Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

Riepilogo

Qui, presentiamo pluripotenti umane protocolli di coltura della cellula formativa (hPSC), utilizzata per differenziare hPSCs in CD34⁺ progenitori ematopoietici. Questo metodo utilizza la modifica di fase-specifici di Canonica WNT segnalazione per specificare le celle esclusivamente al programma ematopoietica sia definitiva o primitivo.

Abstract

Uno degli obiettivi principali per la medicina rigenerativa è la generazione e la manutenzione di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs). Fino a poco tempo, gli sforzi per differenziare hPSCs in HSCs hanno generato principalmente progenitori ematopoietici che mancano di potenziale HSC e invece assomigliano vitellino ematopoiesi. Questi progenitori ematopoietici risultanti potrebbero essere limitato utilità per la modellazione in vitro malattia di vari disordini ematopoietici adulti, in particolare quelli dei lignaggi linfoidi. Tuttavia, recentemente abbiamo descritto i metodi per generare progenitori ematopoietici definitivi multilineare eritro-mielo-linfoidi da hPSCs utilizzando un protocollo di differenziazione diretto fase-specifici, che descriviamo qui. Attraverso la dissociazione enzimatica di hPSCs su plasticware rivestite con matrice della membrana dello scantinato, si formano corpi embryoid (EBs). EBs si differenzino per mesoderma BMP4 ricombinante, che viene successivamente specificato al programma ematopoietico definitivo dall'inibitore GSK3β, CHIR99021. In alternativa, ematopoiesi primitivo viene specificato dall'inibitore PORCN, IWP2. Ematopoiesi è ulteriormente guidato attraverso l'aggiunta del ricombinante VEGF e citochine ematopoietiche solidale. I progenitori ematopoietici risultanti generati utilizzando il metodo hanno il potenziale per essere utilizzato per malattia e modelli inerenti allo sviluppo, in vitro.

Introduzione

Cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono definite nel senso che comprende sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) e hanno la capacità unica di non solo in fase di auto-rinnovamento in condizioni di crescita appropriata, ma anche, la capacità di differenziarsi in tutti i tipi di cellule derivate da tre strati di germe: ectoderma, mesoderma ed endoderma¹. A causa di queste abilità uniche, hPSCs tenere grande promessa per la medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e le terapie basate sulle cellule². Mentre più tipi di cellule sono stati differenziati con successo dai hPSCs, una sfida significativa è la specifica in vitro di esclusivamente adulto-come hPSC-derivato cellule staminali ematopoietiche (HSCs) e definitivi progenitori ematopoietici.

Un probabile ostacolo allo sviluppo di HSC umane da hPSCs è la presenza di più programmi ematopoietiche entro l' embrione umano³. Il primo programma che emerge, definito "primitivo ematopoiesi," nasce all'interno del tessuto del sacco vitellino extraembryonic e meglio è caratterizzato dalla sua produzione transitoria di progenitori dell'eritroblasto (EryP-CFC), macrofagi e megacariociti. In particolare, questo programma non dà luogo a HSCs, né dà origine ai progenitori linfoidi T e B. Tuttavia, il sacco vitellino transitoriamente dar luogo a progenitori ematopoietici definitivi con restrizioni, come il progenitore eritro-mieloide (EMP^4,5,6,7,8) e degli eritrociti-carenti linfoide-innescato multipotenti progenitrici (LMPP⁹). Tuttavia, EMPs né LMPPs sono completamente multipotenti, o in grado di attecchimento di HSC-come nei destinatari adulti. Al contrario, più avanti in sviluppo, il programma ematopoietico "definitivo" classicamente definito è specificato nella regione dell'aorta-gonade-Mesonefro dell'embrione propriamente detto, dando vita a tutte le filiere emopoietiche adulti, tra cui l'HSC. La specifica di queste cellule ematopoietiche definitive intra-embrionali si verifica in una tacca-dipendente, tramite una transizione endoteliali--emopoietici dal hemogenic dell'endotelio (lui)^{3,10,11 ,12,13,14}. A parte la capacità di ricostituzione, il potenziale di multilineage e tacca-dipendenza di queste cellule può essere utilizzato per distinguere questi progenitori ematopoietici definitivi da EMP e il LMPP (rivisto in riferimenti^3,13 ).

