DMEM/F12 bir çözüm ile % 20 v/v nakavt serumu değiştirme (KOSR), 1 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 1 x antibiyotik, 55 µM β-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin ve 10 ng/mL bFGF hazırlayın. 2 µm filtre ile sterilize ve karanlıkta da saat 4'te depolamak için filtre ° C.
    4. DMEM/F12 ile % 5 v/v KOSR ve 4 mM HCl. filtre 2 µm filtre ile aliquot, sterilize ve karanlıkta da saat 4'te depolamak için bir çözüm olarak hazırlama serum ücretsiz yıkama medya ° C.
    5. 1 mg/mL Dnaz olun ben Dnaz eriterek tarafından çözüm ben 3-4 h on Ice buz gibi steril deiyonize su içine için. 2 µm filtre ile sterilize ve aliquots -20, depolamak için filtre ° C.
    6. Hazırlamak yıkama medya ile DURMAK eriyik: 10 Ekle % FBS ve 10 µg/mL Dnaz ben. DURMAK eriyik hazırlanmalıdır hemen önce kullan.
    7. Hazırlamak membran matris (örneğin, matrigel, bu andan MAT anılacaktır) karışım çözüm.
      Not: hazırlama ve MAT karışımı kullanarak tüm adımları 4 veya buz üzerinde gerçekleştirilmesi gereken ° C. gecede MAT buz 4 ° C'de dondurulmuş tezcan. 10 mL ekleyerek MAT 1:1 oranında seyreltin buz gibi IMDM ve buz 4 ° C'de soğuk bir gecede. MAT karışımı ile bir ek 20 mL seyreltik buz gibi IMDM ve buz 4 ° C'de soğuk bir gecede. Aliquot önceden soğutulmuş tüpler ve mağaza-20 ° c kadar kullan. Kullanım için hazır olduğunuzda gecede 4 ° C'de MAT karışımı tezcan
      1. Kat MAT hücre kültür plakaları.
        Not: Tüm adımları kaplama MAT plakaların buz üzerinde gerçekleştirilmesi gerekiyor. 6-iyi ve 24-iyi tabaklar-20 ° c en az 1 h için önceden chill. Kat kaplamalar için hazır olduğunuzda buza koy. Her şey ile kaldırma ve yeniden kullanarak herhangi bir aşırı çözüm 4 x seyreltilmiş MAT, kat. 30-60 dakika buzda bırakın ve aşırı MAT Aspire edin. MAT kaplamalı plakalar 3 h. kullanım kaplama 72 h içinde en az 37 ° C % 5 CO 2 Kuluçka Makinası.
    8. % 10 çözüm hazırlamak sığır Serum Albumin (BSA % 10 w/v BSA buz gibi distile, deiyonize su 3-4 h. 2 µm filtre ile bir şişe ışık engelleme ve mağaza içine 4'te sterilize etmek için filtre için 4 ° C'de eriyen tarafından) ° C.
    9. İçin bir çözüm askorbik asit hazırlayın. Yavaş yavaş 5 mg/mL solüsyon buz gibi distile, deiyonize su buz 3-4 h. bazen eriyene kadar girdap için L-askorbik asit geçiyoruz. 2 µm filtre ile sterilize ve aliquots -20, depolamak için filtre ° C.
    10. IMDM:Ham 75:25 bir çözüm yaparak serum-Alerjik farklılaşma (SFD) ortam hazırlamak ' s F-12, sonra % 0.5 BSA, 1 x B27 ve 0.5 x N2 takviyeleri ekleyin. Mağaza 4 ° C. Ekle 1 x 50 µg/mL askorbik asit, 400 µM MTG ve 150 µg/mL holo-transferrin hemen önceki kullanmak için L-glutamin.
    11. Hazırlamak serum-Alerjik kök hücre kültür medya (örneğin, StemPro, bu andan SP34 anılacaktır) Üretici ' s yönergeleri. Mağaza 4 ° C. Ekle 1 x 50 µg/mL askorbik asit, 400 µM MTG ve 150 µg/mL holo-transferrin hemen önceki kullanmak için L-glutamin.
    12. % 0,2 Collagenase II çözüm eriterek Collagenase II % 0,2 w/v 1:4 FBS:PBS çözümünde son bir konsantrasyon için hazırlayın. Filtre çözümü ile 2 µm filtre sterilize ve aliquots -20, saklamak için en az 15 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda dağıtılması ° C.
    13. Floresan aktif hücre sıralama (FACS) arabellek % 5 bir çözüm olarak hazırlamak kullanmak için hemen önceki IMDM FBS.
    14. Hazırlamak OP9 medya α-MEM, %20 FBS, 2 mM L-glutamin bir çözüm olarak ve 1 x antibiyotik. 2 µm filtre ile sterilize ve 4'te depolamak için filtre ° C.
    15. Methylcellulose tabanlı medya (örneğin, MethoCult, bu andan MeC anılacaktır) öncesi bölünmemeli 3 mL miktarları veya 100 mL şişe olarak elde edilir. Girişte, 100 mL MeC, kullanıyorsanız 14 mL konik tüpler içinde 2.5 mL aliquots bölün.
      Not: Tüm aliquots aliquots için hemen öncesinde çözdürülen-20 ° c MeC orta saklanmalıdır kullanın.

