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Résumé

Nous présentons ici pluripotentes humaines protocoles de culture de cellules souches (hPSC), utilisés pour différencier les hPSCs en CD34+ progéniteurs hématopoïétiques. Cette méthode utilise la manipulation spécifique au stade de canonique WNT de signalisation indiquer les cellules exclusivement pour le programme hématopoïétique de définitif ou primitif.

Résumé

Un des objectifs majeurs pour la médecine régénérative est la production et la maintenance de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dérivé des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Jusqu'à une date récente, efforts pour hPSCs se différencient en CSH ont généré principalement des progéniteurs hématopoïétiques qui manquent potentiel d’HSC et plutôt ressembler à l’hématopoïèse sac vitellin. Ces progéniteurs hématopoïétiques qui en résulte peuvent ont une utilité pour in vitro de modélisation maladie de divers troubles hématopoïétiques adultes, particulièrement ceux des lignées lymphoïdes limitée. Cependant, nous avons récemment décrit des méthodes pour générer l’érythro-myélo-lymphoïdes multilignées progéniteurs hématopoïétiques définitifs de hPSCs à l’aide d’un protocole spécifique au stade de différenciation dirigée, qui nous exposons ici. Par le biais de dissociation enzymatique du hPSCs sur la membrane basale enduit de matrice ustensiles en plastique, corps embryoïdes (EBs) sont forment. EBs sont différenciés au mésoderme par BMP4 recombinant, qui est spécifié par la suite au programme hématopoïétique définitif par l’inhibiteur de la GSK3β, CHIR99021. Alternativement, l’hématopoïèse primitif est spécifiée par l’inhibiteur de la PORCN, IWP2. Hématopoïèse est plus entraîné par l’addition de recombinant VEGF et soutien hématopoïétique cytokines. Les progéniteurs hématopoïétiques résultants générés à l’aide de cette méthode ont le potentiel d’être utilisé pour la modélisation du développement, in vitroet de maladie.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont définis comme englobant les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) et ont la capacité unique non seulement en cours de renouvellement automatique dans des conditions appropriées de croissance, mais aussi, la capacité à se différencier en tous types de cellules dérivées des trois couches de germe : ectoderme, mésoderme et endoderme1. En raison de ces capacités uniques, hPSCs sont très prometteurs pour la médecine régénérative, modélisation de maladies et thérapies à base cellulaire2. Alors que plusieurs types de cellules ont été différenciés avec succès de hPSCs, un défi important est la spécification in vitro d’exclusivement adulte comme dérivé de hPSC les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et des progéniteurs hématopoïétiques définitifs.

Une barrière susceptible au développement du CSH humaine de hPSCs est la présence de multiples programmes hématopoïétiques dans l' embryon humain3. Le premier programme qui émerge, appelé « hématopoïèse primitif », prend sa source dans les tissus extra-embryonnaires sac vitellin et est mieux caractérisé par sa production transitoire des progéniteurs des érythroblastes (EryP-CFC), les macrophages et les mégacaryocytes. Notamment, ce programme ne donne pas lieu à CSH, ni il donne naissance à des progéniteurs lymphoïdes T et B. Toutefois, le sac vitellin transitoirement suscite restreints progéniteurs hématopoïétiques définitifs, tels que le progéniteur myéloïde érythro (EMP4,5,6,7,8) et le déficient érythroïdes lymphoïdes-amorcé multipotentes progéniteurs (PPSP9). Cependant, PGE ni LMPPs sont entièrement multipotentes, ou capable de prise de greffe de CSH-comme chez les receveurs adultes. En revanche, plus tard dans le développement, le programme hématopoïétique « définitif » classiquement définie est spécifié dans la région de l’aorte-gonades-celles de l’embryon proprement dit, donnant lieu à toutes les lignées hématopoïétiques adultes, y compris le HSC. La spécification de ces cellules hématopoïétiques définitifs intra embryonnaires se produit de manière Notch-dépendante, via une transition endothéliales-à-hématopoïétiques du hemogenic l’endothélium (il)3,10,11 ,12,13,14. En dehors de la capacité de reconstitution, le potentiel de multilineage et Notch-dépendance à l’égard de ces cellules peuvent être utilisé pour distinguer ces progéniteurs hématopoïétiques définitifs de l’EMP et le PPSP (révisé dans les références3,13 ).

Comprendre les mécanismes qui régissent la spécification hématopoïétique primitive et définitive de hPSCs est probablement essentiel à la production reproductible de progéniteurs hématopoïétiques définitifs dans un éventail de lignes hPSC. Jusqu'à tout récemment, des protocoles de différenciation hPSC qui pourraient séparer multipotentes progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitives n’existaient pas de15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Beaucoup d’approches à l’aide de sérum fœtal (SVF) et/ou stromal co-culture tout d’abord souligné le potentiel hématopoïétique de différenciation hPSC, avec des mélanges de primitives et définitive hématopoïétiques potentiel15,16, 17,19,22,23,25. En outre, de nombreux protocoles sans sérum hématopoïétiques ont décrit les exigences en matière de signal pour la spécification du mésoderme de hPSCs qui abrite hématopoïétiques potentiels18,20,21, 24. Cependant, comme ces méthodes ont toujours donné lieu à des mélanges hétérogènes des deux programmes, leur utilisation dans des applications cliniques et de la compréhension des mécanismes du développement peut être limitée.

Nous avons récemment construit sur ces études, alors que nous avons décrit les exigences spécifiques au stade signal ACTIVIN/NODAL et signalisation WNT dans spécification hématopoïétique primitive et définitive du mésoderme dérivé hPSC18,26 . Ce dernier était particulièrement unique, car son utilisation de la manipulation de signaux spécifiques au stade WNT permet la spécification d’exclusive primitive ou exclusivement des progéniteurs hématopoïétiques définitif26. Au cours de la spécification du mésoderme, l’inhibition de la signalisation WNT canonique avec l’inhibiteur de la PORCN IWP2 se traduit par la spécification de CD43+ EryP-CFC et des progéniteurs myéloïdes, sans potentiel lymphoïdes détectable. Contraste, stimulation des canonique WNT signaling avec l’inhibiteur de la GSK3β, CHIR99021, au cours de la même étape de différenciation a provoqué l’absence totale de CD43 détectable+ EryP-CFC, tout en menant simultanément à la spécification du CD34+CD43− HE. Cette population possédait myéloïde, HBG-exprimant érythroïdes et lymphoïdes T potentiel. Les analyses subséquentes identifié ce qu’il manque l’expression CD7327,28 CD18428et son potentiel hématopoïétique était dépendante NOTCH28. En outre, unicellulaires analyses clonales ont démontré que ces lignées hématopoïétiques définitives pourraient provenir de cellules multipotentes28. Pris ensemble, ces études indiquent que stade WNT signaling manipulation permet de spécifier des progéniteurs hématopoïétiques primitives pures, ou multipotentes progéniteurs hématopoïétiques définitifs de NOTCH-dépendante.

Ici, nous exposons notre stratégie de différentiation qui génère des progéniteurs hématopoïétiques exclusivement primitifs ou définitifs, par manipulation de canonique WNT signalisation lors mésodermiques structuration et leur lignée hématopoïétique en aval des essais. Ce protocole est d’une grande utilité pour les chercheurs qui s’intéressent à la production de progéniteurs hématopoïétiques primitives ou définitifs de hPSCs pour les applications de la médecine régénérative.

Protocole

1. réactifs

  1. obtenir cell lines ; CSEh ou hiPSCs 1, souris fibroblastes embryonnaires (MEFs) 29, OP9-DL4 stroma 30 , 31.
  2. préparation du réactif
    1. préparer une solution à 0,1 % p/v de la gélatine dans du PBS. Stériliser à l’autoclave et conserver à 4 ° C après aliquotage.
      1. Prepare les ustensiles en plastique enduit de gélatine. Manteau 6 paraboloïdes avec 1,5 mL de solution de gélatine de 0,1 %. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Immédiatement avant l’emploi, aspirer la solution de gélatine restante.
    2. Préparer les médias MEF en faisant IMDM avec 15 % v/v FBS et 1 x antibiotiques. Compléter avec 2 mM de L-glutamine et 400 µM monothioglycerol (MTG) avant utilisation et conserver à 4 ° C.
    3. Préparer les milieux de culture hPSC comme solution de DMEM/F12 avec 20 % v/v knockout sérum de remplacement (KOSR), 1 x non essentiels des acides aminés (NEAA), 1 x antibiotiques, 55 µM β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine et 10 ng/mL bFGF. Filtre pour stériliser avec un filtre de 2 µm et stocker dans l’obscurité à 4 ° C.
    4. Préparer le milieu sans sérum médias de lavage comme une solution de DMEM/F12 avec 5 % v/v KOSR et HCl. filtre de 4 mM à stériliser avec un filtre de 2 µm, aliquot et stocker dans l’obscurité à 4 ° C.
    5. Faire une DNase 1 mg/mL j’ai solution en dissolvant la DNase I pour 3-4 h dans l’eau désionisée glacee, stérile sur la glace. Filtre pour stériliser avec un filtre de 2 µm et stocker les aliquotes à -20 ° C.
    6. Préparer la solution d’arrêt avec les médias de lavage : ajouter 10 % FBS et 10 µg/mL DNase I. La solution d’arrêt doit être préparée juste avant utilisation.
    7. Préparer la matrice de la membrane basale (p. ex., matrigel, dénommé MAT sur le connaissement) solution de mélange.
      Remarque : Toutes les étapes de préparation et d’utilisation du mélange MAT doivent être effectuées sur la glace ou à 4 ° C. dégel congelés MAT dans la glace à 4 ° C durant la nuit. Diluer le MAT 1:1 en ajoutant 10 mL glacée IMDM et froid dans la glace à 4 ° C la nuit. Diluer le mélange MAT avec une autre 20 mL glacée IMDM et froid dans la glace à 4 ° C la nuit. Aliquote dans des tubes préalablement réfrigérées et conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation. Lorsque vous êtes prêt à utiliser, décongeler MAT mélange nuit à 4 ° C. Plaques de culture cellulaire
      1. manteau le MAT.
        Remarque : Toutes les étapes de revêtement MAT plaques devraient être effectuées sur la glace. Plaques 6 puits et 24 plats pré refroidissement à-20 ° C pendant au moins 1 h. Lorsque vous êtes prêt à plaques de couche, placez-les sur la glace. Enrober chaque puits avec 4 x dilué MAT, enlever et réutiliser tout excédent de solution. Laissez sur la glace pendant 30 à 60 min et aspirer les tapis de l’excès. Sécher les plaques de revêtement MAT dans une étuve à 37 ° C 5 % CO 2 pendant au moins 3 h. utilisation dans les 72 h du revêtement.
    8. Préparez la solution de 10 % de sérum albumine Bovine (BSA) en dissolvant 10 % p/v BSA dans l’eau glacée, distillée, déminéralisée à 4 ° C pendant 3-4 h. filtre à stériliser avec un filtre de 2 µm dans un magasin et occultants bouteille à 4 ° C.
    9. Préparer la solution d’acide ascorbique. Lentement dissoudre une solution de 5 mg/mL d’acide L-ascorbique dans l’eau glacée, distillée, déminéralisée sur glace pendant 3-4 h. tourbillon parfois jusqu'à dissolution. Filtre pour stériliser avec un filtre de 2 µm et stocker les aliquotes à -20 ° C.
    10. Préparer les médias sans sérum différenciation (SFD) en faisant une solution de 75 : 25 de IMDM:Ham ' s F-12, puis ajouter 0,5 % de BSA, 1 x B27 et 0,5 x N2 suppléments. Conserver à 4 ° C. Ajouter 1 x L-glutamine, 50 µg/mL d’acide ascorbique, 400 µM MTG et 150 µg/mL holo-transferrine immédiatement avant d’utiliser.
    11. Préparation des milieux de culture sans sérum des cellules souches (p. ex., StemPro, dénommé SP34 sur le connaissement) par le fabricant ' instructions de s. Conserver à 4 ° C. Ajouter 1 x L-glutamine, 50 µg/mL d’acide ascorbique, 400 µM MTG et 150 µg/mL holo-transferrine immédiatement avant d’utiliser.
    12. Préparer la solution de collagénase II de 0,2 % par dissolution collagénase II à une concentration finale de 0,2 % p/v dans la solution de FBS:PBS de 1:4. Dissoudre au bain-marie à 37 ° C pendant au moins 15 min. filtre pour stériliser la solution avec un filtre de 2 µm et stocker les aliquotes à -20 ° C.
    13. Préparer le buffer de tri cellulaire activé par Fluorescence (FACS) comme une solution de 5 % FBS dans IMDM immédiatement avant d’utiliser.
    14. Préparer OP9 médiatique comme une solution de α-MEM, 20 % FBS, 2 mM de L-glutamine et 1 x antibiotiques. Filtre à stériliser avec un filtre de 2 µm et conserver à 4 ° C.
    15. Obtenir de méthylcellulose axée sur les médias (p. ex., MethoCult, dénommé MeC sur le connaissement) comme quantités pre-aliquotés 3 mL ou une bouteille de 100 mL. Si vous utilisez les 100 mL MeC, à son arrivée, diviser en parties aliquotes de 2,5 mL de tubes coniques 14 mL.
      Remarque : Toutes les parties aliquotes doivent être conservés à moyen de MeC-20 ° C. parties aliquotes doivent être décongelés immédiatement avant d’utiliser.

2. Mésoderme différenciation des hPSCs

  1. Grow la hPSC lignées cellulaires sur MEFs à confluence de 70 à 80 %, dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO 2.
    Remarque : Le hPSCs doit avoir des frontières nettes et indifférenciées.
  2. Ustensiles en plastique enduit MAT préparer 24h avant le passage de l’hPSCs.
    Remarque : Le nombre total d’enduit MAT 6 puits plats varie dans l’ensemble de lignes hPSC. Normalement, trois plats de 6 puits suffisent par plat de 6 puits de hPSCs confluentes sur MEFs.
    1. Effectuer un essai feeder-appauvrissement de la couche avec des ratios différents de puits hPSCs:MAT anastomosé (1:4, 1:3, 1:2, etc.) avant la première différenciation pour déterminer combien enduit MAT 6 puits plats doivent être utilisés pour des différenciations ultérieures.
      Remarque : 24 h après le placage sur tapis, la hPSCs doit être anastomosé de 80 à 90 %, avec des touffes de cellule d’environ 10-20 cellules de taille.
  3. Aspirer les médias hPSC et ajouter 1 mL de 37 ° C 0,25 % trypsine-EDTA à chacun bien pendant 1 min. aspirer et ajouter 1 mL de milieu de STOP dans chaque puits. À l’aide d’un grattoir de cellules, gratter les cellules de la plaque. Ajouter 1 mL de tampon de lavage à chaque puits.
    1. Avec une pipette sérologique de 2 mL, triturer 3 - 5 fois pour casser vers le haut de grosses touffes de cellules et de transférer les cellules dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger le hPSCs à 330 x g pendant 5 min.
  4. Remettre en suspension les cellules dans un volume total de médias hPSC équivalent à 2 mL par puits des contenants de plastique MAT-enduit à utiliser. Ajouter 2 mL/puits de hPSCs dans les ustensiles en plastique et incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO 2.
  5. 24 h plus tard, aspirer les médias et remplacer par 37 ° C 0,05 % trypsine-EDTA pour 1 min. aspirer la trypsine-EDTA et ajouter 1 mL de milieu de STOP. Grattez les cellules vigoureusement avec un grattoir de cellules. Ajouter 1 mL de milieu de lavage à chaque puits. Avec une pipette sérologique de 2 mL, triturer les cellules 1 ou 2 fois et transvaser dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger les cellules à 220 x g pendant 5 min.
    Remarque : La durée de la trypsine-EDTA traitement shouLD déterminés par l’enquêteur pour chaque ligne de hPSC. Le traitement par la trypsine appliquer aussi longtemps que possible sans provoquer la dissociation de cellule unique. Cette étape devrait détacher tous les hPSCs sur les plaques de revêtement MAT, mais pas donné lieu à la dissociation des cellules individuelles. EBs qui en résulte doit être 6-10 cellules, enmoyenne.
  6. Aspirer les médias. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, resuspendre doucement les cellules de 20 mL de milieu de lavage. Centrifuger à 220 x g pendant 5 min.
  7. Resuspendre doucement l’EBs dans médias jour 0 (tableau 1). Verser 2 mL de milieu de différenciation contenant EBs dans chaque cupule d’une boîte de culture cellulaire faible 6 puits adhérentes à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Place dans un incubateur à 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2 (gaz).
    Remarque : Médias de jour 0 : médias SFD additionné de 10 ng/mL BMP4 (tableau 1). Pour chaque deux plaques de hPSCs, utilisez une boîte de Petri de 6 puits peu adhérentes cellule.
  8. 24 h plus tard, ajouter 2 mL 1 jour médias (tableau 1). Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur multi-gaz.
    NOTE : Médias jour 1 : médias SFD additionné de 10 ng/mL BMP4 et 10 ng/mL bFGF dans chaque cupule (tableau 1).
  9. 18 h plus tard, doucement récolter l’EBs avec une pipette sérologique de 5 mL et un essorage à 100 x g pendant 5 min. laver et combiner les cultures entières 10 ml IMDM. Essorage a 100 x g pendant 5 min. aspirer les médias.
    Remarque : Les débris existera dans les cultures. Cette étape de centrifugation à faible vitesse (100 x g) va supprimer les débris.
  10. Resuspendre doucement l’EBs dans les médias SFD additionnés de jour 2 médias (tableau 1) et puis diluer 2 mL par puits dans des plaques de culture cellulaire 6 puits peu adhérentes. Incuber dans un incubateur multi-gaz à 37 ° C pour 30 h.
    NOTE : Médias jour 2 : 10 ng/mL BMP4 et 5 ng/mL protéine et l’approprié WNT agoniste ou un antagoniste (tableau 1).
    1. Ajouter 3 µM CHIR99021 pour spécifier les progéniteurs hématopoïétiques définitifs. Sinon, ajouter 3 µM IWP2 et 1 ng/mL activine A pour spécifier des progéniteurs hématopoïétiques Primitives.
  11. Continuer à la Section 3 pour la spécification des cellules souches hématopoïétiques.

3. spécification du CD34 + progéniteurs hématopoïétiques

  1. après 30 h, isoler l’EBs avec une pipette sérologique de 2 mL au jour 3 de différenciation. Transvaser dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 330 g pour 5 min. Resuspendre doucement et laver avec 10 mL d’IMDM. Centrifuger les cellules à 330 x g pendant 5 min.
  2. Remettre en suspension l’EBs en milieu de journée 3 (tableau 2) et verser 2 mL dans chaque puits de plaques 6 puits peu adhérentes. Incuber les cellules dans un incubateur multi-gaz à 37 ° C pendant 72 h.
    NOTE : Médias jour 3 : SP34, additionné de 15 ng/mL VEGF et bFGF 5 ng/mL (tableau 2). Ajouter des éléments multimédias plus / puits si le pH du milieu récoltés le jour 3 de différenciation a changé considérablement (c.-à-d. médias jaune-orange). Alternativement, utiliser moins d’EBs / puits au jour 0.
  3. Après 72 h d’incubation, ajouter 2 mL de jour 6 médias (tableau 2) dans chaque puits. Incuber dans un incubateur à 37 ° C multi-gaz pour une supplémentaire 48 h.
    NOTE : Médias jour 6 : médias SP34 additionné de 15 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 UI OEB, 20 ng/mL IL-6, 10 ng/mL IL-11 et 50 ng/mL de IGF-1 (tableau 2). Si plusieurs médias a été ajouté à l’étape 3.1, puis ajouter la quantité équivalente de médias à l’étape 3.2 pour que les concentrations de cytokine final restent le même.
  4. Isoler l’EBs traités CHIR99021 sur 8 jours de la différenciation. Passez à la Section 4.
  5. IWP2-EBs traitées sont récoltées sur 8 jours de différenciation dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger à 330 x g pendant 5 min. Resuspendre doucement au jour 8 médias (tableau 2). Incuber pendant 24 heures dans une étuve à 37 ° C 5 % CO 2 en bas plats adhérentes. Passez à la Section 4.
    NOTE : Médias jour 8 : SP34 milieux supplémentés avec 100 ng/mL SCF, IU 2 EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL de IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L et 30 ng/mL IL-3 (tableau 2).

4. Enzymatique de Dissociation de l’EBs et isolement de progéniteurs hématopoïétiques

tube
  1. isolat l’EBs avec une pipette sérologique dans une conique de 50 mL. Centrifuger à 330 x g pendant 5 min aspirer hors du surnageant.
  2. Ajouter 2 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA à l’EBs. Vortexer pendant 5 s. Incuber dans un bain-marie à 37 ° C pendant 8 min. Ajouter 5 mL de solution d’arrêt. Centrifuger à 330 x g pendant 5 min aspirer hors du surnageant.
  3. Remettre en suspension l’EBs dans 5 mL de collagénase II. Vortexer pendant 5 s et incuber dans un bain-marie à 37 ° C. Après 60 min, Vortexer pendant 5 s et ajouter 5 mL de solution d’arrêt. Tournant à 330 x g pendant 5 min. aspirer hors du surnageant.
  4. Dans 1 mL de tampon de FACS, remettre les cellules en suspension. Passer les cellules à travers un tamis de cellule de 40 µm. Cette opération supprime tout amas de cellule non dissocié.
  5. Compte les cellules non vides. Aliquote 1 x 10 6 cellules dans un tube conique 14 mL. Faire tourner les cellules à 330 x g pendant 5 min. remettre les cellules à une concentration de 5 x 10 6 cellules/mL dans le tampon de FACS. Aliquote et piscine 10 % des cellules dans chaque État pour les contrôles de couleur de cytométrie en flux. Incuber les cellules en anticorps pendant 30 minutes sur la glace, dans l’obscurité.
    NOTE : Voir a suggéré un fluorophore combinaisons dans la Table des matières.
    1. Les cellules traitées pour IWP2, utiliser des anticorps anti-CD34 et anti-CD43.
    2. Les cellules traitées pour CHIR99021, utiliser des anticorps anti-CD34, anti-CD43, anti-CD73 et anti-CD184.
  6. Rincer les cellules deux fois à l’aide de tampons de FACS. Tourner à 330 g pour 5 min. remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 5 x 10 6 cellules/mL.
  7. Analyser ou isolat cellules par cytométrie en flux. Pour les progéniteurs hématopoïétiques primitives, analyser l’expression CD34 et CD43 ( Figure 2 a). Pour les progéniteurs hématopoïétiques définitifs, isoler le HE (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) par FACS ( Figure 2 b). Recueillir les cellules dans des tubes contenant un tampon de FACS réfrigéré.
  8. Pour évaluer le potentiel hématopoïétique définitif d’isolée HE, continuer à la Section 5 pour la transition endothéliales-à-hématopoïétique ou Section 7 pour essai T-lymphoïdes. Pour les tests de CFC hématopoïétiques primitives, continuer à la Section 6.

5. Transition endothéliales-à-hématopoïétiques

  1. Spin le CD34 isolé + CD43 − CD73 − CD184 − cellules à 330 x g pendant 5 min. remettre en suspension les cellules il médias à 200 000 cellules/mL ( Tableau 2). Distribuer les cellules dans 50 µL d’extraits dans une plaque de culture de cellules de 96 puits peu adhérentes. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur à multi-gaz 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2.
    Remarque : Il médias : médias SP34 additionné de 5 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, IU 2 EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL de IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL IL-3, 10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL SHH, 10 µg/mL de l’angiotensine II et 100µm Losartan potassium à 2 x 10 5 cellules/mL (tableau 2).
  2. Préparer les plaques de revêtement MAT 24 puits (voir étape 1.2.7.1), suff.
  3. Les cellules regroupera en amas de cellules de 6 à 10 du jour au lendemain. Pour chaque volume de 50 µL de cellules reaggregated, transférer doucement les cellules au centre d’une plaque de couche de MAT de 24 puits sur le lendemain matin. Placez délicatement la plaque en incubateur multi-gaz 37 ° C pendant 4 à 6 h, jusqu'à ce que les cellules sont attachés.
  4. Ajouter 1 mL de supports HE neufs dans chaque puits, après que les cellules sont attachés. Incuber les cellules dans un incubateur à multi-gaz 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2 jusqu'à ce que les cellules hématopoïétiques sont visibles (en général 5 à 7 jours ; figure 2D). Visualiser à l’aide d’un microscope optique à grossissement X inférieures à 100.
  5. Récolte les progéniteurs hématopoïétiques définitifs en retirant doucement les médias HE de cellules. Passer ce média à travers un tamis de cellule 40 µm et collecter. Pour les cellules adhérentes dans le puits, ajouter 0,5 mL de 0,25 % trypsine-EDTA aux cellules et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 0,5 mL STOP solution à chaque puits. Passer à travers les cellules à travers le même tamis de cellule 40 µm pour mettre en commun tous les adhérentes et non adhérentes ensemble. Tourner à 330 x g pendant 5 min.
    1. Pour évaluer le potentiel de CFC de cette culture en vrac, passez à la Section 6.
  6. Laver les cellules deux fois en mémoire tampon de FACS. Tourner à 330 x g pendant 5 min.
  7. Remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS à 5 x 10 6 cellules/mL. Colorer les cellules avec des anticorps anti-CD45 et anti-CD34 pendant 30 minutes sur la glace dans l’obscurité (suggère fluorophores sont dans la Table des matières).
  8. Laver les cellules deux fois en mémoire tampon de FACS. Tourner à 330 x g pendant 5 min.
  9. Isoler le CD34 + CD45 + cellules de FACS ( Figure 2E). Trier les cellules réfrigérée tampon FACS.
  10. Évaluer le CD34 définitif + CD45 + des progéniteurs hématopoïétiques comme nécessaires (test de CFC dans la Section 6, potentiel lymphoïde dans la Section 7 ou un autre dosage menée à l’initiative).

6. Dosage de CFC

  1. décongeler des parties aliquotes de MeC pour chaque échantillon utilisé pour le dosage de la CFC.
  2. Ajouter les cellules pour être analysées (étapes 4.5, 4.7, 5.5 ou 5,9) en MeC. Vortex soigneusement et laissez les cultures de MeC représentent pendant 5-10 min jusqu'à ce que les bulles d’air se dissipent, selon le fabricant ' instructions de s. À l’aide d’un 16 ½ aiguille sur une seringue de 3 mL de calibre, retirer délicatement les 2 mL du VEM.
    NOTE : Électrodéposition typique densités varient de 1 000-20 000 cellules/mL, selon la fréquence de progéniteurs attendu.
  3. Soigneusement, diluer 1 mL de mélange cellulaire MeC dans chacune des deux plats de vitroplants de 35 mm. Répartir uniformément le MeC dans les plats de 35 mm en tapant doucement faisant tourner le plat. Chacun des plats ci-dessus placer dans un plat de culture de tissu de 15 cm rempli d’eau. Incuber dans un incubateur à 37 ° C 5 % CO 2.
  4. Visualiser les cultures de MeC à l’aide d’un microscope optique avec un grossissement de 40 X. Quantifier les différents CFC obtenus. Analyser les dosages de CFC Primitive 8-10 jours après l’ensemencement ( Figure 2). Analyser les tests définitifs CFC 14 jours après l’ensemencement. Morphologies de colonie représentant CFC dosage peuvent être vu dans la Figure 2F.

7. Dosage des lymphocytes T à établir définitivement hématopoïétiques potentiels

  1. Grow la DL4-OP9 cellules jusqu’au confluent dans un 100 mm vitroplants plat 30 , 31 , 32.
    1. dégel la DL4-OP9 cellules 72-96 heures avant les essais sur des cellules de T de placage. Remettre en suspension les cellules OP9-DL4 dans 10 mL OP9 médias et verser dans une plaque de 10 cm. Grandir dans une étuve à 37 ° C 5 % CO 2 jusqu'à 70-90 % anastomosé.
    2. De récolter les cellules OP9-DL4 d’un plat de 100 mm, retirez le support et ajouter 5 mL de 0,25 % trypsine-EDTA pendant 5 min. arrêter l’activité de la trypsine par 5 mL OP9 médias. Faire tourner les cellules à 330 x g pendant 5 min. remettre les cellules en 1 mL OP9 médias et compter les cellules non vides.
      Remarque : Une plaque de 10 cm de OP9-DL4 confluentes produira environ 10 x 10 6 cellules OP9-DL4.
    3. 48 h avant le test de lymphocytes T, cellules 6 plaque 2 x 10 à 12 mL OP9 médias dans un plat de 24 puits (0,5 mL par puits). Grandir dans une étuve à 37 ° C 5 % CO 2.
  2. Ajouter 2 000-10 000 cellules à doser (tel qu’obtenu en étapes 4.5, 4.7, 5.5 ou 5,9) à 1 bien de cellules OP9-DL4 OP9 milieux additionnés : 30 ng/mL SCF (6 premiers jours uniquement), 5 ng/mL IL-7 et 5 ng/mL FLT3-L. Incuber à 37 ° C 5 % CO 2 inc ubator. Aucun changement de médias se produire à cette étape.
  3. Tous les 4 - 5 jours, passage les progéniteurs des lymphocytes T sur des cellules stromales OP9-DL4 fraîches dans un plat de 6 puits. Triturer les cellules avec une pipette de 1 mL et passer à travers un filtre de 40 µm pour éliminer les touffes. Tournant à 330 x g pendant 5 min. aspirer hors des médias. Remettre en suspension les cellules dans 2 mL de frais OP9 médias additionné de 5 ng/mL IL-7 et 5 ng/mL Flt3-L et lieu sur des cellules fraîches OP9-DL4.
    Remarque : 48 h avant le passage, sur plaque de 2 x 10 6 cellules fraîches de OP9-DL4 dans 12 mL OP9 médias et distribuer 2 mL par puits dans des plats de 6 puits.
  4. Après au moins 21 jours de culture mixte, triturer les cellules vigoureusement et passent à travers un filtre de 40 µm pour éliminer les débris cellulaires. Tourner à 330 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant.
  5. Laver les cellules deux fois dans le tampon de FACS froid. Tourner à 330 x g pendant 5 min.
  6. Remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS à 5 x 10 6 cellules/mL. Tache de cellules avec des anticorps anti-CD45, anti-CD56, anti-CD4 et CD8-anti pendant 30 minutes sur la glace dans l’obscurité (fluorophore suggérée combinaisons sont dans la Table des matières). Appliquer une tache live/dead cell (DAPI, etc.) afin d’éliminer les débris de l’analyse.
  7. Laver les cellules deux fois en mémoire tampon de FACS. Tourner à 330 x g pendant 5 min.
  8. Analyser les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux afin d’évaluer la présence de géniteurs de lymphocytes T ( Figure 3).

Résultats

Un schéma illustrant l’induction des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitives de hPSCs est illustré à la Figure 1. Mésoderme structuration par canonique WNT signaling se produit pendant les jours 2 et 3 de la différenciation, suivie de la spécification des cellules souches hématopoïétiques.

Représentatif de cytométrie et formant les dosages de méthylcellulose de cul...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode rapide, sans sérum, exempt de stroma de la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives ou définitifs. Mésodermiques spécification des progéniteurs hématopoïétiques primitives ou définitifs peut être réalisée de façon fiable utilisant notre protocole, qui exploite uniquement des petites molécules inhibitrices de la signalisation WNT canonique. Activation de WNT spécifiques au stade de l’inhibiteur de la GSK3β CHIR9902133 donn...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Department of Internal Medicine, Division d’hématologie, Washington University School of Medicine. CD a été pris en charge par T32HL007088 du National Heart, Lung, and Blood Institute. CMS a été pris en charge par une société américaine d’hématologie Scholar Award.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD)Corning10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell ratedGemini Bioproducts100-500
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30396.03
L-glutamine, 200 mM solutionLife Technologies25030-081
Penicillin-streptomycinLife Technologies15070-063
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies25200056
0.05% Trypsin-EDTALife Technologies25300054
Gelatin, porcine skin, Type ASigma-AldrichG1890
Alpha-MEMLife Technologies12000-022
DMEM-F12Corning10-092-CV
Knock-out serum replacementLife Technologies10828028"KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA)Life Technologies11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solutionLife Technologies21985023
Hydrochloric acidSigma-AldrichH1758
Fraction V, Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1605
Ham's F12Corning10-080
N2 supplementLife Technologies17502048
B27 supplement, no vitamin ALife Technologies12587010
Stempro-34 (SP34)Life Technologies10639011"SP34"
Growth factor reduced MatrigelCorning354230"MAT"
L-absorbic acidSigma-AldrichA4403
Human serum transferrinSigma-Aldrich10652202001
Monothioglycerol (MTG)Sigma-AldrichM6145
Collagenase BRoche11088831001
Collagenase IILife Technologies17101015
DNaseICalbiochem260913
Phosphate Buffered Saline (PBS)Life Technologies14190144
bFGFR&D Systems233-FB
BMP4R&D Systems314-BP
Activin AR&D Systems338-AC
VEGFR&D Systems293-VE
SCFR&D Systems255-SC
IGF-1R&D Systems291-G1
IL-3R&D Systems203-IL
IL-6R&D Systems206-IL
IL-7R&D Systems207-IL
IL-11R&D Systems218-1L
TPOR&D Systems288-TP
EPOPeprotech100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L)R&D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
Angiotensin IISigma-AldrichA9525
Losartan PotassiumTocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4BD Biosciences560650Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8BD Biosciences561950Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12BD Biosciences340441Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12BD Biosciences348801Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10BD Biosciences555475Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1BD Biosciences557833Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1BD Biosciences642284Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159BD Biosciences555518Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2BD Biosciences550257Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5BD Biosciences555976Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)BD Biosciences564907Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cellsHolmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034Stemcell Technologies4034"MeC"
Milli-Q water purification systemEMD Millipore
5% CO2 incubatorSet at 37 C
Multigas incubatorSet at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plateCorning353046
24 well tissue culture plateCorning353226
6 well low-adherence tissue culture plateCorning3471
24 well low-adherence tissue culture plateCorning3473
35 mm tissue culture dishesCorning353001
Blunt-end needle, 16 gaugeCorning305198
3 cc syringesCorning309657
5 mL polypropylene test tubeCorning352063
5 mL polystyrene test tubeCorning352058
15 mL polypropylene conicalCorning430791
50 mL polypropylene conicalCorning430921
2 mL serological pipetteCorning357507
5 mL serological pipetteCorning4487
10 mL serological pipetteCorning4488
25 mL serological pipetteCorning4489
Cell scrapersCorning353085
2.0 mL cryovialsCorning430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainerCorning352235
40 µM cell strainerCorning352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo softwareTreeStar
Water bathSet at 37 C
0.22 µM filtration systemCorning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

Références

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