Comprendere i meccanismi che disciplinano primitivo e definitiva specifica ematopoietica da hPSCs è probabilmente fondamentale per la produzione riproducibile dei progenitori ematopoietici definitivi attraverso una varietà di linee di hPSC. Fino a poco tempo, protocolli di differenziazione hPSC che potrebbero separare multipotenti progenitori ematopoietici primitivi e definitivi non esisteva^{15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25}. Molti approcci utilizzando siero bovino fetale (FBS) e/o stromale co-coltura prima delineato il potenziale ematopoietico di differenziazione hPSC, con miscele di primitivo e definitiva ematopoietiche potenziali^{15,16, 17,19,22,23,25}. Ulteriormente, molti protocolli senza siero ematopoietiche sono descritti i requisiti di segnale per la specifica del mesoderma da hPSCs che continuano ad avere potenziale ematopoietico^{18,20,21, 24}. Tuttavia, come questi metodi ancora ha dato luogo a miscele eterogenee di entrambi i programmi, il loro uso in applicazioni cliniche e comprensione dei meccanismi dello sviluppo può essere limitato.

Recentemente abbiamo costruito su questi studi, dopo aver delineato i requisiti del segnale di fase-specifici per ACTIVIN/NODAL e segnalazione di WNT nella specifica ematopoietico primitivo e definitiva dal mesoderma hPSC-derivato^18,26 . Quest'ultimo era particolarmente unico, come il suo utilizzo di manipolazione del segnale WNT fase-specifici permette per la specifica di essere esclusivamente primitivo o di progenitori ematopoietici definitivo²⁶esclusivamente. Durante la specifica di mesoderma, l'inibizione di segnalazione WNT canonico con l'inibitore PORCN IWP2 risultati nella specifica di CD43⁺ EryP-CFC e dei progenitori mieloidi, con nessun potenziale linfoide rilevabile. In netto contrasto, stimolazione della canonica WNT segnalazione con l'inibitore di GSK3β, CHIR99021, durante la stessa fase di differenziazione ha provocato la completa assenza di CD43 rilevabile⁺ EryP-CFC, mentre contemporaneamente conduceva per la specifica di CD34⁺CD43⁻ HE. Questa popolazione ha posseduto mieloide, HBG-che esprimono degli eritrociti e potenziale T-linfoide. Successive analisi hanno identificato questo aveva come manca l'espressione di CD73^27,28 CD184²⁸e suo potenziale ematopoietico tacca-dipendente²⁸. Più ulteriormente, unicellulare clonale analisi hanno dimostrato che queste filiere emopoietiche definitivi potrebbero essere derivati da cellule multipotenti singola²⁸. Presi insieme, questi studi indicano che fase-specifici WNT segnalazione manipolazione possibile specificare puri primitivi progenitori ematopoietici, oppure multipotenti progenitori ematopoietici definitivi di NOTCH-dipendente.

Qui, descriviamo la nostra strategia di differenziazione che produce esclusivamente primitivi o definitivi progenitori ematopoietici, attraverso la manipolazione delle canoniche WNT segnalazione durante mesodermal patterning e loro a valle lineage ematopoietico saggi. Questo protocollo è di grande valore per i ricercatori che sono interessati nella produzione di progenitori ematopoietici primitivi o definitivi da hPSCs per applicazioni di medicina rigenerativa.