2. Mesoderm farklılaşma hPSCs

  1. Grow hPSC hücre satırlarda MEFs 37 ° C kuluçka %5 CO 2 ile % 70-80 confluency.
    Not: HPSCs keskin, farklılaşmamış sınırları olmalıdır.
  2. Hazırlamak MAT boyalı plasticware hPSCs passaging önce 24 saat.
    Not: MAT kaplamalı 6-iyi yemekler toplam sayısı hPSC hatları arasında değişir. Normalde, üç 6-iyi yemekler Konfluent hPSCs MEFs üzerinde 6-şey fincan başına yeterlidir.
    1. Yerine bir deneme besleyici-tükenmesi Konfluent hPSCs:MAT Wells (1:4, 1:3, 1:2, vb) daha önce kaç MAT kaplamalı 6-iyi yemekler için sonraki saptamaları kullanılması gerektiğini belirlemek için ilk farklılaşma farklı oranlara sahip.
      Not: 24 h kaplama MAT, hPSCs üzerine sonra boyutu yaklaşık 10-20 hücrelerde hücre kümeleri ile % 80-90 birleşmesi olmalıdır.
  3. HPSC medya Aspire edin ve 1 mL 37 ° C % 0.25 tripsin-EDTA her şey 1 dk. aspiratı ve her şey için 1 mL STOP medya ekleyin ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri plaka dışına kazı. Her şey için 1 mL yıkama arabellek ekleyin.
    1. Hücreler büyük kümeleri kadar kırmak ve hücreleri 50 mL konik tüp aktarmak için serolojik 2 mL damlalıklı ile 3 - 5 kere triturate. HPSCs vasıl 330 x g 5 dakika süreyle santrifüj kapasitesi
  4. HPSC medya için 2 mL eşdeğer toplam hacmi hücrelerde kullanılmak üzere MAT kaplanmış plasticware kuyu resuspend. 2 mL/iyi hPSCs için plasticware ekleyin ve gecede 37 ° C kuluçka %5 CO 2 kuluçkaya.
  5. 24 saat sonra medya Aspire edin ve yerine 37 ° C % 0.05 tripsin-EDTA 1 dk. tripsin-EDTA Aspire edin ve 1 mL STOP medya ekleyin. Hücreleri şiddetle bir hücre sıyırıcı kazı. 1 mL yıkama medya her şey için ekleyin. 2 mL serolojik damlalıklı ile hücreleri 1 - 2 defa triturate ve 50 mL konik tüp aktarın. Santrifüj kapasitesi 220 x g 5 dakika süreyle, hücre
    Not: Tripsin-EDTA tedavi shou zamanın uzunluğuld her hPSC satırı için araştırmacı tarafından belirlenecektir. Tripsin tedavi, tek hücreli ayrılma neden olmadan mümkün olduğunca uzun bir süre için uygulanmalıdır. Bu adım MAT kaplamalı plakalar üzerinden tüm hPSCs ayırmak ancak tek hücreli ayrışma sonucu değil. Sonuç EBs ortalama 6-10 hücre olmalıdır.
  6. Medya Aspire edin. 5 mL serolojik damlalıklı kullanarak, yavaşça 20 mL yıkama medya hücrelerde resuspend. 220 x g de 5 dakika süreyle santrifüj
  7. Yavaşça gün 0 medya (Tablo 1) EBs resuspend. EBs 10 mL serolojik damlalıklı kullanarak bir 6-şey düşük-yapışık hücre kültür yemek her kuyuya içeren farklılaşma medya 2 mL dağıtmak. Yerine bir 37 ° C % 5 CO 2 %5 O 2 (çoklu gaz) kuluçka makinesi.
    Not: Gün 0 medya: 10 ng/mL ile BMP4 takıma SFD medya (Tablo 1). HPSCs her iki tabak için bir 6-şey düşük-yapışık hücre kültür tabak kullanın.
  8. 24 saat sonra 2 mL gün 1 kitle iletişim araçları (Tablo 1) ekleyin. Bir çok Yakıt Ekstraktörü gecede hücrelerde kuluçkaya.
    Not: 1. gün medya: SFD medya ile 10 ng/mL BMP4 ve 10 ng/mL bFGF için her şey (Tablo 1).
  9. 18 h daha sonra hafifçe EBs serolojik 5 mL damlalıklı ve 100 x g 5 dk. yıkama için spin ile hasat ve tüm kültür 10 mL IMDM ile birleştirir. 100 x g 5 dk. aspiratı medya için spin.
    Not: Enkaz kültürlerde yer alır. Bu Santrifüjü adım düşük bir hızda (100 x g) enkaz kaldırır.
  10. Hafifçe 2 gün medya (tablo 1) ile desteklenmiş SFD medya EBs resuspend ve iyi başına 2 mL 6-şey düşük-yapışık hücre kültür kalıplara dağıtmak. 37 ° C çok Yakıt Ekstraktörü 30 h. için kuluçkaya
    Not: 2. gün medya: 10 ng/mL BMP4 ve 5 ng/mL bFGF ve uygun WNT agonist ve antagonist (Tablo 1).
    1. Ekleyin 3 µM kesin hematopoetik ataları belirtmek için CHIR99021. Alternatif olarak, 3 µM eklemek IWP2 ve 1 ng/mL aktivin A ilkel hematopoetik ataları belirtmek için.
  11. Devam hematopoetik progenitör belirtimi için Bölüm 3.

3. CD34 tayini + hematopoetik ataları

  1. 30 h sonra 2 mL serolojik damlalıklı gün 3 farklılaşma ile EBs yalıtmak. 50 mL konik tüp aktarmak ve 5 dk. hafifçe resuspend ve IMDM 10 mL ile yıkamak için de 330 x g santrifüj kapasitesi. Hücreleri yeniden vasıl 330 x g 5 dakika süreyle santrifüj kapasitesi
  2. EBs gün 3 medya (Tablo 2) resuspend ve 2 mL düşük-yapışık 6-şey plakaların her kuyuya dağıtmak. 37 ° C çok Yakıt Ekstraktörü 72 h. için hücrelerde kuluçkaya
    Not: 3. gün medya: SP34, 15 ng/mL VEGF ve 5 ng/mL bFGF (Tablo 2). Farklılaşma 3 gün hasat ortam pH (Yani, sarı-turuncu medya) önemli ölçüde değiştirildi şey başına daha fazla medya ekleyin. Alternatif olarak, daha az EBs iyi gün 0 kullanın.
  3. Sonra 72 h, kuluçka, her şey için gün 6 medya (Tablo 2) 2 mL ekleyin. 37 ° C çok Yakıt Ekstraktörü ek 48 h için kuluçkaya
    Not: Günde 6 medya: SP34 medya 15 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 IU EPO, 20 ng/mL Il-6, 10 ng/mL IL-11 ve 50 ng/mL IGF-1 (Tablo 2) ile desteklenmiştir. Daha fazla medya 3.1 adımda eklediyseniz, son sitokin konsantrasyonları aynı kalır sonra medya eşdeğer miktarda adım 3.2 ekleyin.
  4. Gün 8 farklılaşma CHIR99021 tedavi EBs yalıtmak. Bölüm 4'e devam.
  5. IWP2-tedavi EBs gün 8 50 mL konik tüp içine farklılaşma hasat. 5 dakika süreyle santrifüj 330 x g de hafifçe resuspend gün 8 medya (Tablo 2). 24 h 37 ° C % 5 CO 2 kuluçka düşük yapisan yemekler için kuluçkaya. Bölüm 4'e devam.
    Not: Gün 8 medya: SP34 medya 100 ng/mL SCF, 2 IU EPO, 10 ng/mL Il-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L ve 30 ng/mL IL-3 (Tablo 2) ile desteklenmiş.

4. Enzimatik EBs ayrılma ve hematopoetik progenitör yalıtım

  1. izole EBs ile serolojik damlalıklı 50 mL konik içine tüp. 5 dk. aspiratı süpernatant kapalı için 330 x g, santrifüj.
  2. 2 mL % 0.25 tripsin-EDTA EBs için ekleyin. 8 dk. eklemek 5 mL DURMAK eriyik için 37 ° C su banyosunda 5 s. Incubate için girdap. 5 dk. aspiratı süpernatant kapalı için 330 x g, santrifüj.
  3. 5 mL Collagenase II EBs resuspend. 5 için girdap s ve bir 37 ° C su banyosunda kuluçkaya. 60 dk, 5 için girdap sonra s ve DURMAK eriyik 5 mL ekleyin. Spin vasıl 330 x g 5 dk. aspiratı süpernatant kapalı için.
  4. 1 mL FACS arabelleği, hücreleri resuspend. Hücreleri bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek. Bu herhangi bir undissociated hücre kümeleri kaldırır.
  5. Hücreleri saymak. Aliquot 1 x 10 6 hücrelere 14 mL konik tüp. 330 x g 5 dk. Resuspend için hücreleri, 5 x 10 6 hücre/mL FACS arabellekte bir konsantrasyon hücreleri spin. Her koşul için akış sitometrik renk denetimleri hücrelerde aliquot ve havuzu %10. Buz, karanlıkta 30 dk antikor hücrelerde kuluçkaya.
    Not: Bkz: önerilen Malzemeler tablo kombinasyonlarda fluorophore.
    1. Hücreleri, IWP2 için tedavi anti-CD34 ve anti-CD43 antikorları kullanın.
    2. Hücreleri, CHIR99021 için tedavi anti-CD34, anti-CD43, anti-CD73 ve anti-CD184 antikorlar kullanın.
  6. İki kez FACS tampon kullanarak hücreleri durulayın. Spin de 330 x g 5 dk. Resuspend için 5 x 10 6 hücre/mL nihai bir konsantrasyon hücreleri.
    7. Akış Sitometresi tarafından
  7. analiz veya izole hücreler. İlkel hematopoetik ataları için CD34 ve CD43 ifade ( şekil 2A) analiz. O kesin hematopoetik ataları için izole (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) tarafından FACS ( şekil 2B). Tüpler soğutulmuş FACS arabellek içeren hücrelerde toplamak.
  8. Dan kesin hematopoetik potansiyeli değerlendirmek için o izole, Bölüm 5 endotel-için-hematopoetik geçişi için veya bölüm 7 T-lenfoid tahlil için devam edin. İlkel hematopoetik CFC deneyleri için Bölüm 6 için devam.

5. Endotel-için-hematopoetik geçiş

  1. Spin izole CD34 + CD43 − CD73 − CD184 − 5 dakika süreyle 330 x g hücreleri Resuspend o hücrelerde medya 200.000 hücre/mL (at Tablo 2). 50 µL aliquots bir 96-şey düşük-yapışık hücre kültür plaka hücrelerde dağıtın. Bir 37 ° C % 5 CO 2 %5 O 2 çoklu Yakıt Ekstraktörü gecede hücrelerde kuluçkaya.
    Not: O medya: takıma 5 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, 2 IU EPO, 10 ng/mL Il-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL IL-3 ile SP34 medya, 10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL ŞŞŞ, 10 µg/mL Anjiyotensin II ve 100 µM Losartan potasyum, 2 x 10 5 hücre/mL (Tablo 2).
  2. (Bkz. Adım 1.2.7.1) 24-şey MAT kaplamalı plakalar gerektiğinde hazırlayın.
  3. Hücreleri gecede 6-10 hücre kümeleri toplamak. Her 50 µL hacmi reaggregated hücreleri için ertesi sabah hücreleri hafifçe MAT kaplanmış bir 24-şey plaka merkezi haline aktarın. Hücreleri bağlı kadar yavaşça 37 ° C çok gaz kuluçka için 4-6 h, tabak koyun.
    4. Hücreleri ilişik sonra
  4. her şey için 1 mL taze o medya ekleyin. Hematopoetik hücrelerin görünür hale gelene kadar bir 37 ° C % 5 CO 2 %5 O 2 çoklu Yakıt Ekstraktörü hücrelerde kuluçkaya (genellikle 5-7 gün; şekil 2B). Küçük 100 X büyütme hafif bir mikroskop kullanarak görselleştirmek.
  5. o medya hücrelerden hafifçe kaldırarak kesin hematopoetik ataları hasat. Bu ortam bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek ve toplamak. İyi yapisan hücrelere 0.5 mL % 0.25 ekleme tripsin-EDTA hücrelere ve 5 dk. Ekle 0.5 mL DURMAK eriyik için her şey için 37 ° C'de kuluçkaya. Tüm yapışık havuzu için aynı 40 µm hücre süzgeç ile hücreleri ve yapışık olmayan hücreleri ile birlikte geçmektedir. Spin 330 x g 5 dakika süreyle,
    1. Bu toplu kültür CFC potansiyelini değerlendirmek için Bölüm 6 için devam.
  6. Hücreleri FACS arabelleğinde iki kez yıkayın. Spin 330 x g 5 dakika süreyle,
  7. 5 x 10 6 hücre/mL, FACS arabellek hücrelerde resuspend. Karanlıkta buzda 30 dk için anti-CD45 ve anti-CD34 antikorları içeren hücreleri leke (fluorophores Malzemeler tablo önerilir).
  8. Hücreleri FACS arabelleğinde iki kez yıkayın. Spin 330 x g 5 dakika süreyle,
  9. İzole CD34 + CD45 + hücreleri FACS tarafından ( 2E rakam). Soğutulmuş FACS arabelleğe hücreleri sıralamak.
  10. Kesin CD34 değerlendirmek + CD45 + hematopoetik ataları olarak gerekli (CFC tahlil Bölüm 6, Bölüm 7'deki lenfoid potansiyel veya başka bir araştırmacı tarafından başlatılan tahlil).

6. CFC tahlil

  1. çözülme CFC tahlil için kullanılan her örnek için MEC aliquots.
  2. Bölümü (4.5, 4.7, 5.5 veya 5,9 merdiven) MeC içinde olmak için hücreleri ekleyin. Girdap iyice ve MeC kültürler stand için 5-10 dk kadar hava kabarcıkları, üretici göre dağılımı ' s yönergeleri. Bir 16 kullanarak ½ iğne 3 mL şırınga üzerinde ölçmek, dikkatli bir şekilde çıkarın MeC 2 mL.
    Not: Tipik kaplama yoğunlukları aralığı 1.000-20 000 hücre/mL, beklenen progenitör Frekansa bağlı olarak gelen.
  3. Dikkatle, 1 mL MeC hücre karışımı her iki 35 mm doku kültürü yemekleri dağıtmak. 35 mm yemeklerinde MeC hafifçe dokunarak ve çanak dönen dağıtabilmenizi. Her biri yukarıdaki yemekleri su 15 cm doku kültürü çanak içine koyun. 37 ° C % 5 CO 2 kuluçka makinesine kuluçkaya.
  4. 40 X büyütme kullanarak ışık mikroskop kullanarak MeC kültürler görselleştirin. Elde edilen çeşitli CFC ölçmek. İlkel CFC deneyleri 8-10 gün sonra ( şekil 2C) kaplama analiz. Kesin CFC deneyleri 14 gün sonra kaplama analiz. Temsilcisi CFC tahlil koloni türleri Morfoloji şekil 2F içinde görülebilir.

7. T hücre tahlil kesin hematopoetik potansiyel kurmak için

  1. , birleşmesi 100 mm doku kültürü çanak 30 kadar Grow OP9-DL4 hücreleri 31 , 32.
    1. OP9-DL4 tezcan hücreleri 72-96 h T hücre deneyleri kaplama önce. 10 mL OP9 medya OP9-DL4 hücrelerde resuspend ve 10 cm tabak dağıtmak. 37 ° C % 5 CO 2 kuluçka makinesine % 70-90 birleşmesi kadar büyümek.
    2. 100 mm çanak OP9 DL4 hücrelerden hasat için medyayı çıkarın ve 5 mL % 0.25 ekleyin tripsin-EDTA 5 dakika süreyle durdurmak tripsin aktivite 5 mL OP9 medya ile. 1 mL OP9 medya hücrelerde hücre 330 x g 5 dk. Resuspend de spin ve hücreleri saymak.
      Not: Bir 10 cm tabak Konfluent OP9 DL4 hücre OP9-DL4 hücreleri yaklaşık 10 x 10 6 verecektir.
    3. 48 h T hücre tahlil, plaka 2 x 10 6 hücreler 12 ml OP9 önce medya 24-şey tabak (0.5 mL/de). 37 ° C % 5 CO 2 kuluçka makinesine büyümek.
  2. 1 OP9 medya ile takıma OP9-DL4 hücrelerinin de 2.000-10,000 (4.5, 4.7, 5.5 veya 5,9 adımda elde gibi) denetlesinler hücrelere eklemek: 30 ng/mL SCF (sadece ilk 6 gün), 5 ng/mL 7 Il ve 5 ng/mL FLT3-L. kuluçkaya 37 ° C % 5 CO 2 Inc ubator. Bu adımda hiçbir medya değişikliklerden.
  3. Her 4 - 5 gün, T hücre ataları bir 6-iyi yemek taze OP9 DL4 stromal hücreler üzerine geçiş. 1 mL damlalıklı hücrelerle triturate ve kümeleri kaldırmak için bir 40 µm filtreden geçmek. 330 x g 5 dk. aspiratı basına kapalı için de spin. 2 mL 5 ng/mL 7 Il ve 5 ng/mL Flt3-L ve taze OP9-DL4 hücreleri üzerinde yer ile takıma taze OP9 medya hücrelerde resuspend.
    Not: passaging önce 48 h, 2 x 10 6 taze OP9 DL4 hücrelerde 12 mL OP9 medya plaka ve 2 mL/iyi 6-iyi yemekleri dağıtmak.
  4. Ortak kültür en az 21 gün sonra şiddetle hücreleri triturate ve hücre artıkları kaldırmak için 40 µm filtreden geçmek. 330 x g 5 min için de spin ve süpernatant Aspire edin.
  5. Soğuk FACS arabellek iki kez hücrelerde yıkayın. Spin 330 x g 5 dakika süreyle,
  6. 5 x 10 6 hücre/mL, FACS arabellek hücrelerde resuspend. Leke hücrelerle anti-CD45, anti-CD56, anti-CD4 ve CD8 anti antikorlar (önerilen fluorophore Malzemeler tablo bileşimleridir) karanlıkta buzda 30 dk için. Analizinden enkaz kaldırmak için bir canlı/ölü hücre leke (DAPI, vb) uygulamak.
  7. Hücreleri FACS arabelleğinde iki kez yıkayın. Spin 330 x g 5 dakika süreyle,
  8. T-lenfosit ataları ( şekil 3) varlığını değerlendirmek için bir Akış Sitometresi kullanarak hücreleri analiz.

Sonuçlar

İlkel ve kesin hematopoetik ataları hPSCs üzerinden indüksiyon resmeden bir şematik Resim 1' de gösterilmiştir. Kurallı WNT gün 2-3 farklılaşma, hematopoetik progenitör belirtimine göre takip sırasında ortaya çıkan sinyal tarafından biçimlenme mesoderm.

Temsilcisi akış sitometrik çözümlemesi ve methylcellulose deneyleri hematopoetik farklılaşma hPSC kaynaklı kültürlerin ...

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı için ilkel veya kesin hematopoetik ataları farklılaşma hızlı, serum-Alerjik, stroma ücretsiz yöntemi açıklar. Mezodermal ilkel veya kesin hematopoetik ataları tayini güvenilir benzersiz olarak kanonik WNT sinyal, küçük molekül inhibitörleri patlatır bizim iletişim kuralı kullanılarak elde edilebilir. WNT inhibisyon PORCN inhibitörü IWP234 tarafından ilkel hematopoetik mesoderm26belirtir, ancak sahne alanı özgü WNT etkinleştir...

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Bu eser Bakanlığı iç hastalıkları, Hematoloji bölümü, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir. CD T32HL007088 Ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. CMS bir Amerikan Derneği, Hematoloji bilim adamı Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD)Corning10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell ratedGemini Bioproducts100-500
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30396.03
L-glutamine, 200 mM solutionLife Technologies25030-081
Penicillin-streptomycinLife Technologies15070-063
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies25200056
0.05% Trypsin-EDTALife Technologies25300054
Gelatin, porcine skin, Type ASigma-AldrichG1890
Alpha-MEMLife Technologies12000-022
DMEM-F12Corning10-092-CV
Knock-out serum replacementLife Technologies10828028"KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA)Life Technologies11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solutionLife Technologies21985023
Hydrochloric acidSigma-AldrichH1758
Fraction V, Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1605
Ham's F12Corning10-080
N2 supplementLife Technologies17502048
B27 supplement, no vitamin ALife Technologies12587010
Stempro-34 (SP34)Life Technologies10639011"SP34"
Growth factor reduced MatrigelCorning354230"MAT"
L-absorbic acidSigma-AldrichA4403
Human serum transferrinSigma-Aldrich10652202001
Monothioglycerol (MTG)Sigma-AldrichM6145
Collagenase BRoche11088831001
Collagenase IILife Technologies17101015
DNaseICalbiochem260913
Phosphate Buffered Saline (PBS)Life Technologies14190144
bFGFR&D Systems233-FB
BMP4R&D Systems314-BP
Activin AR&D Systems338-AC
VEGFR&D Systems293-VE
SCFR&D Systems255-SC
IGF-1R&D Systems291-G1
IL-3R&D Systems203-IL
IL-6R&D Systems206-IL
IL-7R&D Systems207-IL
IL-11R&D Systems218-1L
TPOR&D Systems288-TP
EPOPeprotech100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L)R&D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
Angiotensin IISigma-AldrichA9525
Losartan PotassiumTocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4BD Biosciences560650Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8BD Biosciences561950Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12BD Biosciences340441Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12BD Biosciences348801Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10BD Biosciences555475Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1BD Biosciences557833Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1BD Biosciences642284Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159BD Biosciences555518Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2BD Biosciences550257Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5BD Biosciences555976Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)BD Biosciences564907Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cellsHolmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034Stemcell Technologies4034"MeC"
Milli-Q water purification systemEMD Millipore
5% CO2 incubatorSet at 37 C
Multigas incubatorSet at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plateCorning353046
24 well tissue culture plateCorning353226
6 well low-adherence tissue culture plateCorning3471
24 well low-adherence tissue culture plateCorning3473
35 mm tissue culture dishesCorning353001
Blunt-end needle, 16 gaugeCorning305198
3 cc syringesCorning309657
5 mL polypropylene test tubeCorning352063
5 mL polystyrene test tubeCorning352058
15 mL polypropylene conicalCorning430791
50 mL polypropylene conicalCorning430921
2 mL serological pipetteCorning357507
5 mL serological pipetteCorning4487
10 mL serological pipetteCorning4488
25 mL serological pipetteCorning4489
Cell scrapersCorning353085
2.0 mL cryovialsCorning430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainerCorning352235
40 µM cell strainerCorning352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo softwareTreeStar
Water bathSet at 37 C
0.22 µM filtration systemCorning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

Referanslar

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  3. Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
  4. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
  5. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  6. McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
  7. Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
  8. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  9. Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
  10. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  11. Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
  12. Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
  13. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  14. Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
  15. Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
  16. Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
  17. Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
  18. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  19. Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
  20. Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
  21. Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
  22. Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
  23. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
  24. Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
  25. Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
  26. Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
  27. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
  28. Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
  29. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, (2001).
  30. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
  31. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
  32. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
  33. Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
  34. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
  35. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
  36. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  37. Peschle, C., et al. Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 129Pluripotent k k h crelerinsan embriyonik k k h crelerih cre k lt rembryoid organlarWNT sinyalkesin hematopoiesisilkel hematopoiesishemogenic endotel

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır