إعداد الفسيولوجية للخلايا الشعر من كييس من ضفدع الثور (<em&gt; رنا catesbeiana</em&gt;)

Summary

يسمح (رنا catesbeiana) كييس الضفدع الأمريكي الفحص المباشر من علم وظائف الأعضاء خلايا الشعر. هنا يتم وصف تشريح وإعداد كييس الضفدع للدراسات الفيزيائية الحيوية. وتبين لنا تجارب تمثيلية من هذه الخلايا الشعر، بما في ذلك حساب علاقة قوة النزوح حزمة وقياس حركته السهلة.

Abstract

دراسة السمع والتوازن تقع على الأفكار المستقاة من الدراسات الفيزيائية الحيوية أنظمة نموذجية. واحدة من هذه النموذج، وكييس من الضفدع الأمريكي، أصبحت الدعامة الأساسية للبحث السمعي والدهليزي. وقد كشفت الدراسات التي أجريت على هذا الجهاز كيف الشعر الخلايا الحسية يمكن الكشف بنشاط إشارات من البيئة. لأن هذه الدراسات، ونحن الآن فهم أفضل للالنابضة الميكانيكية وتوطين قنوات التنبيغ خلية الشعر، دور الكالسيوم في التكيف الميكانيكية، وهوية التيارات خلية الشعر. استمر هذا الجهاز للوصول للغاية لتوفير نظرة ثاقبة على عمل خلايا الشعر. نحن هنا وصف إعداد كييس الضفدع للدراسات الفيزيائية الحيوية في خلايا الشعر لها. نحن تشمل إجراء تشريح كامل وتوفير بروتوكولات محددة لإعداد كييس في سياقات محددة. ندرج بالإضافة إلى النتائج ممثل باستخدام هذا الإعداد، بما في ذلك حسابربطة الشعر لحظية علاقة القوة التشريد وقياس التذبذب عفوية حزمة و.

Introduction

أجهزة acousticolateralis من الثدييات تمتلك بنية معقدة وتقع ضمن مكانة التشريحية التي يمكن أن يكون من الصعب الوصول إليها. على سبيل المثال، تتكون القوقعة الثدييات متاهة المتصاعد، وجزءا لا يتجزأ من داخل العظم الصدغي سميكة. عزل القوقعة غالبا ما يسبب التلف الميكانيكي إلى الخلايا الحسية الكذب داخلها، وبالتالي قد ثبت أن يكون مهمة صعبة ^1. وهكذا تحولت علماء الأعصاب لنموذج النظم التي يتم استخراج بسهولة أكبر من المعتكف من الأذن.

واحد من أنظمة نموذج هذه، وكييس من الضفدع الأمريكي (رنا catesbeiana)، كانت لعقود طويلة أثمرت فكرة تعميم إلى وظيفة جهاز سمعي والدهليزي. وكييس هو الجهاز مختلط وظيفة مع الأدوار الحسية في كل جلسة التردد المنخفض والإحساس الزلزالي. الخلايا الحسية من كييس هي خلايا الشعر لها، محولات الطاقة المتخصصة التي تحول الطاقة الميكانيكيةإلى إشارات كهربائية داخل أجهزتنا السمعية والدهليزي. إسقاط من السطح القمي كل خلية الشعر هو mechanosensitive ربطة الشعر التي تضم خصلة متدرجة من الزغيبات الصغيرة موسعة دعا أهداب ساكنة. مترابطة نصائح من أهداب ساكنة المجاورة من البروتينات الارتباط طرف الخيطية التي ميكانيكيا بوابة القنوات الأيونية في الاستجابة للمؤثرات الميكانيكية ^{2، 3.} على الرغم من أن الأجهزة السمعية والدهليزي تستجيب لأنواع مختلفة من المحفزات، إلا أنهما يشتركان آلية الكشف المشتركة. هذه القواسم المشتركة راء العديد من الخبرات المكتسبة في mechanotransduction خلايا الشعر من خلال دراسات كييس الضفدع. على سبيل المثال، تمت دراسة عملية نشطة الخلية الشعر على نطاق واسع في هذا الجهاز ^{4، 5، 6، 7،} وربطة الشعر توظف عملية مستهلكة للطاقة لانتاج الميكانيكيةعمل. وقد تبين ليس فقط أن خلايا الشعر تولد العمل النشط ^6، ولكن تم كشف النقاب عن آليات متميزة الكامنة وراء عملية نشطة وخصائص ضبط خلية الشعر من خلال دراسات الضفدع acousticolateralis الأجهزة. وتشمل هذه النشطة الشعر حزمة الحركة ⁽⁸⁾ وخلية الشعر الرنين الكهربائي ^{9، 10، 11} في كييس والانتقائية تردد في الخلية الشعر المشبك الشريط ¹² في حليمة البرمائيات.

كييس الضفدع وتناشد علماء الأعصاب الحسية لأسباب عديدة. وخلافا للالقوقعة الثدييات، هذا الجهاز تكمن داخل الكبسولة يمكن الوصول إليها بسهولة. ثانيا، يمكن خلايا الشعر داخل هذا الجهاز يبقى صحي لعدة ساعات في ظل ظروف مناسبة ^{13، 14.} هذا يسمح experimentatأيون على هذه الخلايا على مدى فترات زمنية طويلة نسبيا مع نظرائهم الثدييات. ثالثا، الجهاز يحمل انحناء قليلا، والسماح سهولة التلاعب. رابعا، ويتألف كل جهاز من ألف أو أكثر من خلايا الشعر ^15، وتوفير كل إنتاجية عالية واحتمال كبير لتحديد مجموعة مناسبة من خلايا الشعر لتجربة معينة. وأخيرا، هو تصور كييس الضفدع بسهولة نظرا لركاكة هذا الجهاز وحجم كبير من الخلايا شعره.

توفر هذه الخصائص مرونة كبيرة لدراسة الخلايا الحسية في كييس الضفدع ل. اعتمادا على هذه المسألة في يد واحدة من عدة الاستعدادات التجريبية يمكن الحصول عليها من كييس. وأبسط هذه هي إعداد-غرفة واحدة. هنا يجمد كييس في غرفة مليئة perilymph الاصطناعي، والمياه المالحة الغنية الصوديوم والكالسيوم عالية. هذا المستحضر يمكن دراسة التيارات خلية الشعر والميكانيكا ربطة الشعر الأساسية. والتكوين ثان، وإعداد من مجلسين، ويمكن استخدامها لدراسة الحركات ربطة الشعر عفوية. هنا يتعرض الجانب قمية من خلايا الشعر لالمالحة البوتاسيوم الغنية والكالسيوم الفقراء يسمى اللمف الجواني الاصطناعي، في حين أن استحم الجانب basolateral في perilymph الاصطناعي. هذين القسمين تحاكي الترتيب في الجسم الحي من ملاحات وتوفر بيئة تسمح حزم الشعر إلى التأرجح من تلقاء أنفسهم.

وصفنا في هذه الورقة إعداد كييس الضفدع لدراسة الفيزيائية الحيوية من خلايا الشعر الحسية لها. علينا أولا توفير تصوير مفصل لعزل هذا الجهاز من الأذن الداخلية الضفدعة. نحن ثم وصف كل من واحدة واثنين من غرفة الاستعدادات التجريبية وتشمل نتائج ممثل عن كل التكوين.

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة روكفلر.

1. ما قبل التجريبية Prespanparation

1. محاليل
   1. تحضير محلول الأوجينول (2.5 غرام · L ^-1 · كجم ^-1 الضفدع). تحضير المحاليل الملحية (الجدول 1).
      ملاحظة: للحصول تحضير-غرفة واحدة، وإعداد perilymph الاصطناعي. لإعداد من مجلسين، وإعداد كل من perilymph الاصطناعي واللمف الجواني الاصطناعي.

2. أدوات التجريبية

1. إعداد الألياف الزجاجية التحفيز
   1. تضييق الشعرية البورسليكات الزجاج مع مجتذب الكهربائي في سحب خط واحد مع حرارة عالية وسرعة عالية. تحميل الشعرية سحبت في مجتذب يحركها الملف اللولبي.
   2. جلب طرف الشعرية تجاه خيوط مع حبة الزجاجذابت على ذلك حتى الاتصالات الشعرية حبة الزجاج.
   3. بدوره على خيوط لإذابة غيض من شعري إلى حبة الزجاج. مرة واحدة في جسر رقيقة من أشكال الزجاج بين الشعرية وحبة، إيقاف خيوط وحول نفس الوقت تفعيل مجتذب الملف اللولبي.
      ملاحظة: هذا سحب الزجاج الشعرية في الزاوية اليمنى لمحورها طويل وخلق الألياف الصلبة.
   4. تأكد من أن قطر الألياف هو ما لا يزيد عن 0،5-1 ميكرون وطوله لا يتجاوز 100-300 ميكرون. إذا تجاوز طول الألياف في هذا البعد، وتقليم مع مقص القزحية. استخدام مقص التي هي مملة لتجنب إتلاف أدوات تشريح بالفعل.
   5. لتعزيز النقيض البصرية، تفل معطف الألياف. استخدام المغطى تفل مع مصدر الذهب والبلاديوم. عموديا تحميل كل الألياف إلى المغطي تفل مع نهاية مدبب تجاه المصدر. جلب غيض من الألياف لمسافة 1-2 سم من مصدر الذهب والبلاديوم.
   6. أقفل التفل غرفة المغطي لتشكيل ختم وتشغيله. مطاردة مرارا الهواء المحيط مع الأرجون. بعد التنظيف الهواء، والحد من الضغط داخل الغرفة إلى 10 باسكال (70 mTorr).
   7. تفل معطف في 10 ثانية البقول مع 10 ثانية التأخير على مسار 120 ق.
      ملاحظة: سوف طرف والألياف وتلقي بظلالها على مدة هذا البروتوكول إذا كان للطلاء بالرش نجاحا.
2. إعداد الميكروية حادة
   1. سحب الزجاج الشعرية مع خيوط الداخلي باستخدام سطر واحد سحب الحرارة العالية. يجب أن يكون أقطاب المقاومة من 100-300 MΩ عندما تمتلئ 3 M بوكل. ملء كل قطب كهربائي مع 3 M بوكل.
   2. منعطف طرف كل قطب كهربائي مع microforge لجعله عمودي على سطح قمي خلية الشعر عندما شنت في مكبر للصوت headstage ^16.
3. إعداد الماصات الرحلان الشاردي
   1. سحب الزجاج الشعرية مع الداخليةالشعيرة إلى 50 MΩ طرف. ملء مع المذاب المركزة (كبريتات على سبيل المثال، 500 ملي جنتاميسين).
4. إعداد الألومنيوم مربع تصاعد
   1. قطع 1 سم مربع × 1 سم من رقائق الألومنيوم. خرم احباط في المركز مع غيض من قضيب تعطيل الدماغ أو غيرها من وجوه حادة. تشكيل ثقب بحيث تكون دائرية، وحوالي 1 ملم في القطر.
5. إعداد فراغ حقنة مليئة الشحوم.
   1. إزالة المكبس من حقنة 5 مل. ملء حقنة من الخلف مع الشحوم فراغ. استبدال الغطاس.
6. إعداد تترافلوروإيثيلين الغراء قضيب
   1. جعل محوري طويلة 2 مم قطع في نهاية عصا قضيب خشبي. يجب أن يكون الشق في وسط قضيب عندما ينظر إليها في نهاية جرا.
   2. مع مقص حاد أو شفرة حلاقة، وقطع 2 مم × 4 مم مستطيل تترافلوروإيثيلين من ورقة سماكة 1 ملم.
   3. استخدام شفرة حلاقة لرقيقة واحدة من حواف طويلة مم 2 من المستطيل تترافلوروإيثيلين. ابتداء من منتصف المستطيل، والحد من سماكة مستطيل تشريح الخارج لتشكيل شطبة على طرف المستطيل قبل.
   4. إدراج مستطيل تترافلوروإيثيلين إلى قضيب خشبي شق بحيث حافة المشطوف بعيدا عن عصا. تطبيق 5 دقائق الايبوكسي لقاعدة المستطيل تترافلوروإيثيلين لضمان الحصول عليها في المكان. السماح للقضيب الغراء لعلاج لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
7. إعداد النصف السفلي من يومين غرفة جبل
   1. آلة أو 3D طباعة النصف السفلي للمجلسين جبل (ملف إضافي 2). تحديد قطرها راحة الدائرة 20 ملم على السطح السفلي من الغرفة.
   2. تطبيق طبقة رقيقة من الايبوكسي لالجانبية الأكثر 3 ملم من دائرة راحة. تطبيق واحد 18 ملم ساترة زجاج دائري على الايبوكسي. السماح الايبوكسي لعلاج لمدة 1ح.

3. استخراج الأعضاء الداخلية الأذن

1. تخدير والضفدع الأمريكي عن طريق وضعها في دلو صغير يحتوي الأوجينول حل مخدر لمدة 10 دقيقة. ضبط مستوى الصوت من الحل بحيث الضفدعة العضدي-كتفي الأكاذيب مشتركة فوق واجهة السائل في الهواء.
2. الموت ببطء الضفدع تخدير عن طريق تعطيل الدماغ مزدوجة.
   1. فهم الضفدع تخدير مع إصبع واحد فوق أنفها وآخر تحت الفك وتدوير رأس الضفدع إلى الأمام.
   2. يغرق بسرعة قضيب بخع في قبو الجمجمة من خلال الثقبة العظمى، وهي موجودة في خط الوسط بين العمليات القذالي الضفدعة.
   3. ببطء سحب وتدوير قضيب حتى يخرج طرفها من ماغنوم الثقبة. إجبار قضيب caudally من خلال ثقب الفقري لتدمير النخاع الشوكي.
   4. تأكد من أن الضفادع قد pithed صحيح مضاعف بملاحظة أن السفلية التي يتم تمديدها.
3. فهم الضفدع مع الإبهام فوق الأنف وأول اصبع استيعاب الأسنان ميكعي لتحسين الاستقرار. قطع رأس الضفدع بقطع المفصل الصدغي الفكي الثنائي وبعد ذلك قطع متعامد على محور rostrocaudal. للتأكد من أن أجهزة الداخلية الأذن داخل الجمجمة لا تزال سليمة، تأكد من أن الخفض هو الذيلية إلى كل الأجزاء الغائرة.
4. باستخدام المجهر stereodissection، تنفيذ خط الوسط قطع طريق الأنسجة الحنك من الأسنان ميكعي إلى حد الأكثر الخلفي من الأنسجة (الشكل 1A).
5. قطع واضحة مع تخفيضات الأفقي للمشرط أي عضلة الكذب تحت أنسجة الحنك للكشف عن غضروف الخلفي. بعد إزالة العضلات، ومراقبة على شكل مصاصة من الغضروف الزمني يشكل الحد من الكبسولة أذني.
6. قطع وcolumella في جهة الإتصال مع الغضروف الكبسولة أذني ل.
7. حلاقة مرارا طبقات رقيقة من هذا الغضروف بجعل shalloتخفيضات الأفقية ث من خلال ذلك. تجنب تخفيضات كبيرة لمنع تلف الأجهزة الداخلية الأذن. هذا يفتح الكبسولة وجدت داخل هيكل مصاصة من الغضروف الزمني (الشكل 1B). داخل كبسولة أذني والأجهزة الداخلية الأذن الضفدعة (الشكل 1C).
8. تقليم الخلفية والحواف الجانبية للكبسولة أذني، مع الحرص على عدم تلف الأجهزة الداخلية الأذن. أثناء تشريح، وكثيرا ما تتدفق المياه المالحة على أجهزة الأذن الداخلية للتأكد من أنها لا تزال مغمورة ورطب.
9. تحديد اثنين من فتحات دائرية في العظم الصدغي في الاتصال وسطي من الغضروف في خط الوسط. قطع أسفل من خلال فتح معظم وسطي لتمزق في العظم الصدغي.
10. اجراء خفض الهابط الثاني من خلال كبسولة أذني على الحافة postero الجانبي لها. إزالة قطعة من الغضروف بين هذا وخفض السابق لتوفير الوصول إلى الأجهزة الداخلية الأذن.
11. نقب فضفاضة الغضروف بين التخفيضات من الخطوات 3.8 (أ)الثانية 3.9 وقطع عليه بعيدا عن كبسولة أذني. هذا الإجراء يقطع أقرب القناة الهلالية، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك بمثابة مؤشر لمزيد من التلاعب.
12. مع الحرص على عدم لمس كييس، قطع الثامن العصب القحفي ^{الخامس.}
13. عقد أمبولة أقرب القناة الهلالية. تناوب بلطف في الأذن الداخلية للكشف عن اثنين من القنوات الهلالية المتبقية. على فضح كل قناة، قطع عليه.
14. عقد العصب أو أمبولة القناة الهلالية، استخراج الأذن الداخلية من الرأس ووضعه في طبق مليء المبردة perilymph الاصطناعي بالأوكسجين. إزالة الأذن الداخلية تسمح التصور من الممرات داخل العظم الصدغي من خلاله القنوات نصف دائري مرت مرة واحدة (1D الشكل).
    ملاحظة: كرر هذه الخطوات لاستخراج الأذن الثانية.

4. إعداد-غرفة واحدة

1. عزل كييس
   1. تحديد موقع كييس من خلال تحديد مثقال ذرة لها كبيره كتلة غبار الأذن والعصب الكيسية التي تقع فوقه (الشكل 1E). الحرص على عدم الهلع جسديا كييس خلال الخطوات التالية من أجل المحافظة على سلامة خلايا الشعر الكييس.
   2. تقليم القنوات نصف دائري لتقديم الأذن الداخلية أكثر قدرة على المناورة.
   3. إزالة الخزان اللمف المحيطي تغمر الجانب العصبي من كييس. إجراء تخفيضات لطيف حول محيط البئر. التالي بقطع أعمدة صغيرة من الأنسجة التي تسد غشاء البئر على الجانب العصبي من كييس.
   4. إزالة الحوقلة والعصبية المرتبطة بها.
   5. عقد العصب الكيسي، ورفع بلطف كييس وقطع طريق غشاء رقيق من الكيس otoconial. كما تسرب غبار الأذن من الكيس، حرر كييس عن طريق خفض حول محيطه.
      ملاحظة: بعد عزل كييس، يمكن حفظ الأجهزة الداخلية الأذن المتبقية إذا رغبت في ذلك. إزالة كييس تخفف تحديد الهياكل الأخرى، مثلالحليمات البرمائيات والقاعدي.
   6. استخدام مقص أو ملقط لمسح بعناية بعيدا أي غبار الأذن المتبقية على كييس. والحرص على عدم لمس كييس خلال هذه العملية.
   7. تقليم أي المتبقية غشاء otoconial-كيس من حافة كييس ". هذا الغشاء يميل إلى التمسك البلاستيك والزجاج الأسطح وزواله يقلل من التحديات في التعامل مع الأنسجة.
   8. تدفق بلطف المالحة على كييس مع ماصة باستير لإزالة أي غبار الأذن المتبقية (الشكل 1F).
      ملاحظة: كرر هذا الإجراء لكييس الثاني، الذي هو صورة طبق الأصل من الأولى.
2. الهضم وتصاعد
   1. باستخدام نهاية الجزء الخلفي من ماصة باستور مع طرفها كسر، ونقل الكييسية معزولة إلى طبق بتري تحتوي على 3 مل من 67 ملغ ∙ L ^-1 البروتيني الرابع والعشرون في perilymph الاصطناعي.
      ملاحظة: هذا العلاج البروتيني خلاصتي وصلات الربط كل لمبة kinociliary إلى الحصيات السمعيةالغشاء، مما يتيح إزالة الغشاء دون الإضرار حزم الشعر الحسية.
   2. احتضان النسيج لمدة 30 دقيقة عند 22 درجة مئوية (أو 35 دقيقة في 21 درجة مئوية). نقل كل كييس هضمها إلى الغرفة التجريبية المفتوحة الوجه وتأمين الأنسجة مع دبابيس المغناطيسي.
   3. البقعة الكييس تقع تحت غشاء الحصيات السمعية مباشرة وهي جزء من كييس التي تحتوي على خلايا الشعر. التعرف عليه وإزالة بعناية غشاء الحصيات السمعية المغطي لها باستخدام رمش على ما يرام، مع الحرص على عدم لمس البقعة الكييس.

5. إعداد اثنين من غرفة

1. عزل كييس
   1. عزل كييس من الأجهزة الداخلية الأذن كما هو الحال في القسم 4.1.
2. تصاعد والهضم
   1. ملء كتلة التجمع (التكميلي ملف 3) مع perilymph الاصطناعي ووضع رقائق الألومنيوم مثقب على فتح واحد، وذلك باستخدام مركزين من فراغالشحوم إلى الاحتفاظ بها في مكان وشكل خاتم ضعيفة.
   2. نقل كييس واحد لاحباط ومركز على الجزء العلوي من ثقب مع البقعة أسفل وجدعة العصب مواجهة.
   3. إزالة المياه المالحة المحيطة كييس مع قطعة من النسيج الملتوية. الفتيل المياه المالحة لتجف على سطح مربع الألومنيوم المحيطة كييس.
   4. استخدام قضيب تترافلوروإيثيلين لتطبيق cyanoacrylate الغراء على شكل خاتم ضيق على طول الحدود بين حافة كييس وساحة الألومنيوم. تأكد من أن محيط كامل من كييس مغطى الغراء.
      ملاحظة: انطلاقا ببطء شديد يسمح الغراء cyanoacrylate للتسلل على الجانب العصبي من كييس وتغطي في نهاية المطاف. ولذلك فمن الضروري لإكمال هذه المهمة بسرعة.
   5. وضع قطرة من المياه المالحة على أعلى من الأنسجة التي شنت لعلاج الغراء. فيلم رقيقة من الغراء قد شكل على رأس قطرة من المياه المالحة. إزالته بالملقط.
   6. إزالة بعناية رانه احباط من كتلة متزايدة. الوجه الأنسجة التي شنت أكثر من ذلك أن الجانب البقعي للكييس يواجه صعودا وتطفو على المليئة perilymph طبق بيتري الاصطناعي.
   7. إضافة قطرة من البروتيني الحل الرابع والعشرون على رأس البقعة واحتضان لمدة 30 دقيقة في 22 ° C (أو 35 دقيقة في 21 درجة مئوية). ملء قناة الدنيا من جهاز من مجلسين (التكميلي ملف 2) مع الشحوم perilymph ومكان الفراغ في جميع أنحاء الغرفة المركزية.
   8. وضع كييس محمولة على احباط على النواب مع أعصابها التي تواجه سطح الغرفة. إضافة الشحوم حول محيط احباط.
   9. مكان الغرفة العليا (التكميلي ملف 1) من إعداد على احباط، مع الحرص على شكل خاتم الكامل مع الشحوم فراغ. ملء الغرفة العليا مع اللمف الجواني الاصطناعي انفجر وإزالة بلطف غشاء الحصيات السمعية مع رمش.

النتائج

ظهارة حسية من كييس الضفدع يمكن أن تستخدم في تشكيلات مختلفة للتحقيق في علم وظائف الأعضاء من خلايا الشعر. لأن الأنسجة مسطحة نسبيا، ويمكن تثبيته في كل من الاستعدادات واحدة واثنين من الغرفة. يوفر التكوين غرفة واحدة الإعداد بسيطة عن التسجيلات الكهربية والميكرو ميكانيكية من خلايا الشعر. إعداد من مجلسين بدلا يحاكي كل من اللمف الجواني ومقصورات المحيط باللمف على التوالي الجانبين قمي والقاعدية من خلايا الشعر. هذه المقصورات معا توفير بيئة من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة لدراسة mechanotransduction من قبل خلايا الشعر.

خصائص الحساسية وتنبيغ من خلايا الشعر تكمن وراء استجابة الكهربائية لالتحفيز الميكانيكي. لتحقيق هذه الميزات، سجلنا في وقت واحد من فرد الشعر الخلية موقف حزمة وإمكانات مستقبلات الخلية (الشكل 2). علينا أولا إرفاق الألياف الزجاجية المرنة لمبة kinociliary من ربطة الشعر لتطبيق نبضات القوة. نحن ثم تقاس التشريد وربطة الشعر باستخدام الضوئي المزدوج نظام ² (الشكل 2A). اكتسبناها في نفس الوقت إمكانية الخلية الشعر من قبل التخوزق الخلية مع مسرى مكروي حاد. حصلنا على منحنى النزوح رد بالتخطيط للاستجابة ذروة الجهد التي تسببها كل التحفيز الميكانيكي من التشريد المقابلة حزمة الشعر (الشكل 2B). رد الكهربائية الخلية الشعر التشبع لكل القيم القصوى positive- والتشريد السلبي. الحد من غشاء المحتملة مع الخطوات النزوح السلبية يدل على وجود يستريح الداخل mechanotransduction الحالية. هو منظم هذا يستريح الحالية بفعل كا ²⁺ على حد سواء السريعة والبطيئة التكيف ^{17، 18، 19، 20، 21.}

يعتمد سلوك خلية الشعر ليس فقط على الخصائص الكهربائية، ولكن أيضا على ميكانيكا دقيقة من حزمة في الشعر الحسية. يقلد التكوين من مجلسين فصل اللمف الجواني وperilymph في الجسم الحي، وتوفير الظروف المثالية لدراسة الميكانيكا ربطة الشعر. في ظل هذه الظروف ومع غشاء الحصيات السمعية إزالتها، يمكن حزم الشعر تتذبذب بشكل عفوي ^6. نحن هنا استخدمت إعداد من مجلسين لتقييم ميكانيكا دقيقة من حزم الفردية. سجلنا التذبذبات عفوية من ربطة الشعر التي تلقي بظلالها على ثنائي الضوئي النزوح رصد (الشكل 3). لتقييم دور أمينوغليكوزيد الجنتاميسين مضاد حيوي على mechanotransduction، نحن rele iontophoretically ASED جنتاميسين مباشرة على ربطة الشعر (الشكل 3). تركيز الجنتاميسين صدر يرتفع بشكل متناسب مع التيار مرت micropipette. جنتاميسين يمنع التذبذبات ربطة الشعر ويدفع ثابت إزاحة حزمة نحو جانبها طويل القامة. وتعكس هذه التأثيرات دور جنتاميسين باعتبارها حاصرات قنوات المفتوحة التي تحافظ على حالة فتح قنوات mechanotransduction في حين تمنع المسام تخلل بهم. الرحلان الشاردي للمواد الكيميائية اتهم تصاريح محلية وإطلاق للقياس الكمي للمواد الكيميائية بتركيزات مختلفة في غياب السائل تعطل الميكانيكية الناجمة عن تدفق وبالتالي مناسبة بشكل مثالي لدراسة العضيات mechanosensitive مثل ربطة الشعر ^22.

دعت حركة عفوية وربطة الشعر من التفاعل بين التكيف وغير الخطية حزمة صلابة ^7،XREF "> 8 ^{و 23 و 24.} هذا الاقتراح العفوية هي التوقيع على عملية نشطة ربطة الشعر، والذي يحول الطاقة إشارة إلى الأعمال الميكانيكية للتغلب على السحب لزج. وقد ثبت حزم الشعر لعرض صلابة لحظية غير الخطية في الدهليزي ² والسمعية ^25، والخط الجانبي أنظمة ^26.

قمنا بقياس مباشرة صلابة لحظية من ربطة الشعر الفردية من كييس الضفدع في (الشكل 4). ولتحقيق ذلك، نحن إلى جانب غيض من الألياف الزجاجية مرنة لمبة kinociliary حزمة الشعر (الشكل 4A). لقد نجينا من القوات الى ربطة الشعر من خلال طرد القاعدة من الألياف و. القوة المبذولة على ربطة الشعر من الألياف التحفيز يناظر الفرق بين تشرد بس الألياف له والحافة، مضروبا تصلب الألياف ^{و2، 27.} تقديم نبضات عبر مجموعة من قوات يكشف عن العلاقة بين القوة المبذولة على حزمة والتشريد التي تلت ذلك حزمة و. المنحدر من هذه العلاقة قوة الإزاحة يتوافق مع ربطة الشعر صلابة لحظية (الشكل 4A).

يسمح هذا الأسلوب لنا لقياس صلابة لحظية لحزمة الفردية بوصفها وظيفة من انحراف في الشكل (4B). يعرض منحنى القوة التشريد لحظية علاقة غير خطية، وكشف عن صلابة غير الخطية من حزمة أكثر من مجموعة من حوالي 20 نانومتر حول موقف يستريح لها. خارج هذا النطاق، وربطة الشعر تتصرف مثل المواد Hookean، وتصلب في خطية عن الانحرافات درجة كبيرة.

demonst هذه النتائجمعدل براعة كييس الضفدع في دراسة علم وظائف الأعضاء خلايا الشعر. باستخدام هذه والاستعدادات الأخرى، يمكن للمرء أن استكشاف mechanotransduction في مراحل متعددة في نقل المعلومات من حزمة نحو الدماغ.

الشكل 1: تشريح الأذن الداخلية على الضفدع ل. (أ) عرض الحنك العلوي الضفدع من جانبها بطني يسمح تحديد النفير (دائرة). التفكير الجانبي من الجلد الذي يغطي الجانب الأيمن من الحنك العلوي يكشف عن مكان وجود الأذن الداخلية (مربع متقطع). (ب) ازالة الغضروف على الجانب البطني من العظم الصدغي الضفدعة يفتح الكبسولة أذني (خط متقطع). (C) عرض هو صورة التكبير أعلى من الكبسولة، التي فيها كييس، الحوقلة، CN الثامن، وكنائس جنوب أفريقيا جزيئية العصبية يمكن التعرف بسهولة. (D) وجهة نظر من الكبسولة بعد إزالة الأعضاء الداخلية الأذن يكشف مواقع القنوات نصف دائري. (E) بعد إزالة الأذن معزولة الداخلية، وكييس، الحوقلة، والثامن العصب القحفي (CN الثامن) ^عشر يمكن بسهولة التعرف عليها. (F) وكييس معزولة يمتلك جذع قصير من العصب الكيسي وغشاء الحصيات السمعية الكذب على قمة ظهارة لها الحسية. تسميات تتوافق مع (ط) كييس، (ب) الحوقلة، (ج) CN الثامن، (د) العصب الكيسي، و (ت) غشاء الحصيات السمعية. محور التسميات P و A تتوافق على التوالي لتوجيهات الخلفي والأمامي. تمثل الحانات مقياس 1 سم (A، B)، 1 ملم (C، D، E)، و 400 ميكرون (F).
الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الصورة "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لتحميل نسخة متجه من هذا الرقم.

الشكل 2: منحنى التشريد والاستجابة للخلية واحدة الشعر. (A) وقد رافق غيض من الألياف الزجاجية التحفيز لمبة kinociliary من ربطة الشعر وقاعدة الألياف في والنازحين في وقت لاحق عبر تسع خطوات منفصلة. وقد تتبع موقف حزمة على نظام ثنائي الضوئي، ويقاس في نفس الوقت إمكانية مستقبله باستخدام مسرى مكروي الذي صدر من خلال مكبر للصوت في وضع جسر الانتاج. وكانت المقاومة طرف القطب 95 MΩ وكانت إمكانات غشاء يستريح حزمة من -47 بالسيارات. (ب) وهناك مؤامرة من إمكانات مستقبلات حزمة باعتبارها وظيفة من النزوح لها يكشف عن علاقة غير خطية بين استجابة حزمة ولموضع. كل نقطة يتوافق مع متوسط ​​المحتملين ويعني تشريد أكثر من نافذة الوقت 2.5 مللي ثانية، ابتداء من 2.5 مللي بعد ظهور التحفيز الميكانيكي. يمثل كل لون مجموعة من السلاسل الزمنية المقابلة لنفس نبض النزوح.
الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرجاء الضغط هنا لتحميل نسخة متجه من هذا الرقم.

الشكل (3): تأثير جنتاميسين على عفوية الشعر حزمة التذبذب. وسجلت حركة عفوية من ربطة الشعر في إعداد من مجلسين باستخدام نظام الضوئي المزدوج. في غياب الإفراج iontophoretic الجنتاميسين (0 غ)، والشعريعرض حزمة التذبذبات متماثل. فيما تتزايد شدة التيار مرت من خلال ماصة iontophoretic مليئة 500 ملي ينمو كبريتات جنتاميسين (10 غ، 20 غ)، وتواتر الرحلات الشعر الرزمة يسقط في الطريقة التي تعتمد على الجرعة ويقابل حزمة نحو حافته طويل القامة لفترة أطول فترات من الزمن.
الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرجاء الضغط هنا لتحميل نسخة متجه من هذا الرقم.

الشكل 4. احتساب حزمة الشعر لحظية صلابة. (أ) والألياف التحفيز (أحمر) من صلابة K _F يقترن رس لمبة kinociliary (البني) من ربطة الشعر الفردية (الصفراء). تهجير قاعدة من الألياف مسافة معروفة X _F يتسبب في حزمة لنقل المسافة X _ب. الفرق بين النزوح من الألياف وحزمة يتناسب مع القوة المبذولة على حزمة من الألياف التحفيز، F _F. تكرار هذا عبر مجموعة من القوات ينتج علاقة قوة النزوح حظية (يمين)، المنحدر الذي يتوافق مع صلابة لحظية حزمة الشعر. (ب) وأخضعت حزمة الفردية لإجبار نبضات من زيادة حجم والتشريد في غضون 50 مللي ثانية الأولى بعد أن تم قياس بداية النبض (نقطة زرقاء). هنا تعرض ربطة الشعر صلابة لحظية غير الخطية على مجموعة من حوالي 20 نانومتر حول موقف يستريح لها. المنحنى الأحمر يتوافق مع نوبة إلى العلاقة F = ك * X - 60 * ض * (1 / (1 + إكسب (- ي * (X - X ₀₎ / (ك _ب * T))) + F _0، حيث F هي القوة المطبقة على حزمة، X هو حزمة من التشرد، ك = 790 ± 51 μN ∙ م ^-1 هو حزمة وثابت صلابة عند كل القنوات إما مغلقة أو مفتوحة، ض = 0.43 ± 0.04 السندات الإذنية هو قوة الربيع النابضة واحد، X ₀ = 2 ± 1.9 نانومتر هو موقف حزمة والتي 50٪ من قنواتها مفتوحة، ك _باء بولتزمان ثابت، T هي درجة الحرارة، وF ₀ = 11.7 ± 1.3 السندات الإذنية هو قوة الإزاحة. تناسب يمتلك معامل التحديد 0.98. كان الألياف التحفيز صلابة من 107 μN ∙ م ^-1.
الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وفاق / ftp_upload / 55380 / Figure4_v5.eps "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لتحميل نسخة متجه من هذا الرقم.

المذاب	صيغة وزن (ز / مول)	أضف إلى 1 L
		perilymph الاصطناعي	اللمف الجواني الاصطناعي
كلوريد الصوديوم	58.4	6.54 ز	0.117 غرام
بوكل	0.149	0.149 غرام	8.62 ز
CaCl 2 ⦁ 2H 2 O	147	2 مل من 1 الأسهم M CaCl 2	250 ميكرولتر من 1 الأسهم M CaCl 2
HEPES	238.3	1.19 ز	1.19 ز
د - (+) - الجلوكوز	180.2	0.541 غرام	0. 541 غرام

الجدول 1. حلول للتشريح وإعداد التجريبية. عرض في هذا الجدول هي صفات لperilymph الاصطناعي والحلول اللمف الجواني الاصطناعية المستخدمة في تشريح وفي الاستعدادات واحد أو اثنين من الغرفة. وينبغي تقديم الحلول لدرجة الحموضة 7،2-7،4 مع حوالي 2 مل من هيدروكسيد الصوديوم (perilymph) أو 2 مل KOH (اللمف الجواني). قوة ناضح يجب قراءة ما يقرب من 230 مليمول · كجم ^-1 بسبب التفكك الأيونية غير مكتملة.

Discussion

ضمن كييس الضفدع وتقع عدة آلاف من خلايا الشعر الحسية يسهل الوصول إليها. نحن هنا لشرح استخراج وإعداد كييس للتسجيلات واحدة واثنين من الغرفة. تسمح هذه الاستعدادات اثنين من كلتا الدراستين الميكرو ميكانيكية والكهربية للخلايا الشعر وحزم المرتبطة بها. لأن الأنسجة يمكن البقاء على قيد الحياة لعدة ساعات مع استبدال متكررة من المياه المالحة غنية بالأوكسجين، قد تستمر التجارب لفترات طويلة. تبقى خلايا الشعر في هذه الاستعدادات عادة قابلا للتطبيق لتسجيل مسرى مكروي لمدة تصل إلى 6 ساعات بعد تشريح، بينما تتأرجح حزم الشعر بشكل عفوي لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد الاستخراج.

استخراج ناجحة وتصاعد للكييس يتوقف على التغلب العديد من التحديات المشتركة. أولا، على اتصال مباشر مع السطح القمي من البقعة الكييس ينبغي تجنبها في جميع أنحاء الداخلي الإعداد. يوفر العصب الكيسي مقبض مريح لmanipu آمنlation من كييس. مرة واحدة الافراج عن بقية الأجهزة الداخلية الأذن، ينبغي نقل كييس باستخدام ماصة الجوف كبير في حين تبقى مغمورة في السوائل لتجنب الأضرار الميكانيكية لظهارة لها الحسية. يجب أن تكتمل إزالة غبار الأذن من سطح البقعة الصفراء دون الأضرار الميكانيكية للخلايا الشعر. لأن غبار الأذن تكمن مباشرة فوق البقعة، وخلايا الشعر يمكن أن تتضرر من جراء الاتصال العرضي بين أدوات تشريح وغشاء الحصيات السمعية أثناء إزالة غبار الأذن. لتجنب الضرر، ونحن نوصي بأن كتلة هلامية من غبار الأذن سيعقد في مكان بعيد عن البقعة وإزالتها ككتلة واحدة. هذا يتجنب تفتيت الكتلة otoconial إلى العديد من مجموعات، كل ذلك من شأنه أن يكون استخراجه بشكل فردي. إذا بقيت مجموعات صغيرة من غبار الأذن ويمكن إزالتها مع ضغط السائل لطيف بايدي ماصة باستور. ينطوي على التحدي الأخير تشكيل ختم ضيق بين ساحة كييس والألومنيوم تصاعد فيإعداد من مجلسين. توظيف مربع مع ثقب صغير بما يكفي للسماح للتداخل من حوالي 100 ميكرون بين كييس والمحيطة تصاريح الألومنيوم ختم كاملة من الأنسجة. وينبغي تقديم الغراء في اتصال مع ما يقرب من 100 ميكرون من الأنسجة الكييس حول محيط البقعة من أجل تشكيل ختم مشددة.

تركيز الكالسيوم الحرة ²⁺ اعتبار مهم في دراسة خلايا الشعر. كاليفورنيا ²⁺ ينظم التكيف السريع والبطيء على حد سواء، وبالتالي تحديد حركية الجهاز mechanotransduction وخصائص الظواهر عملية نشطة وربطة الشعر، بما في ذلك عفوية حزمة الحركة ^{8، 23.} الكالسيوم اللمفي الباطن في الجسم الحي موجود في 250 ميكرومتر، وبالتالي يتم تقييم حركية أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية في هذا التركيز (مونسيل JHR، R. جاكوبس، وAJ Hudspeth. Unpublisالملاحظات هيد ^16). ومع ذلك، تسجيلات مسرى مكروي من خلايا الشعر تتطلب تركيز الكالسيوم الخارجي تتجاوز 2 ملم لختم السليم للغشاء الخلوي حول مسرى مكروي. ولذلك فمن الضروري استخدام المياه المالحة عالية من الكالسيوم لهذه التجارب. وأخيرا، قد يرغب المرء لدراسة آثار الكالسيوم الخارجي على mechanotransduction باستخدام مجموعة متنوعة من تركيزات الكالسيوم. في هذه الحالات، من المهم أن نتذكر أن تركيزات الكالسيوم أقل من 1 ميكرومتر وعادة ما يؤدي إلى تمزق الارتباط طرف وخسارة لا رجعة فيها تنبيغ ^28.

الاستعدادات التجريبية المذكورين هنا تسمح لمجموعة من القياسات الفيزيائية الحيوية في خلايا الشعر. ومع ذلك، قياسات إضافية يمكن إجراء تعديلات طفيفة على هذه الاستعدادات. في إعداد الكيسي مطوية، وتصور حزم الشعر أفقيا. التصوير الشعر حزمة الحركة من هذا المنطلق تكشف يذكره متماسكايون على المديين القصير وطويل القامة أهداب ساكنة ^29. هنا يتم فصل البقعة الكييس أول من الأنسجة الكامنة ومطوية في وقت لاحق على طول محور يحددها العصب الكيسي بحيث حزم الشعر تواجه الخارج وتصور أفقيا في تجعد. والتعديل الثاني، تفكك خلايا الشعر، ويمكن دراسة كل من حزمة الخلية الشعر وسوما لها. وفصل خلايا الشعر ميكانيكيا على شريحة زجاجية للتصوير والكهربية تسجيل ^30. وأخيرا، خلايا الشعر يمكن مقذوف من ظهارة باتباع بروتوكول تفكك مماثلة ولكن من دون خطوة التفكك الميكانيكية. هذه النتائج العلاج في خلايا الشعر الذي قذف تدريجيا من ظهارة، وتوفير الوصول basolateral عن التسجيلات الكهربية وتقليل الأضرار الميكانيكية. هذه الاستعدادات والعديد من التعديلات التي تدل على براعة كييس الضفدع كنظام نموذج لفيزيائيةدراسة خلايا الشعر الحسية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Common to both preparations
Stereo-dissection microscope	Leica	MZ6	Other sources can be used
Tricaine methanesulfonate	Sigma	E10521	Other sources can be used
Metal pithing rod	Fine Science Tools	10140-01
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20
Glass Pasteur pipette and bulb (x2)	Fisher Scientific	22-042816
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle	Fisher Scientific	22-557-172
Dow-corning vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5C
Syringe for vacuum grease	Fisher Scientific	14-829-45	Other sources can be used
35 mm Petri dish (x2 - 3)	Fisher Scientific	08-772A	Other sources can be used
Micropipette puller	Sutter	P-97 or P-2000
120 V Solenoid puller			Home-made, see parts list
Sputter coater	Anatech USA	Hummer 6.2
Current source for iontophoresis	Axon Instruments	AxoClamp 2B	Other sources can be used
Piezoelectric actuator	Piezosystem Jena	P-150-00
Amplifier for piezoelectric actuator	Piezosystem Jena	ENV800
Borosilicate glass capillary	World Precision Instruments	1B120F-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
For one-chamber preparation
Microelectrode amplifier	Axon Instruments	AxoClamp 2B	Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously
Magnetic pins (x2)			Home-made, see parts list
Open-top chamber with magnetic sheet			Home-made, see parts list
Name	Company	Catalog Number	Comments
For two-chamber preparation
Upper chamber			Supplementary file 1
Troughed lower chamber			Supplementary file 2
Aluminum foil	Fisher Scientific	01-213-100	Other sources can be used
Mounting block			Supplementary file 3
Wooden applicator sticks	Fisher Scientific	23-400-112	Other sources can be used
Teflon sheet	McMaster-Carr	8545K12	For teflon applicator
Cyanoacrylate glue	3M	1469SB
Lab tissues (Kimwipes)	Fisher Scientific	06-666A	Other sources can be used
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G1914	Other sources can be used
Quick-setting epoxy	McMaster-Carr	7605A18
18 mm glass coverslips	Fisher Scientific	12-546	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline components
NaCl	Fisher Scientific	S271-3	Other sources can be used
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G	Other sources can be used
CaCl2 • 2H2O	Fisher Scientific	10035-04-8	Other sources can be used
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	Other sources can be used
D-(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G7021	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments/Description
Parts lists for home-made equipment
Solenoid puller
Solenoid	Guardian Electric	A420-065426-00	Other sources can be used
Foot-pedal switch	Linemaster	T-51-SC36	Other sources can be used
Pipette holder	World Precision Instruments	MEH900R	Other sources can be used
Coarse manipulator	Narishige Group	MM-3	Other sources can be used
Platinum wire	Alfa Aesar	25093	Other sources can be used
Power supply	Leica	Z050-261	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments/Description
Magnetic pins
Epoxy	McMaster-Carr	7556A33	Other sources can be used
1 mm thickness aluminum	McMaster-Carr	89015K45	Other sources can be used
Insect pins	Fine Science Tools	26000-40	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments/Description
Open-top magnetic chamber
Flexible magnetic strip	McMaster-Carr	5759K75	Other sources can be used
1 mm thickness aluminum	McMaster-Carr	89015K45	Other sources can be used