Protocollo

1. reagenti

1. Obtain cella linee; hESCs o hiPSCs ¹, mouse fibroblasti embrionali (MEFs) ²⁹, OP9-DL4 stroma ^{30 , 31}.
2. preparazione dei reagenti
   1. preparare una soluzione di 0,1% p/v di gelatina in PBS. Sterilizzare in autoclave e dopo aliquotare e conservare a 4 ° C.
      1. Preparare il plasticware rivestite con gelatina. Cappotto piatti 6 pozzetti con 1,5 mL di soluzione di gelatina di 0.1%. Incubare per 15 min a temperatura ambiente. Immediatamente prima dell'uso, aspirare la soluzione di gelatina restante.
   2. Preparare il supporto MEF facendo IMDM con 15% v/v FBS e 1x antibiotici. Completare con 2 mM L-Glutammina e 400 µM monothioglycerol (MTG) prima dell'uso e conservare a 4 ° C.
   3. Preparare terreni di coltura hPSC come una soluzione di DMEM/F12 con sostituzione di 20% v/v knockout del siero (KOSR), 1 x aminoacidi non essenziali (NEAA), 1 x antibiotici, 55 µM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-Glutammina e 10 ng/mL bFGF. Filtro per sterilizzare con un filtro di 2 µm e conservare al buio a 4 ° C.
   4. Preparare il siero-free media di lavaggio come una soluzione di DMEM/F12 con 5% v/v KOSR e 4mm HCl. filtro per sterilizzare con un filtro di 2 µm, aliquota e conservare al buio a 4 ° C.
   5. Fare un 1mg/mL dnasi ho soluzione sciogliendo dnasi I per 3-4 ore in acqua deionizzata sterile ghiacciata sul ghiaccio. Filtro per sterilizzare con un filtro di 2 µm e conservare le aliquote a -20 ° C.
   6. Preparare la soluzione STOP con media di lavaggio: aggiungere 10% FBS e 10 µ g/mL della dnasi I. La soluzione STOP deve essere preparata immediatamente prima dell'uso.
   7. Preparare la matrice della membrana basale (ad es., matrigel, indicato come MAT hereon) soluzione miscela.
      Nota: Tutti i passaggi preliminari e la miscela di opaco devono essere eseguiti in ghiaccio o a 4 ° C. Thaw congelati MAT in ghiaccio a 4 ° C durante la notte. Diluire 1:1 di MAT aggiungendo 10ml ghiacciata IMDM e chill in ghiaccio a 4 ° C durante la notte. Diluire la miscela MAT con altri 20 mL ghiacciata IMDM e chill in ghiaccio a 4 ° C durante la notte. Aliquota in tubi pre-refrigerati e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo. Quando si è pronti per l'uso, scongelare MAT miscela durante la notte a 4 ° C. Piastre per colture cellulari
      1. cappotto il MAT.
         Nota: Tutti i passaggi di rivestimento opaco piastre devono essere eseguiti sul ghiaccio. Pre-6 pozzetti e 24 pozzetti piastre a-20 ° C per almeno 1 h. Quando si è pronti a cappotto piastre, metterli sul ghiaccio. Ricoprire ogni pozzetto con 4 x-diluito MAT, rimozione e ri-utilizzando qualsiasi soluzione in eccesso. Lasciare in ghiaccio per 30-60 minuti e aspirare MAT in eccesso. Asciugare le piastre rivestite con stuoia in incubatore a 37 ° C 5% CO ₂ per un minimo di 3 h. uso entro 72 h di rivestimento.
   8. Preparare la soluzione di 10% dell'albumina di siero bovino (BSA) sciogliendo 10% w/v BSA in acqua ghiacciata, acqua distillata e deionizzata a 4 ° C per 3-4 h. filtro per sterilizzare con un filtro di 2 µm in una luce di blocco bottiglia e conservare a 4 ° C.
   9. Preparare la soluzione di acido ascorbico. Si dissolvono lentamente una soluzione di 5 mg/mL di acido L-ascorbico in acqua ghiacciata, acqua distillata e deionizzata sul ghiaccio per 3-4 h. ricciolo occasionalmente fino a completa dissoluzione. Filtro per sterilizzare con un filtro di 2 µm e conservare le aliquote a -20 ° C.
   10. Preparare il supporto di differenziazione privo di siero (SFD) facendo una soluzione di 75: 25 di IMDM:Ham ' s F-12, quindi aggiungere 0,5% BSA, 1 x B27 e 0,5 x N2 integratori. Conservare a 4 ° C. Add 1 x L-Glutammina, 50 µ g/mL di acido ascorbico, 400 µM MTG e 150 µ g/mL holo-transferrina immediatamente prima di utilizzare.
   11. Preparare terreni di coltura privo di siero della cellula formativa (ad es., StemPro, denominato SP34 hereon) per il produttore ' s istruzioni. Conservare a 4 ° C. Add 1 x L-Glutammina, 50 µ g/mL di acido ascorbico, 400 µM MTG e 150 µ g/mL holo-transferrina immediatamente prima di utilizzare.
   12. Preparare la soluzione di collagenasi II 0.2% di dissoluzione della collagenosi II a una concentrazione finale di 0,2% p/v in 1:4 FBS:PBS soluzione. Sciogliere a bagnomaria a 37 ° C per almeno 15 min filtro per sterilizzare la soluzione con un filtro di 2 µm e conservare le aliquote a -20 ° C.
   13. Preparare il tampone di fluorescenza attivato Cell Sorting (FACS) come una soluzione di 5% FBS in IMDM immediatamente prima di utilizzare.
   14. Preparare OP9 media come una soluzione di α-MEM, 20% FBS, 2 mM L-Glutammina e 1x antibiotici. Filtro per sterilizzare con un filtro di 2 µm e conservare a 4 ° C.
   15. Ottenere supporti basati su metilcellulosa (ad es., MethoCult, indicato come MeC hereon) come quantità pre-aliquotato 3 mL o come una bottiglia da 100 mL. Se si utilizza il 100 mL MeC, all'arrivo, dividere in aliquote di 2,5 mL in provette coniche da 14 mL.
       Nota: Tutte le aliquote devono essere conservate a medie di-20 ° C. MeC aliquote devono essere scongelate immediatamente prima di utilizzare.

2. Differenziazione del mesoderma di hPSCs

linee di cellule

1. coltiva la hPSC su MEFs confluency di 70-80%, in un incubatore a 37 ° C con 5% CO ₂.
   Nota: L'hPSCs dovrebbe avere bordi taglienti, indifferenziati.
2. Rivestite con stuoia di preparare plasticware 24 h prima di passaggio l'hPSCs.
   Nota: Il numero totale di MAT-rivestito 6 pozzetti piatti varia attraverso le linee di hPSC. Normalmente, tre piatti 6 pozzetti sono sufficienti per ogni piatto 6-pozzetti di hPSCs confluenti su MEFs.
   1. Eseguire una prova alimentatore-svuotamento con diversi rapporti di hPSCs:MAT confluenti wells (1:4, 1:3, 1:2, ecc.) prima la prima differenziazione per determinare quanti piatti 6 pozzetti rivestite con MAT devono essere utilizzati per successive differenziazioni.
      Nota: 24 h dopo il placcaggio su stuoia, l'hPSCs dovrebbe essere 80-90% confluenti, con ciuffi di cella di circa il 10-20 celle in formato.
3. Aspirare i media hPSC e aggiungere 1 mL di 37 ° C 0,25% tripsina-EDTA a ciascuno bene per 1 min. aspirato e aggiungere 1 mL STOP media in ciascun pozzetto. Utilizzando un raschietto di cellula, raschiare le cellule fuori la piastra. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio in ogni pozzetto.
   1. Con una pipetta sierologica da 2ml, triturare 3 - 5 volte per spezzare grandi ciuffi di cellule e trasferire le cellule ad una provetta conica da 50 mL. Centrifugare l'hPSCs a 330 x g per 5 min.
4. Risospendere le cellule in un volume totale di hPSC media equivalente a 2 mL per pozzetto del plasticware rivestite con MAT per essere utilizzato. Aggiungere 2 mL/pozzetto di hPSCs il plasticware e incubare per una notte in un incubatore a 37 ° C con 5% CO ₂.
5. 24 ore più tardi, aspirare i media e sostituire con 37 ° C 0.05% tripsina-EDTA per 1 min. aspirare la tripsina-EDTA e aggiungere 1 mL STOP media. Raschiare le cellule vigorosamente con un raschietto di cella. Aggiungere 1 mL WASH media in ciascun pozzetto. Con una pipetta sierologica da 2ml, triturare le cellule 1 - 2 volte e trasferire in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare le cellule a 220 x g per 5 min.
   Nota: La lunghezza del tempo di tripsina-EDTA trattamento shouLD determinato dallo sperimentatore per ogni linea di hPSC. Il trattamento di tripsina dovrebbe essere applicato per più a lungo possibile senza provocare la dissociazione di cella singola. Questo passaggio dovrebbe staccare tutto l'hPSCs dalle piastre rivestite con MAT, ma non provocare la dissociazione di cella singola. EBs risultante dovrebbe essere in media 6-10 celle,.
6. Aspirare i media. Utilizzando una pipetta sierologica da 5ml, Risospendere delicatamente le cellule nei media di lavaggio di 20 mL. Centrifuga a 220 x g per 5 min.
7. Risospendere delicatamente l'EBs in media giorno 0 (tabella 1). Pipettare 2 mL di EBs che contenevano differenziazione in ciascun pozzetto di una piastra di coltura bassa 6-pozzetti-aderente cella utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Posto in un incubatore a 37 ° C 5% CO ₂ 5% O ₂ (multi-gas).
   Nota: I media giorno 0: media SFD addizionata di 10 ng/mL BMP4 (tabella 1). Per ogni due piastre di hPSCs, utilizzare una piastra di coltura cellulare bassa 6-pozzetti-aderente.
8. 24 h dopo, aggiungere 2 mL 1 giorno media (tabella 1). Incubare le cellule durante la notte in un incubatore multigas.
   Nota: I media giorno 1: media SFD completati con 10 ng/mL BMP4 e 10 ng/mL bFGF in ciascun pozzetto (tabella 1).
9. 18 ore più tardi, delicatamente raccolto l'EBs con una pipetta sierologica da 5ml e spin a 100 x g per 5 min, lavare e tutta la cultura si combinano con 10 mL IMDM. Spin a 100 x g per 5 min, aspirato media.
   Nota: Detriti saranno presente nelle culture. Questo passaggio di centrifugazione a bassa velocità (100 x g) rimuoverà i detriti.
10. Risospendere delicatamente l'EBs nei media SFD completati con media Day 2 (tabella 1) e poi versare 2 mL per pozzetto in piastre per colture cellulari a 6 pozzetti basso-aderente. Incubare in un incubatore a 37 ° C multi-gas per 30 h.
    Nota: I media giorno 2: BMP4, 10 ng/mL e 5 ng/mL bFGF e l'appropriato WNT agonista o antagonista (tabella 1).
    1. Aggiungere 3 µM CHIR99021 per specificare definitivi progenitori ematopoietici. In alternativa, aggiungere 3 µM IWP2 e activina A 1 ng/mL per specificare primitivi progenitori ematopoietici.
11. Continuare al punto 3 per specifica di progenitori emopoietici.

