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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Zelluläre Seneszenz, der irreversible Zustand der Zellzyklusarrest, kann durch verschiedene Zellspannungen induziert werden. Hier beschreiben wir Protokolle zelluläre Seneszenz und Methoden zu induzieren Marker für Seneszenz zu beurteilen.

Zusammenfassung

In Reaktion auf zellulärem Stress oder Schädigung, proliferierenden Zellen kann ein spezifisches Programm induzieren, die einen Zustand der Langzeit-Zellzyklusarrest einleitet, zelluläre Seneszenz bezeichnet. Akkumulation von seneszenten Zellen erfolgt mit organismal Altern und durch kontinuierliche Kultivierung in vitro. Seneszenten Zellen beeinflussen zahlreiche biologische Prozesse, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Gewebereparatur und -regeneration, Tumorunterdrückung und Alterung. Kennzeichnend für seneszenten Zellen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Aktivität (SA-β-gal); p16 INK4A, p53, p21 und Ebene; höhere Niveaus von DNA-Schäden, einschließlich γ-H2AX; die Bildung der Seneszenz-assoziierte Heterochromatin Foci (SAHF); und der Erwerb eines Seneszenz-assoziierte Sekretorische Phenotype (PUSA), ein Phänomen, das durch die Sekretion einer Anzahl von pro-inflammatorischen Cytokinen und Signalmolekülen charakterisiert. Hier beschreiben wir Protokolle sowohl für replikativen undDNA Seneszenz in kultivierten Zellen-Schädigung induziert. Außerdem markieren Techniken, die wir den seneszenten Phänotyp mit mehreren Seneszenz-assoziierte Marker, einschließlich SA-β-gal, γ-H2AX und SAHF Färbung und zu quantifizieren Protein und mRNA-Spiegel von Zellzyklusregulatoren und SASP Faktoren zu überwachen. Diese Methoden können zur Beurteilung der Seneszenz in verschiedenen Modellen und Geweben angewandt werden.

Einleitung

Mehr als vor einem halben Jahrhundert, Hayflick und Kollegen beschrieben , wie nicht - transformierten Zellen in Kultur vermehren, aber nur für einen begrenzten Zeitraum 1. Langzeitkultivierung von humanen Fibroblasten verursacht die Zellen vermehren zu stoppen; jedoch waren sie metabolisch aktiv, und wurde dieser zelluläre Seneszenz bezeichnet. Seneszenz können zur Hemmung der Tumorgenese von Vorteil sein, sie kann aber auch nachteilig sein, wie es angenommen wird , auf den Verlust der Regenerationsfähigkeit beizutragen , die mit dem Altern auftritt , 2, 3. Seneszenten Zellen wurden in Geweben akkumulieren gezeigt , wie Menschen im Alter von 4 und in einer Reihe von biologischen Prozessen, einschließlich der Embryonalentwicklung, Wundheilung, Gewebereparatur und altersbedingte Entzündung 2 in Verbindung gebracht.

Kontinuierliche Passagierung der Zellen in Kultur induziert replikative Seneszenz, die in Verbindung gebracht wurdezu der Telomere Abrieb und genomische Instabilität. Verschiedene Zellspannungen, einschließlich DNA - Schädigung und Onkogenen, können auch Seneszenz 3 verursachen. Seneszenz verursacht durch andere Faktoren als Telomer Abrieb wird oft spannungsinduzierte oder vorzeitige Seneszenz bezeichnet und hängt im Allgemeinen von der p16 INK4A / Rb - Weg 5. Obwohl proliferierenden, typischerweise nicht - transformierten Zellen spindelförmig erscheinen, können seneszenten Zellen mit bestimmten Merkmalen identifiziert werden, einschließlich einer flache, große Morphologie und erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase - Aktivität (SA-β-gal) (Abbildungen 1 und 2). Seneszenten Zellen akkumulieren auch DNA - Schädigung Marker, einschließlich γ-H2AX (Abbildung 3) 6, und möglicherweise Seneszenz-assoziierte Heterochromatin Foci (SAHF) (4) 7. Seneszenten Zellen höhere Zellzyklusregulatoren, einschließlich p 16 (p16 INK4A) und / oder p21 und p53 (Figur 5) 8, 9. Darüber hinaus haben jüngste Daten gezeigt , dass seneszenten Zellen nicht autonome Wirkungen durch eine Reihe von pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen sezer die Seneszenz-assoziierte sekretorischen Phänotyp (SASP) 10 genannt haben. Obwohl dieses Phänomen SASP von Zelltyp zu Zelltyp, im allgemeinen unterschiedlich sein kann, ist es durch eine Erhöhung der Interleukin-6 (IL-6), IL-8, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) gezeigt, wachstums- regulierter Onkogen α (GRO-α) und GRO-β, unter anderem (Abbildung 6). Die besondere Beanspruchung oder Schäden , die Seneszenz induziert können auch Einfluss auf die sekretorischen Phänotyp 11, 12, 13. SASP kann durch Messung der Mengen an sezernierten Proteinen unter Verwendung von ELISAs oder Zytokin / Protein-Arrays detektiert werdens = "xref"> 10, 14. Obwohl posttranskriptionale Mechanismen können SASP Proteinspiegel 11 regulieren, 15, 16, 17, Veränderungen in der mRNA - Spiegel können auch in vielen Fällen nachgewiesen werden. Diese Änderungen sind in der Regel empfindlicher und leichter zu quantifizieren als Proteinebene Messungen. Andere seneszenten Marker können auch beurteilt werden, einschließlich DNA - Schädigung persistent Kern Foci, genannt DNA - Segmente mit Chromatin Veränderungen Verstärkungs Seneszenz (DNA-SCARS) 18, und verschiedene andere Marker 3, 19, 20.

Hier beschreiben wir gemeinsame Techniken für die Seneszenz in Zellen in Kultur zu induzieren und auch für mehrere Marker die Seneszenz zu messen, einschließlich SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, und das Protein und mRNA von alternNOA-assoziierte Moleküle.

Protokoll

1. Inducing replikative Seneszenz

  1. Auftau - low-Passage humane diploide Fibroblasten (zB, WI-38 und IMR-90) oder ein anderes Zelllinie.
    HINWEIS: Hier menschliche diploide Fibroblasten wurden verwendet, aber diese Protokolle können verwendet werden, Seneszenz in anderen Zelltypen, wie Endothel, Epithel oder mesenchymalen Stammzellen zu bewerten. Kultivierungsbedingungen können für die verschiedenen Zelltypen verwendet, aufgrund der unterschiedlichen Wachstumsraten oder Wachstumsbedingungen optimiert werden.
    HINWEIS: Die Zellen sollten eine Spindel Morphologie sein wuchernden und haben (siehe Abbildung 1 für eine schematische und 2 für Beispiele). Idealerweise sollten die Zellen haben eine Populationsverdopplungs Ebene (PDL) von <30 zu Beginn der Versuche mit möglichen replikativen seneszenten Zellen zu vermeiden.
    1. Berechnen Sie die PDL der Zellen unter Verwendung der folgenden Gleichung PDL = log (N f / N 0) / log2, wobei N f die endgültige Zellzahl und N 0 die anfängliche Anzahl der ausgesäten Zellen 21.
  2. Kultur WI-38-Zellen in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalen Rinderserum (FBS), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren und 1% Penicillin / Streptomycin.
  3. Wachsen IMR-90-Zellen in DMEM, supplementiert mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin.
  4. Wachsen alle Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 Kontinuierlich die Zellen wachsen und teilen alle 2 bis 4 d , wenn die Zellen erreichen ~ 70-80% Konfluenz. Überwachen Sie Zellkonfluenz mit einem Lichtmikroskop. Vermeiden Sie Zellen mit höherer Einmündung, da dies durch das Zellwachstum beeinflussen kann Hemmung kontaktieren.
  5. Überwachen der Zellen unter einem Lichtmikroskop für die morphologische Erscheinungsbild von seneszenten Zellen (siehe Abbildungen 1 und 2) und für die, wenn es keine Änderung in der PDL von einer Subkultur auf den nächsten ist.

2. DNA-Damage-induzierte Seneszenz

  1. Platte Zellen (zB WI-38, IMR-90, oder eine andere Typ - Zelle) bei einer sparse Dichte (dh ~ 300.000 Zellen / 6 cm Schale) in einer geeigneten Schal für die Art der Analyse (dh eine 6 cm - Schale für das Protein / RNA-Marker oder eine 6-Well-Platte für die SA-β-gal-Färbung). Früh Passage Zellen verwenden, die jung sind und wuchernden (<30 PDL) und die Platte sie so, dass die Zellen etwa 50 sind - 60% konfluent am nächsten Tag.
  2. Entfernen des Wachstumsmediums mit einer Glaspipette mit einem Vakuum verbunden und unter Verwendung von waschen die Zellen durch Zugabe von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wäschen. Fügen Sie eine dünne Schicht aus PBS (~ 750 & mgr; L für eine 6 cm Schale) sowohl für eine „mock“ behandelt und einer ionisierenden Strahlung (IR) behandelten Zustand.
  3. Verwenden eines Gamma-Bestrahler Zellen auf eine einzige Dosis von 10 Gray (Gy) von IR zu exponieren; dies ist eine typische Belichtung für die meisten Zelllinien. In einer Haube, entfernen Sie den PBS und ersetzen sie durch Wachstumsmedium. Alternativ behandeln die Zellen mit bleomycin bei 20 & mgr; g / ml für 2 Stunden.
  4. Ändern Sie das Medium auf den alle 48 -7 2 ​​h Zellen und teilen Sie die Zellen, wenn nötig.
  5. Überwachen Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop auf morphologische Veränderungen (siehe Abbildung 1 eine schematische und Figur 2 für repräsentative Zellbildern) und Assay für seneszenten Marker 7 bis 10 d nach der IR - Behandlung.
    Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt IR-induzierte Seneszenz. Seneszenz kann auch durch andere Spannungen induziert werden, einschließlich Bleomycin (siehe oben für Bedingungen), H 2 O 2 22, 23, 24 chemotherapeutischen Arzneimitteln, Zigarettenrauch 25, transformierendem Wachstumsfaktor (TGF) -β1 26, 27, 21 und andere Methoden , 28, 29.

3. Die Färbung Cells für Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase

  1. Vor der Färbung, untersuchen Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop der morphologischen Veränderungen zu überwachen.
    HINWEIS: alternde Zellen werden typischerweise vergrößert und flach ist , im Gegensatz zu proliferierenden Zellen, die eine Spindel Morphologie aufweisen (siehe Abbildung 1 für eine schematische und Figur 2 für repräsentative Ergebnisse). Proliferierenden Zellen können als negative Kontrolle verwendet werden, und mit IR oder einem anderen DNA-schädigende Mitteln behandelten Zellen (siehe Abschnitt 2) als positive Kontrollen verwendet werden.
  2. Quantifizieren SA-β-gal Aktivität Reagenzien von einem kommerziellen Kits (siehe Werkstoff - Tabelle). Tauen Sie alle Reagenzien und bringen sie durch Erwärmen sie auf Raumtemperatur bis 37 ° C.
    1. Berechnen Sie die Menge der Färbelösung und Fixierungslösung notwendig.
      HINWEIS: In der Regel wird ein 1 ml-Volumen ist ausreichend, um für eine Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen. Verschiedene Plattengrößen können verwendet werden, aber eine 6-Well-Platte Größe ist well geeignet einen Assay in dreifacher Ausfertigung für jede Bedingung durchzuführen. Diese Dichte stellt in der Regel eine ausreichende Anzahl von Zellen pro Feld, ohne eine übermäßige Anzahl von Zellen zu zählen.
    2. Verdünnen Sie die Färbelösung 1:10 mit destilliertem Wasser.
    3. Verdünnen Sie die Fixierungslösung 1:10 mit destilliertem Wasser.
    4. Make a 20x Stammlösung von X-gal bis (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) in N, N-Dimethylformamid (DMF, zB 20 mg X-gal in 1 ml DMF). Um die Verwendung des Kits, auszumessen X-gal auf die Menge für jeden Assay benötigt und fügen Sie dann die berechnete Menge an DMF zu maximieren aufzulösen. Alternativ speichert die Stammlösung bei -20 ° C in einem lichtgeschützten Rohr für einen Monat. Nur Polypropylen (opaque) Rohre zum Verdünnen und X-gal Lösungen speichern.
    5. Bereiten β-gal-Färbelösung: 930 & mgr; l 1x Färbelösung werden 10 ul Anfärbung Supplement A, 10 & mgr; l der Anfärbung Ergänzung B, und 50 ul 20 mg / ml X-Gal in DMF. Machen Sie einen Master-Mix je nachdem, wie viele Brunnen müssen gefärbt werden.
  3. Entfernen Sie vorsichtig das Medium von den Zellen, die eine Transferpipette oder das Äquivalent verwendet wird.
  4. Die Zellen vorsichtig wäscht einmal mit Raumtemperatur 1x PBS.
  5. 1 ml 1x Fixierungslösung in jede Vertiefung und Inkubation für 10 bis 15 min bei RT.
  6. Entfernen Sie die Fixierungslösung mit einer Transferpipette.
    HINWEIS: Die Fixierungslösung (1x) enthält 2% Formaldehyd und 0,2% Glutaraldehyd und sollte als Sondermüll entsorgt werden entsprechend den Empfehlungen der Laborsicherheit Büro.
  7. Die Zellen vorsichtig wäscht zweimal mit 1x PBS.
  8. Entfernen Sie die PBS vollständig und hinzufügen 1x β-gal Färbelösung in die Vertiefungen (1 ml / Well einer 6-Well-Platte). Bedecken die Platte vollständig mit Aluminiumfolie und Inkubation für 24 bis 48 h in einem 37 ° C - Inkubator (vorzugsweise in Abwesenheit von CO 2, da dies den pH - Wert des Puffers senken kann und beeinflussen Färbung).
    1. Überprüfen Sie die Zellen bei 24 h für die Färbung, und wenn der Fleck zu hell ist, Inkubation für weitere 24 Stunden.
  9. Nach der Inkubationszeit, entfernen Sie die β-gal-Lösung und ersetzen sie durch 1x PBS.
    HINWEIS: Dieser Schritt entfernt einen Teil der Hintergrundfarbe bei der Abbildung und verhindert auch gefährliche Vergießen der X-gal-Lösung.
    HINWEIS: Entsorgen Sie das β-gal-Lösung richtig, entsprechend den Empfehlungen des Sicherheitslabor Büro.
  10. Untersuchen der Zellen auf einem Lichtmikroskop mit einer daran befestigten Kamera eines 10-fach oder höher Ziel verwendet wird; SA-β-gal-positive Zellen werden blau sein. Erwerben Sie die gewünschte Anzahl der Bilder für das Experiment. Wenn der Anteil der SA-β-gal-positive Zellen zu zählen, pro Vertiefung der entsprechende Anzahl der Bilder (> 5) für die Quantifizierung erwerben. Stellen Sie sicher, dass die Bilder aus verschiedenen Blickfeldern innerhalb jeder Vertiefung nicht überlappend sind.
  11. Zähle die Anzahl der SA-β-gal-positiven (blauen) Zellen im Vergleich zu der Anzahl der gesamten Zellenden Prozentsatz der SA-β-gal-positive Zellen zu berechnen. Count> 100 Zellen pro Bedingung.
    HINWEIS: Repräsentative Bilder können auch für Zahlen verwendet werden. Beachten Sie, dass Zellkonfluenz wenn Zählen der Zellen entscheidend ist, da zu viele Zellen es schwierig machen, jede Zelle zu differenzieren und zu wenig kann nicht eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Quantifizierung und Statistiken geben. Bilder Zahlen für die Veröffentlichung sind bei der besten Auflösung, wenn sie als TIFF-Dateien gespeichert, obwohl Jpeg-Dateien geeignet sind. Farbbilder sollten 300 dpi sein.

4. Anfärben der Zellen für γ-H2AX

  1. Platte, die die Zellen, die aus den Abschnitten 1 oder 2 auf Glasdeckgläschen in einer 24-Well-Platte.
  2. Am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen mit 1x PBS. Spülen Sie sorgfältig, wie seneszenten Zellen haften nicht gut auf Deckgläser und leicht während der Wäschen entfernt werden kann. Alternativ fixiert die Zellen direkt ohne Waschen.
  3. Entfernen Sie die PBS und fixieren die Zellen mit frisch zubereiteten 3,7% Formaldehyd in PBS für10 min bei RT.
  4. Entfernen der Lösung und Permeabilisierung der Zellen mit 0,2% Triton X-100 in PBS für 10 min.
  5. Entfernen der Lösung und in Block 5% FBS in PBS für 2 h bei RT.
  6. Inkubieren mit Anti-Phospho γ-H2AX (Ser139) und FITC-Konjugat in 5% FBS / PBS für 2 h bei 37 ° C oder O / N bei 4 ° C. Vor Licht schützen.
  7. Waschen 3 - 6x mit PBS bei 37 ° C für insgesamt 30 - 60 min.
  8. Fleck mit DAPI (verdünnt 1: 15.000 in PBS) für 10 min bei RT.
  9. Waschen 3x mit PBS.
  10. Schnell mit Wasser waschen, die Salz und montieren das Deckglas auf einem Glasobjektträger unter Verwendung von 3 zu entfernen, - 5 & mgr; L Antifade-Reagens. Alternativ dazu verwenden, um eine Befestigungslösung DAPI enthält.
  11. Trocknen lassen O / N und visualisieren die gefärbten Zellen auf einem Fluoreszenzmikroskop oder ein konfokales 63X oder höher Ziel verwenden.
  12. Quantifizierung der γ-H2AX Foci durch ein von zwei Verfahren nachstehend beschrieben werden. Ergebnis für beiden Protokolle mit dem Auge eines Fluoreszenzmikroskop. Idealerweise unsea Konfokalmikroskop. Nehmen Z-Abschnitte und kondensieren in einer einzigen Ebene , um alle nachweisbaren Foci sichtbar zu machen (repräsentative Bilder für γ-H2AX Färbung in proliferierenden und seneszenten Zellen werden in 3 gezeigt). Zählen Sie die Foci durch das Auge unter Verwendung von Bildbearbeitungssoftware; in der Regel ~ 100-200 Kerne sind zum Zählen ausreichend.
    1. Um den Prozentsatz der Zellen zu quantifizieren, die γ-H2AX-positive Foci haben, zählen jede Zelle, die mindestens einen Fokus sichtbar und Dividieren durch die Gesamtzahl der DAPI-gefärbten Zellkernen aufweist.
    2. Um die Anzahl der γ-H2AX Foci zu quantifizieren, zählen die γ-H2AX Foci pro Zelle.
      HINWEIS: Die Pegel des γ-H2AX auf den spezifischen Stressoren oder Schäden variieren, die Seneszenz induziert.

5. Anfärben der Zellen für SAHF Marker

HINWEIS: Human seneszenten Zellen werden oft Kernregionen kondensierten DNA / Chromatin haben. In seneszenten Zellen, wobei diese heterochromatischen Regionensind gedacht, um die Expression von proliferationsfördernde Gene, wie E2F Familienmitglieder zu hemmen. SAHF kann durch die Reorganisation von DAPI sichtbar gemacht werden; durch die Anwesenheit von Heterochromatin-assoziierte Histonmarkierungen, einschließlich der Di- und Tri-Methylierung von Lys9 auf Histon H3 (H3K9Me2 und H3K9me3); und durch Chromatin-Reorganisation Proteine, einschließlich HP1 heterochromatin protein 1 (HP1), HIRA (Histon - Repressor - A), und ASF1a (anti-Silencing - Funktion-1a) an dem Chromatin 30. Wir haben uns entschieden ein Onkogen-induzierte Seneszenz - Modell (OIS) zu verwenden, wie SAHF prominenteren in OIS Modelle 30 ist. IDH4 Zellen proliferieren in Gegenwart von Dexamethason aufgrund der Anwesenheit von SV40 large T - Antigen , aber nach der Entfernung von Dexamethason aus dem Medium 31 seneszenten werden. SAHF kann oben aufgeführten, mit Antikörpern gegen den spezifischen Marker durch DAPI-Färbung und durch Färben nachgewiesen werden. Hier haben wir DAPI und H3K9Me2 Färbung für die visualizat beschreibenIon SAHF in Zellen 28.

  1. Wachsen IDH4 Zellen in DMEM mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 1 ug / ml Dexamethason. Seneszenz zu induzieren, entfernen Sie das Dexamethason und das Medium ändern, so dass es charcoal-stripped FBS enthält; nach wächst für ~ 10 Tage in diesem neuen Medium, werden IDH4 Zellen seneszenten 31.
  2. Platte IDH4 Zellen oder Zellen, die von den Abschnitten 1 oder 2, wie oben beschrieben, auf Glasdeckgläschen in einer 24-Well-Platte.
  3. Am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen mit 1x PBS. Spülen Sie sorgfältig, wie seneszenten Zellen haften nicht gut auf Deckgläser und leicht während Waschungen entfernt werden können. Alternativ direkt fixieren Zellen ohne Waschen.
  4. Entfernen Sie die PBS und fixieren die Zellen mit frisch zubereiteten 3,7% Formaldehyd in PBS für 10 min bei RT.
  5. Waschen Sie die Zellen 3-mal mit 1x PBS.
  6. Entfernen der Lösung und Permeabilisierung der Zellen mit 0,2% Triton X-100 in PBS für 5 min.
  7. Waschen Sie die Zellen mit 1xPBS. Entfernen Sie die PBS und blockieren die Deckgläser durch Zugabe von Blockierungspuffer enthaltend 3% BSA (w / v) in PBS für 5 min bei RT. Immer Filterlösungen, enthaltend BSA vor der Verwendung Feststoffteilchen zu entfernen.
  8. Entfernen des Blockierungspuffers und Inkubieren der Zellen mit primären Antikörpern gegen SAHF Marker wie anti-H3KMe2 Antikörper (Abbildung 4, der Werkstoffe Tabelle für Details). Verdünnen Sie die Antikörper in Blocking-Puffer und Inkubation für 1 bis 2 h bei RT.
  9. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und wäscht die Deckgläser 3 mal mit 1% (v / v) Triton X-100 in PBS.
  10. Verdünne die sekundären Antikörper in Blockierungspuffer (Material Table) und Inkubation für 1 h bei RT. Vor Licht schützen.
  11. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS. 10 min bei RT;: Fleck mit DAPI (15.000 in PBS siehe Tabelle 1 Materialien verdünnt).
  12. Waschen Sie die Deckgläser mit 1x PBS 3x.
    1. Schnell mit Wasser wäscht die Salze entfernen einnd montiert jedes Deckglas auf einem Glasobjektträger unter Verwendung von 3 bis 5 & mgr; L Antifade-Reagens. Alternativ dazu verwenden, um eine Befestigungslösung DAPI enthält.
    2. Trocknen lassen O / N und visualisieren die gefärbten Zellen auf einem Fluoreszenzmikroskop oder ein konfokales 63X oder höher Ziel (siehe die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 4). Quantifizierung der SAHF wie in Abschnitt 4 beschrieben.
      HINWEIS: Isotypkontrollreagenzien primäre Antikörper oder kein primärer Antikörper (dh sekundäre allein) sollte als eine negative Kontrolle für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden.

6. Analysieren von Seneszenz-assoziierte Proteine ​​durch Immunoblotting

HINWEIS: Der seneszenten Phänotyp wird durch die Hochregulation von Zellzyklusregulatoren charakterisiert, einschließlich p16 INK4A, p21 und p53. Dieses Protokoll wird die Quantifizierung der Mengen dieser Proteine ​​in Zelllysaten beschreiben. Diese Techniken können verwendet werden, Seneszenz zu beurteilen induziert mit einer Vielzahl vonVerfahren 21, 28, 29.

  1. Induzieren zelluläre Seneszenz , wie beschrieben in den Abschnitten 1 und 2 oder durch Verwendung eines anderen Verfahrens 21, 28, 29. Zur Analyse zellulärer Seneszenz Marker, um die Zellen in 6 cm-Schalen Platte und sowohl das Protein analysieren und die RNA gleichzeitig (Abschnitt 7 zur RNA-Isolierung Anleitung).
  2. Entfernen Sie das Zellkulturmedium. Legen Sie die Zellen auf einem Tablett aus Eis.
    1. Waschen Sie die Zellen 2 mal mit kaltem 1x PBS. Kippen Sie das Gericht, um sicherzustellen, dass das gesamte PBS abgesaugt wird, um so präzise in Bezug auf die Mengen für das Verfahren verwendet werden.
    2. Nach der letzten Waschung PBS Aspirieren, 200 & mgr; L kaltem PBS 1x (für eine 6 cm Schale) in die Schale. Schaben die Zellen eine Zellschaber.
    3. Pipette, um die Zellen / PBS-Mischung in ein RNase-freien Röhrchen für die RNA-Isolierung. Nehmen Sie etwa 150 &# 181; l dieser Mischung und Pipette in ein neues Röhrchen. Diese Aliquot wird für die Proteinanalyse verwendet werden, so sicher sein, um die gleiche Menge von jedem Röhrchen pipettieren.
  3. Lyse der Zellen durch Zugabe von 75 bis 100 & mgr; l von modifizierten 2x Laemmli Probenpuffer (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 12,5% Glycerin, 2% SDS, 5% β-Mercaptoethanol (BME) und Bromphenolblau, kann als nachgeholt werden eine große Charge, aliquotiert und bei -20 ° C bis zur Verwendung) oder einen äquivalenten Probenpuffer gespeichert.
    1. Alternativ lysieren die Zellen in 75 bis 100 & mgr; l Lysepuffer und Zentrifuge bei 15.000 xg für 10 min bei 4 ° C, um die Zelltrümmer zu entfernen. Entfernen Sie den Überstand und Pipette in ein sauberes Röhrchen. Ein Bradford-Protein-Assay oder ein äquivalentes Protein Assay kann auf Lysaten verwendet werden, um die gleiche Beladung des Proteins zu gewährleisten.
      HINWEIS: Protein-Assays kann nicht an Proben durchgeführt werden, in Probenpuffer lysiert.
    2. Nehmen Sie ~ 25 & mgr; l Lysat und fügen Sie es zu 15 & mgr; l 2x Probenpuffer. Pipettieren und tunwn im Probenpuffer, um die Zellen zu lysieren.
      HINWEIS: Die Volumina Lysepuffer oder Probenpuffer eingestellt werden kann, je nach Zellkonfluenz. Wenn die Probe „gooey“ durch Kern Lysiereinrichtung ist, mehr Probenpuffer oder PBS hinzufügen zu verdünnen. Die Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
  4. Koche die Proben für 5 min bei 95 ° C auf einem Heizblock (oder äquivalente Ausrüstung) und Last ~ 40 ul lysierter Probe in Probenpuffer auf einem 18% Tris-Glycine Gel.
    HINWEIS: Ein Gradientengel (4-15%) oder ein 14% Tris-Glycine Gel auch ausreichend für die niedermolekularen Proteine ​​zu detektieren. Verschiedene Arten von Acrylamidgelen können auch verwendet werden, aber dafür sorgen, dass die Gele und System sind ausreichend für niedermolekulare Proteine ​​zu detektieren.
    1. Führen 1x Laufpuffer unter Verwendung von mit einem konstanten 100 V für 20 min (durch das Stapelgel) und ~ 60 min bei 180 V. Überwachen, das Gels, so dass die Farbstofffront gerade abläuft oder ist an der Unterseite des Gels, so daß die niedermolekular Gewicht Proteine ​​nicht run off des Gels.
  5. Übertragen das Acrylamidgel auf ein PVDF-Membran (vorgetränkt mit 100% Methanol zu aktivieren). Wenn eine nasse Übertragung zu tun, nur 1 Stunde für die Übertragung benötigt wird (im Vergleich zu dem normalen ~ 1,75 h). Entsprechend anpassen, für das entsprechende Übertragungssystem; unter Verwendung von vorgefärbten Molekulargewichtsmarker kann bei der Beurteilung der Übertragungseffizienz unterstützen.
  6. Waschen der Membran in Wasser. Verwenden, um eine Ponceau-Färbung für die gleiche Beladung von Proben zu überwachen. Waschen Sie die Ponceau mit Wasser ab.
    1. Blockiert die Membran in 5% fettfreier Trockenmilch in TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,1% Tween-20) für 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C unter Rühren.
  7. Wash - Blot einmal mit TBST und mit primärem Antikörper , verdünnt in 5% Milch TBST (siehe Tabelle Material für Verdünnungen und Antikörper - Empfehlungen) für 1 h bei RT inkubiert.
  8. Führen Sie zwei schnellen Waschungen mit TBST und dann waschen Sie zweimal auf einem Schüttler für insgesamt ~ 30 min (~ 15 min je warh).
  9. Inkubieren mit einem Sekundärantikörper für 40 min bei RT. Wiederholen Sie Schritt 6.10.
  10. Inkubieren mit frisch Western-Blot-Substrat hergestellt und den Film entwickeln oder auf einem Chemilumineszenz-Leser lesen.
  11. Sonde Immunoblot mit Antikörpern p16 INK4A ersten (Abbildung 5). Streifen, die Membran mit Wasser für 15 min inkubiert, 15 min mit 0,2 N NaOH und 15 min mit Wasser. Fahren Sie mit Schritt 6.9 unter Verwendung von anti-p21-Antikörper.
  12. Streifen die Membran 62.5 mM Tris-HCL pH 6,8 und 2% SDS mit 300 & mgr; l frisch zugegebenem BME pro 50 ml Stripping-Lösung.
  13. Inkubieren bei 50 ° C für 30 min und wäscht ausgiebig mit TBS und dann TBST. Sonde mit anti-Aktin oder anti-GAPDH - Antikörper für Protein-Ladesteuerungen (Abbildung 5 zeigt repräsentative Ergebnisse).
    HINWEIS: p53 Ebene können auch auf den gleichen Membranen bewertet werden. Da jedoch p53 ein höheres Molekulargewicht ist, ist es besser , sich auf einem niedrigeren Prozentsatz Gel gelöst ist (zB     10% Tris-Glycin oder ein Gradientengel (4-15%)). Proteinspiegel anderer seneszenten Marker können auch durch Immunoblotting Lysaten bewertet werden, einschließlich γ-H2AX und SAHF Marker.

7. Analyse der mRNA-Spiegel der Seneszenz Markers

HINWEIS: Bei der Isolierung von RNA, sicherzustellen, dass die Arbeitsflächen mit RNase Entfernungslösungen gereinigt werden oder einem gleichwertigen und dass die Materialien all RNase-frei sind.

  1. Unter Verwendung der Zelle / PBS-Mischung aus Schritt 4.2, 1 mL RNA-Extraktionslösung und vortex für 30 s (es sollte keine sichtbaren Klumpen oder Zelldebris sein).
  2. In 200 ul Chloroform und kräftig schütteln für 15 s.
  3. Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit (> 15.000 x g) für 15 min bei 4 ° C.
  4. Entfernen Sie ~ 400 & mgr; l der oberen RNA wässrige Schicht und Pipette in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
  5. Zugabe von 400 & mgr; l Isopropanol (1: 1 mit dem Gesamtvolumen der wässrigen Schicht in dem vorherigen Schritt pipettiert) und 4 ul precipitant an die RNA-Schicht.
  6. Zentrifuge für 15-30 min bei maximaler Geschwindigkeit (> 15.000 x g) und 4 ° C, um die RNA zu pelletieren.
  7. Entfernen Sie den Überstand und 1 mL 75% eiskaltem Ethanol.
  8. Zentrifuge für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit (> 15.000 x g) und 4 ° C.
  9. Entfernen Sie den Überstand und zentrifugiert für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit (> 15.000 x g) und 4 ° C.
  10. Pipette aus so viel Flüssigkeit wie möglich, und der Luft trocknen lassen für 2 min.
  11. Resuspendieren in 10 ul 10fach DNase - Puffer, 85 ul H & sub2; O und 5 ul DNase 1.
  12. für 30 min bei 37 ° C inkubieren.
  13. Füge 200 & mgr; L NT2 - Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 und 0,05% Nonidet P-40) und 300 & mgr; l der unteren Schicht von Säure Phenol-CHCl 2.
  14. Vortex für 1 min und Zentrifuge bei Raumtemperatur für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit (> 15.000 x g).
  15. Sammle 250 ul der oberen RNA Schicht (2 x 125 ul), fügen 25ul 3 M Natriumacetat pH 5.2, 625 ul 100% eiskaltem Ethanol und 5 & mgr; l an Fällmittel. Gut mischen und O / N bei -20 ° C ausgefällt.
  16. Am nächsten Tag, mischte und Spin bei maximaler Geschwindigkeit (> 15.000 xg) und 4 ° C für 30 min und den Überstand verwerfen.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 6,8-6,11.
  18. Resuspendieren des Pellets in 12 & mgr; l Nuklease-freiem Wasser und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
    Hinweis: andere RNA-Isolierungsverfahren und Kits können ebenfalls verwendet werden.
  19. Führen Sie die reverse Transkription mit Zufallshexameren und SSII-Reverse-Transkriptase gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    HINWEIS: Aufgrund der geringen Menge an RNA aus seneszenten Zellen isoliert, ist es am besten, alle von der RNA (12 & mgr; l) für die reverse Transkription Synthese zu verwenden. Alternativ kann RNA mit einem Spektralphotometer quantifiziert werden, und gleiche Mengen von RNA für die reverse Transkription verwendet werden.
  20. Analysieren Sie die mRNA-Spiegel mit Echtzeit quantitative qPCR (RT-qPCR) amplification und SYBR-Grün PCR Master-Mix mit Gen-spezifischen Primer.
    1. Wie in einem typischen Reaktions RT-qPCR, verdünnen, um die cDNA 01.30 (in RNase / DNase-freien Wasser) und 3 & mgr; l 96-Well-Platte auf die Echtzeit für eine bessere Pipettiergenauigkeit hinzuzufügen. Vorbereiten eines Reaktions Mastermix von genspezifischen Vorwärts- und Rückwärts-Primer (2,5 & mgr; M Konzentration, werden 5 & mgr; l / Reaktion), SYBR-Grün PCR-Mix (6,25 & mgr; l / Reaktion, verwenden weniger als die Empfehlung des Herstellers), und 5,75 & mgr; l RNase / DNase-freies Wasser für eine endgültigen Reaktionsvolumen von 20 & mgr; l (17 & mgr; l der Primer / SYBR-grün / Wassers und 3 & mgr; l cDNA).
    2. Führen Sie RT-qPCR-Amplifikation eine Echtzeit-PCR-Maschine; folgt dem Protokoll des Herstellers.
      HINWEIS: Eine Liste von validierten menschlichen vorwärts und Echtzeit - Reverse - Primer kann in Tabelle 1 gefunden werden. Diese Gene umfassen SASP Proteine ​​und anderen Seneszenz-assoziierte Marker und / oder die Gene. Repräsentative Ergebnisse aus IR-induzierte Seneszenz sind in 6.

8. Quantifizierung SASP Protein Levels

  1. Induce Seneszenz Abschnitte 1 oder 2 oder unter Verwendung eines anderen Verfahrens. Platte, die die Zellen auf 6 oder 10-cm-Platten, wie oben (~ 250.000 Zellen / 6 cm Platte oder ~ 650.000 / 10 cm Platte) beschrieben.
  2. Entweder mit Zellen 10 d nach dem IR-Behandlung oder mit replikativen seneszenten Zellen (und entsprechenden Kontrollzellen), waschen die Zellen dreimal mit 1x PBS gewaschen und serumfreies Medium, mit Antibiotika in einem kleinen Volumen (2,5 ml für 6 cm oder 5 ml hinzufügen für 10 cm).
  3. Inkubiere über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem Gewebekultur - Inkubator. Am nächsten Tag, sammelt das Medium und setzt es in einem konischen Röhrchen auf Eis.
  4. Waschen Sie die Zellen 2 mal mit PBS und füge dann 1 ml Trypsin (für eine 6 cm Schale). Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers später einzustellen, die Konzentrationen nach Zellzahl.
  5. Zentrifuge das Medium für 5 min bei 300 x g.
  6. Filter das Medium unter Verwendung eines 0,45 & mgr; m-Spritzenfilter.
  7. Aliquot das Medium und gefrier bei -80 ° C bis zur Verwendung oder direkt mittels ELISA-Assay oder äquivalenten Assays.
  8. Berechnen der Anzahl von Zellen / mL Konzentration durch die gesamte Zellzahl / Volumen Medium gesammelt Einnahme.
  9. Führen eines geeigneten enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Siehe die Tabelle Material für empfohlene ELISA - Kits zum Testen auf IL-6, IL-8, GRO & agr und anderen Zytokinen / Chemokinen (6B).
  10. Um sicherzustellen, dass die Faktoren, die gemessen werden, im linearen Bereich der ELISA-Kits sind, machen Verdünnungen des seneszenten Zellen Mediums gegenüber dem wuchernde Zellmedium. Account für diese Verdünnungen und das Volumen, wenn die Menge von IL-6 zu berechnen. die Menge an IL-6 pro Zelle pro Tag, berechnet den IL-6-Wert aus dem Satz (in pg) pro verdünnter Zellkonzentration pro ml (fr erhaltenen sekretierte zu erwerbenom Schritt 7.8).
    Hinweis: andere Methoden, wie Zytokin-Arrays können verwendet werden SASP-Proteinspiegel zu erkennen und kann zum Screening einer großen Anzahl von SASP Faktoren geeignet sein. Die Proteinniveaus von SASP Faktoren können von der Zeit nach Induktion der Seneszenz, der Zelltyp oder die Art der Seneszenz induziert variieren.

Ergebnisse

Die Figuren 2 - 6 repräsentative Ergebnisse von SA-β-gal - Färbung zeigen; Anfärben für γ-H2AX und SAHF; Beurteilung der Proteinspiegel von p16 INK4A, p21 und p53; und mRNA und Protein-Ebene von seneszenten-assoziierte Moleküle. Erhöhter SA-β-gal-Färbung erfolgt mit replikativen und DNA-Schädigung induzierte Seneszenz. Auch beachten Sie die morphologischen Veränderungen, die mit Seneszenz auftreten. Die Zellen werden vergrößert und flach im Vergl...

Diskussion

unter Verwendung von humanen diploiden Fibroblasten Hier haben wir Methoden zur replikativen und DNA-Schädigung induzierte Seneszenz beschrieben. Zusätzlich sind Techniken zum Protein- und mRNA-Mengen verschiedenen Seneszenz-assoziierte Proteine ​​Quantifizieren enthalten sind, sowie Färbung für SA-β-gal und für den DNA-Schädigung Marker γ-H2AX. Diese Protokolle können weit seneszenten Phänotypen verwendet werden , sowohl in vitro zu bewerten und in vivo, obwohl viele Einschränkungen bes...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der Intramural Research Program der National Institutes of Health, National Institute on Aging. Die Autoren möchten Myriam Gorospe und Kotb Abdelmohsen für viele hilfreiche Diskussionen über die Seneszenz und Kotb Abdelmohsen für auch kritisch Lesen des Manuskripts. Wir danken auch unser Labor Mitglieder, vor allem Douglas Dluzen für kritisch, das Manuskript zu lesen.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Tris-glycine gelsInvitrogenXP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3AmbionAM9720
Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibodyInvitrogenA110311:300 dilution
Cell liftersCorning Inc.3008Cell scraper
ECL anti-mouse HRP linked antibodyAmershamNA931V
ECL Plus Western Blotting SubstratePierce32132ECL
DAPIMolecular ProbesMP01306stock 5 mg/mL in dH2O
GAPDH antibodySanta Cruzsc-322331:1,000 - 5,000 dilution
GlycoBlueAmbionAM9515
Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibodyAbcam12201:500 dilution
Human IL-6 Quantikine ELISA assayR&D systemsD6050
Human IL-8 Quantikine ELISA assayR&D systemsD8000C
Human GROa Quantikine ELISA assayR&D systemsDRG00
N-N-dimethylformamide SigmaD4551DMF
p16 monoclonal antibodyBD Biosciences51-1325gr1:500 dilution
p21 monoclonal antibodyMillipore05-3451:750 dilution
p53 monoclonal antibodySanta Cruzsc-1261:500 dilution clone DO-1
phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibodyCell Signaling97191:2,000 dilution
POWER SYBR-green PCR master mix Applied Biosystems4367659
Pre-stained molecular weight markersBiorad161-0374
ProLong Gold Antifade InvitrogenP36930
PVDF membrane Thermo Scientific88518
Senescence β-Galactosidase Staining KitCell Signaling9860
TRIzolAmbion/Life Tech10296028

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