3. Specificazione di CD34 ⁺ progenitori ematopoietici

1. dopo 30 h, isolare l'EBs con una pipetta sierologica da 2 mL al giorno 3 di differenziazione. Trasferimento in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 330 x g per 5 min. Risospendere delicatamente e lavare con 10 mL di IMDM. Centrifugare le cellule nuovamente a 330 x g per 5 min.
2. Risospendere l'EBs in media giorno 3 (tabella 2) e pipettare 2 mL in tutti i pozzetti di piastre da 6 pozzetti basso-aderente. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C multi-gas per 72 h.
   Nota: I media giorno 3: SP34, completati con 15 ng/mL VEGF e bFGF 5 ng/mL (tabella 2). Se il pH dei media raccolti il giorno 3 di differenziazione ha cambiato significativamente (cioè, supporti di colore giallo-arancio), aggiungere ulteriori supporti per pozzetto. In alternativa, utilizzare meno EBs per pozzetto il giorno 0.
3. Dopo 72 h di incubazione, aggiungere 2 mL di giorno 6 media (tabella 2) ad ogni pozzetto. Incubare in un incubatore a 37 ° C multi-gas per un ulteriore 48 h.
   Nota: I media giorno 6: SP34 media integrata con 15 ng/mL VEGF, bFGF di 5 ng/mL, 200 ng/mL SCF, EPO 4 IU, 20 ng/mL IL-6, 10 ng/mL IL-11 e 50 ng/mL IGF-1 (tabella 2). Se più mezzi di comunicazione è stato aggiunto nel passaggio 3.1, quindi aggiungere la quantità equivalente di media nel passaggio 3.2 in modo che le concentrazioni di citochina finale rimangono gli stessi.
4. Isolare l'EBs CHIR99021-trattate il giorno 8 di differenziazione. Procedere alla sezione 4.
5. IWP2-EBs trattati vengono raccolte il giorno 8 di differenziazione in una provetta conica da 50 mL. Centrifuga a 330 x g per 5 min. Risospendere delicatamente nel giorno 8 media (tabella 2). Incubare per 24 h in un incubatore a 37 ° C 5% CO ₂ in bassi piatti aderente. Procedere alla sezione 4.
   Nota: I media giorno 8: SP34 media completati con 100 ng/mL SCF, EPO di 2 UI, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L e 30 ng/mL IL-3 (tabella 2).

4. Enzimatica dissociazione di EBs e isolamento di cellule progenitrici ematopoietiche

1. isolare l'EBs con una pipetta sierologica in un 50 mL conica tubo. Centrifuga a 330 x g per 5 min, aspirare il sovranatante.
2. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0.25% per l'EBs. Vortexare per 5 s. Incubare a bagnomaria a 37 ° C per 8 min. aggiungere 5 mL di soluzione di arresto. Centrifuga a 330 x g per 5 min, aspirare il sovranatante.
3. Risospendere l'EBs in 5 mL di collagenasi II. Vortex per 5 s e incubare a bagnomaria a 37 ° C. Dopo 60 min, vortexare per 5 s e aggiungere 5 mL di soluzione di arresto. Spin a 330 x g per 5 min, aspirare il sovranatante.
4. In 1 mL di tampone di FACS, risospendere le cellule. Passare le cellule attraverso un colino di cella di 40 µm. Questa operazione rimuove eventuali grumi di cellule dissociate.
5. Contare le celle. Aliquotare 1 x 10 ⁶ cellule in una provetta conica di 14 mL. Girare le cellule a 330 x g per 5 min. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 5 x 10 ⁶ cellule/mL in tampone di FACS. Aliquotare e piscina 10% delle cellule in ogni condizione per controlli colore cytometric di flusso. Incubare le cellule in anticorpi per 30 min in ghiaccio, al buio.
   Nota: Vedere suggerito fluoroforo combinazioni in Tabella materiali.
   1. Per IWP2-trattato le cellule, usano gli anticorpi anti-CD34 e anti-CD43.
   2. Cellule per CHIR99021-trattate, utilizzare anticorpi anti-CD34, anti-CD43, anti-CD73 e anti-CD184.
6. Sciacquare le cellule due volte utilizzando FACS buffer. Spin a 330 x g per 5 min. Risospendere le cellule ad una concentrazione finale di 5 x 10 ⁶ cellule/mL.
7. Analizza o isolare cellule tramite flusso cytometry. Per primitivi progenitori ematopoietici, analizzare l'espressione di CD34 e CD43 ( Figura 2A). Per definitivi progenitori ematopoietici, isolare la HE (CD34 ⁺ CD43 ⁻ CD73 ⁻ CD184 ⁻) da FACS ( Figura 2B). Raccogliere le cellule in provette contenenti refrigerati buffer di FACS.
8. Per valutare il potenziale ematopoietico definitivo da isolato HE, proseguire alla sezione 5 per la transizione endoteliali--emopoietici o sezione 7 per l'analisi di T-linfoide. Per primitivi ematopoietici saggi di CFC, proseguire alla sezione 6.

5. Transizione endothelial--emopoietici

1. Spin il CD34 isolato ⁺ CD43 ⁻ CD73 ⁻ CD184 ⁻ cellule a 330 x g per 5 min. Risospendere le cellule in lui media a 200.000 cellule/mL ( Tabella 2). Distribuire le cellule in 50 aliquote µ l in una piastra di coltura cellulare 96 pozzetti basso-aderente. Incubare le cellule durante la notte in un incubatore a 37 ° C 5% CO ₂ 5% O ₂ multi-gas.
   Nota: Egli media: media SP34 completati con 5 ng/mL VEGF, bFGF di 5 ng/mL, 100 ng/mL SCF, 2 UI EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL IL-3, 10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL SHH, 10 µ g/mL dell'angiotensina II e potassio Losartan 100 µM a 2 x 10 ⁵ cellule/mL (tabella 2).
2. Preparare il 24 pozzetti piastre rivestite con MAT (vedi passo 1.2.7.1), come necessario.
3. Le cellule verranno aggregati in gruppi di 6-10 cellule durante la notte. Per ogni 50 µ l di volume delle cellule reaggregated, trasferire delicatamente le cellule al centro di una piastra a 24 pozzetti rivestite con MAT sulla mattina prossima. Posizionare delicatamente la piastra in incubatrice multi-gas 37 ° C per 4-6 h, fino a quando le cellule sono attaccate.
4. Aggiungere 1 mL di fresco media HE in ciascun pozzetto, dopo che le cellule sono attaccate. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C 5% CO ₂ 5% O ₂ multi-gas fino a quando le cellule ematopoietiche sono visibili (in genere 5-7 giorni; Figura 2D). Visualizzare sotto 100 X ingrandimento utilizzando un microscopio chiaro.
5. Raccogliere i progenitori ematopoietici definitivi rimuovendo delicatamente i media HE dalle cellule. Passare questo media attraverso un colino di cella 40 µm e raccogliere. Le celle aderenti nel pozzo, aggiungere 0,5 mL 0,25% tripsina-EDTA a celle e incubare a 37 ° C per 5 min, aggiungere 0,5 mL di soluzione STOP in ciascun pozzetto. Passano attraverso il setaccio di cella µm 40 stesso di mettere in comune tutti gli aderenti e non aderenti cellule insieme. Spin a 330 x g per 5 min.
   1. Per valutare il potenziale di CFC di questa cultura di massa, procedere alla sezione 6.
6. Lavare le cellule due volte nel buffer di FACS. Spin a 330 x g per 5 min.
7. Risospendere le cellule in tampone di FACS a 5 x 10 ⁶ cellule/mL. Macchia le cellule con anticorpi anti-CD45 e anti-CD34 per 30 min su ghiaccio al buio (suggerito fluorofori sono nella Tabella materiali).
8. Lavare le cellule due volte nel buffer di FACS. Spin a 330 x g per 5 min.
9. Isolare il CD34 ⁺ CD45 ⁺ cellule di FACS ( Figura 2E). Ordinare le celle refrigerate buffer di FACS.
10. Valutare il CD34 definitiva ⁺ CD45 ⁺ progenitori ematopoietici come necessari (analisi di CFC nella sezione 6, linfoide potenziale nella sezione 7 o un altro test avviati).

6. Dosaggio CFC

1. Disgelare aliquote di MeC per ciascun campione utilizzato per il dosaggio CFC.
2. Aggiungere le cellule per essere analizzati (passaggi, 4.5, 4.7, 5.5 o 5.9) nella MeC. Vortice accuratamente e lasciare che le culture di MeC riposare per 5-10 minuti fino a quando bolle d'aria dissipare, secondo il produttore ' s istruzioni. Utilizzando un 16 ½ calibro dell'ago su una siringa da 3 mL, rimuovere attentamente 2 mL del MeC.
   Nota: Placcatura tipica densità variano da 1.000-20.000 cellule/mL, a seconda della frequenza attesi progenitrici.
3. Attentamente, dispensare 1 mL di miscela delle cellule MeC in ciascuna delle due piastre di coltura del tessuto di 35 mm. Distribuire uniformemente il MeC nei piatti 35mm delicatamente toccando e ruotando il piatto. Posto che ciascuno dei piatti sopra in un piatto di coltura del tessuto di 15cm riempito con acqua. Incubare in incubatore a 37 ° C 5% CO ₂.
4. Visualizzare le culture di MeC utilizzando un microscopio con ingrandimento 40x. Quantificare i CFC vari ottenuti. Analizzare i dosaggi CFC primitivo 8-10 giorni dopo il placcaggio ( Figura 2). Analizzare i dosaggi CFC definitivo 14 giorni dopo il placcaggio. Rappresentante morfologie di Colonia dosaggio CFC possono essere visto in Figura 2F.

7. Analisi delle cellule T per stabilire definitivo ematopoietiche potenziali

1. Grow OP9-DL4 cellule fino al confluente in un 100mm coltura del tessuto piatto ^{30 , 31 , 32}.
   1. disgelo OP9-DL4 celle 72-96 h prima della placcatura l'analisi delle cellule T. Risospendere le cellule OP9-DL4 in 10 mL OP9 media e versare in un piatto di 10 cm. Crescere in incubatore a 37 ° C 5% CO ₂ fino al 70-90% confluenti.
   2. Per raccogliere le cellule OP9-DL4 da un piatto di 100 mm, rimuovere il supporto e aggiungere 5 mL 0,25% tripsina-EDTA per 5 min, interrompere l'attività della tripsina con 5 mL OP9 media. Girare le cellule a 330 x g per 5 min. Risospendere le cellule in 1 mL OP9 media e contare le celle.
      Nota: Un piatto di 10 cm di cellule confluenti OP9-DL4 produrrà circa 10 x 10 ⁶ cellule OP9-DL4.
   3. 48 ore prima l'analisi delle cellule T, piastra 2 x 10 ⁶ cellule in 12 mL OP9 media in un piatto 24 pozzetti (0,5 mL/pozzetto). Crescere in incubatore a 37 ° C 5% CO ₂.
2. Aggiungere 2.000-10.000 cellule deve essere analizzato (come ottenuto nei passaggi 4.5, 4.7, 5.5 o 5.9) 1 bene di cellule OP9-DL4 OP9 media completati con: 30 ng/mL SCF (primi 6 giorni solo), 5 ng/mL IL-7 e 5 ng/mL FLT3-L. Incubare a 37 ° C 5% CO ₂ inc ubator. Non supporti vengono apportate in questo passaggio.
3. Ogni 4 - 5 giorni, passaggio i progenitori delle cellule T sul fresco OP9-DL4 cellule stromali in un piatto 6 pozzetti. Triturare le cellule con una pipetta da 1 mL e passare attraverso un filtro 40 µm per rimuovere grumi. Spin a 330 x g per 5 min aspirato fuori i media. Risospendere le cellule in 2 mL di fresco OP9 media integrata con 5 ng/mL IL-7 e 5 ng/mL Flt3-L e posto su cellule fresche OP9-DL4.
   Nota: 48 h prima del passaggio, 2 x 10 ⁶ cellule fresche di OP9-DL4 in 12 mL OP9 media del piatto e distribuire 2 mL/pozzetto in piatti 6 pozzetti.
4. Dopo almeno 21 giorni di co-coltura, triturare le cellule vigorosamente e passare attraverso un filtro di 40 µm per rimuovere i detriti cellulari. Spin a 330 x g per 5 min e aspirare il supernatante.
5. Lavare le cellule due volte in tampone di FACS refrigerato. Spin a 330 x g per 5 min.
6. Risospendere le cellule in tampone di FACS a 5 x 10 ⁶ cellule/mL. Macchia di cellule con anticorpi anti-CD45, anti-CD56, anti-CD4 e CD8 anti per 30 min in ghiaccio al buio (suggerito fluoroforo combinazioni sono in Tabella materiali). Applicare una macchia delle cellule vive/morte (DAPI, ecc.) per rimuovere i detriti dall'analisi.
7. Lavare le cellule due volte nel buffer di FACS. Spin a 330 x g per 5 min.
8. Analizzare le celle utilizzando un citometro a flusso per valutare la presenza di progenitori dei linfociti T ( Figura 3).

Risultati

Un disegno schematico raffigurante l'induzione di progenitori ematopoietici primitivi e definitivi da hPSCs è illustrato nella Figura 1. Mesoderma patterning di Canonica WNT segnalazione si verifica durante i giorni 2-3 di differenziazione, seguita dalla specifica di progenitori emopoietici.

L'analisi cytometric di flusso rappresentativi e saggi di metilcellulosa di culture di differenziamento emat...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo rapido, privo di siero, stroma-free per la differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi o definitivi. Mesodermal specifica dei progenitori ematopoietici primitivi o definitivi può essere raggiunto in modo affidabile utilizzando il nostro protocollo, che sfrutta in modo univoco piccole molecole inibitrici di segnalazione WNT canonico. L'attivazione di WNT fase-specifici dall'inibitore GSK3β CHIR99021³³ dà luogo a definitiva mesoderma ematopoietico...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD)	Corning	10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated	Gemini Bioproducts	100-500
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution	Life Technologies	25030-081
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15070-063
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200056
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300054
Gelatin, porcine skin, Type A	Sigma-Aldrich	G1890
Alpha-MEM	Life Technologies	12000-022
DMEM-F12	Corning	10-092-CV
Knock-out serum replacement	Life Technologies	10828028	"KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA)	Life Technologies	11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution	Life Technologies	21985023
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1605
Ham's F12	Corning	10-080
N2 supplement	Life Technologies	17502048
B27 supplement, no vitamin A	Life Technologies	12587010
Stempro-34 (SP34)	Life Technologies	10639011	"SP34"
Growth factor reduced Matrigel	Corning	354230	"MAT"
L-absorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403
Human serum transferrin	Sigma-Aldrich	10652202001
Monothioglycerol (MTG)	Sigma-Aldrich	M6145
Collagenase B	Roche	11088831001
Collagenase II	Life Technologies	17101015
DNaseI	Calbiochem	260913
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Life Technologies	14190144
bFGF	R&D Systems	233-FB
BMP4	R&D Systems	314-BP
Activin A	R&D Systems	338-AC
VEGF	R&D Systems	293-VE
SCF	R&D Systems	255-SC
IGF-1	R&D Systems	291-G1
IL-3	R&D Systems	203-IL
IL-6	R&D Systems	206-IL
IL-7	R&D Systems	207-IL
IL-11	R&D Systems	218-1L
TPO	R&D Systems	288-TP
EPO	Peprotech	100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L)	R&D Systems	308-FK
CHIR99021	Tocris	4423
IWP2	Tocris	3533
Angiotensin II	Sigma-Aldrich	A9525
Losartan Potassium	Tocris	3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4	BD Biosciences	560650	Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8	BD Biosciences	561950	Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12	BD Biosciences	340441	Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12	BD Biosciences	348801	Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10	BD Biosciences	555475	Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1	BD Biosciences	557833	Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1	BD Biosciences	642284	Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159	BD Biosciences	555518	Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2	BD Biosciences	550257	Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5	BD Biosciences	555976	Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	BD Biosciences	564907	Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells			Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034	Stemcell Technologies	4034	"MeC"
Milli-Q water purification system	EMD Millipore
5% CO2 incubator			Set at 37 C
Multigas incubator			Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate	Corning	353046
24 well tissue culture plate	Corning	353226
6 well low-adherence tissue culture plate	Corning	3471
24 well low-adherence tissue culture plate	Corning	3473
35 mm tissue culture dishes	Corning	353001
Blunt-end needle, 16 gauge	Corning	305198
3 cc syringes	Corning	309657
5 mL polypropylene test tube	Corning	352063
5 mL polystyrene test tube	Corning	352058
15 mL polypropylene conical	Corning	430791
50 mL polypropylene conical	Corning	430921
2 mL serological pipette	Corning	357507
5 mL serological pipette	Corning	4487
10 mL serological pipette	Corning	4488
25 mL serological pipette	Corning	4489
Cell scrapers	Corning	353085
2.0 mL cryovials	Corning	430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer	Corning	352235
40 µM cell strainer	Corning	352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software	TreeStar
Water bath			Set at 37 C
0.22 µM filtration system	Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer