Löslichkeit von hydrophoben Verbindungen in wässriger Lösung unter Verwendung von Kombinationen der Montage selbst Peptide und Aminosäuren

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein klinisch einsetzbaren Mittel zur Auflösung von hydrophober Verbindungen in einer wässrigen Umgebung unter Verwendung von Kombinationen der Peptide und Aminosäuren-Lösungen selbst zusammenstellen. Unsere Methode löst eine große Einschränkung hydrophobe Therapeutika, die sichere und effiziente Mittel zur Löslichkeit und Lieferung Methoden in klinischen Einrichtungen fehlen.

Zusammenfassung

Selbstorganisierende Peptide (SAPs) sind vielversprechende Fahrzeuge für die Lieferung von hydrophoben Therapeutika für klinische Anwendungen; Ihre amphipathische Eigenschaften erlauben ihnen, hydrophobe Verbindungen in der wässrigen Umgebung des menschlichen Körpers aufzulösen. Selbstorganisierende Peptid-Lösungen haben jedoch schlechte Durchblutung Kompatibilität (z.B. niedrige Osmolarität), deren klinische Anwendung durch intravenöse Verwaltungen zu behindern. Wir haben vor kurzem eine allgemeine Plattform für hydrophobe Drug-Delivery entwickelt, die SAPS mit Aminosäuren-Lösungen (SAP-AA verbindet) bis Wirkstofflöslichkeit erhöhen und Formulierung Osmolarität um die Voraussetzungen für klinische Anwendungen zu erreichen. Diese Formulierung-Strategie wurde im Rahmen der drei strukturell unterschiedlichen hydrophobe Verbindungen – PP2, Rottlerin und Curcumin – um seine Vielseitigkeit unter Beweis stellen gründlich getestet. Darüber hinaus haben wir untersucht Auswirkungen des Änderns Formulierungsbestandteilen durch 6 verschiedene Säfte, 20 natürlich vorhandenen Aminosäuren bei niedrigen und hohen Konzentrationen, und zwei verschiedene Zusatzlösungsmittel Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und Ethanol zu analysieren. Unsere Strategie erwies sich als wirksam bei der Optimierung von Komponenten für einen gegebenen hydrophobe Drogen- und therapeutische Funktion des formulierten Inhibitors, PP2, wurde in Vitro und in Vivobeobachtet. Dieses Manuskript beschreibt unsere verallgemeinerte Formulierung-Methode unter Verwendung von SAP-AA-Kombinationen für hydrophobe Verbindungen und Analyse der Löslichkeit als ein erster Schritt zur möglichen Verwendung dieser Formulierungen in funktioneller Studien. Wir gehören repräsentative Löslichkeit Ergebnisse für die Formulierung von hydrophoben zusammengesetzte, Curcumin und besprechen, wie unsere Methodik dient als Plattform für biologische Zukunftsstudien und Krankheitsmodelle.

Einleitung

Säfte sind eine Klasse von Biomaterialien, die weitgehend als 3D Gerüste in regenerative Medizin^1,2,3,4untersucht wurden. Vor kurzem wurden jedoch sie als Vehikel für die Lieferung von Therapeutika aufgrund ihrer einzigartigen biologischen Eigenschaften^5,6,7,8genutzt. SAPs montieren natürlich in stabilen Nanostrukturen⁹, wodurch ein Mittel zur Droge Kapselung und Schutz. Säfte sind amphipathische, bestehend aus einem bestimmten Muster der hydrophobe und hydrophile Aminosäure Wiederholungen, fahren ihre Self-assembly^9,10 und sie dienen als Medium zwischen hydrophoben und hydrophilen Umgebungen. Infolgedessen für die klinische Abgabe von hydrophoben Medikamenten – die extrem geringe Bioverfügbarkeit und Absorption im Körper haben aufgrund mangelnden Löslichkeit in wässrigen Umgebungen^11,12 – SAPs sind vielversprechend als eine Lieferung Fahrzeug. Ihre Reihenfolge Muster bedeutet darüber hinaus auch, dass SAPs können rational konzipiert und entwickelt, um maximale Kompatibilität mit jedem bestimmten Medikament oder compound (d. h.anhand der funktionellen Gruppen) und Löslichkeit weiterhelfen.

SAPs wurden als wirksames Medikament Lieferfahrzeuge in viele in Vitro und in Vivo Einstellungen^13,14,15,16angewendet. Sie haben auch große Sicherheit und Biokompatibilität bewiesen. Durch niedrige Osmolarität von SAP-medikamentösen Präparaten können sie jedoch für intravenöse Injektionen wie in klinischen Umgebungen¹³verwendet werden. In Anbetracht dieser Zurückhaltung haben wir vor kurzem entwickelt eine Strategie, die SAPs mit Aminosäure-Lösungen zur Verringerung des Einsatzes von giftigen Co Lösungsmitteln und erhöhen die Formulierung Osmolarität kombiniert und daher klinische Relevanz. Wir wählten mit Aminosäuren sind die Bausteine des SAPs, sind bereits klinisch akzeptiert, und in Kombination mit SAPs, sie erhöhen hydrophobe Wirkstofflöslichkeit Verringerung der Menge an SAP^17,18erforderlich.

Wir haben SAP-AA-Kombinationen als eine allgemeine Plattform für hydrophobe Wirkstofflöslichkeit und Nachlieferung geprüft, durch die Schaffung einer mehrstufigen Screening-Pipeline und der Src-Inhibitor, PP2 als Modell hydrophobe Verbindung zuweisen. In diesem Prozess haben wir untersucht die Wirkung der Bestandteile der Rezeptur verändert – letztlich Tests 6 verschiedene Säfte, alle 20 Aminosäuren in 2 verschiedenen Konzentrationen (niedrig und hoch, niedrig basierend auf Konzentrationen in bestehende klinische Anwendungen und hohe Konzentrationen wurden 2 X, 3 X oder 5 X die klinische Konzentration basiert auf der maximalen Löslichkeit der einzelnen Aminosäuren in Wasser), und 2 verschiedenen Co-Lösemittel – und ausgewählten Kombinationen, die für die weitere Analyse PP2 solubilisiert. Dieser Arzneistoff-Formulierung erwies sich als wirksam ist wie eine Droge Lieferfahrzeug in Zellkultur als auch in Vivo Modellen mit intratracheale und intravenös Verwaltungen. Ebenso unsere Arbeit auf die Vielseitigkeit der SAP-AA-Kombinationen in Gefäss-Multiple berührt strukturell unterschiedlichen hydrophobe Verbindungen in wässrigen Umgebungen; insbesondere die Medikamente Rottlerin und Curcumin¹⁸. Dieses Manuskript beschreibt die SAP-AA Formulierung Methode und Analyse von Curcumin Löslichkeit als Beispiel für die grundlegende Schritt in unserer Screening-Pipeline. Dieses Protokoll bietet eine einfache und reproduzierbare Möglichkeit zum Bildschirm für die optimale SAP-AA-Kombinationen, die eine gegebene hydrophobe Verbindung aufzulösen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Aminosäure-Lösungen

1. vorbereiten und Label zwei 50 mL konische Zentrifuge Rohre für jede Aminosäure (jeweils für beide " niedrigen " und " hohe " Konzentrationen).
2. Bereiten eine große 2 L-Flasche mit gereinigtem Wasser (18,2 MΩ·cm bei 25 ° C).
3. Berechnen Sie die Menge der einzelnen Aminosäuren (in Gramm), um die gewünschte Konzentration zu erreichen, und die entsprechende Menge der Aminosäure in ihre jeweiligen 50 mL Zentrifuge Röhren mit einem Spatel wiegen.
   Hinweis: Für die " hohe " Konzentration der beiden negativ geladenen Aminosäuren, PBS statt Wasser verwendet wird. Ihre Konzentration durch ihre niedrige Wasserlöslichkeit und mit PBS statt Wasser hilft, den niedrigen pH-Wert beizubehalten konnten wir nicht erhöhen. Darüber hinaus wurden die Konzentrationsberechnungen mittels einem Endvolumen von 40 mL für jede Aminosäure-Lösung erhalten. Alle Aminosäuren-Konzentrationen sind in Tabelle 3 aufgeführt. Achten Sie darauf, den Spatel zwischen Aminosäuren zur Vermeidung von Kontaminationen zu spülen. Wir empfehlen eine Wasserspülung, gefolgt durch Abwischen mit 70 % igem Ethanol.
4. Fügen Sie 40 mL gereinigtes Wasser (oder PBS) in jeweils 50 mL-Tube mit einer serologischen Pipette. Kappe, Röhren und Vortex oder kräftig schütteln, bis aufgelöst. Wasser-Bad-Beschallung (Raumtemperatur, 130 W, 40 kHz) kann auch verwendet werden, in der Löslichkeit-Prozess zu unterstützen.
   Hinweis: Die folgenden Aminosäure-Lösungen sind lichtempfindlich und sollte mit Aluminiumfolie abgedeckt werden: Cystein und Tyrosin (bestehen aus aromatischen ringartige Strukturen), Tryptophan und Phenylalanin, (reaktive - SH-Gruppe).

2. Vorbereitung der SAP-AA-Lösungen

1. bereiten 20 mL funkeln Fläschchen für die selbst-Montage Peptide. Vorbereitung einer bestimmten selbstorganisierende Peptid, ein Fläschchen pro vorbereitete Aminosäurelösung (jede Kombination erfolgt in einer separaten Phiole).
2. Mit einem Hochleistungs-Analysenwaage (mit einer besseren Lesbarkeit auf 0,1 mg oder weniger) wiegen etwa 1 ± 0,2 mg Peptid in den unteren Teil jedes Fläschchen. Kappe nach dem Wiegen und erfassen das exakte Gewicht des Peptids auf dem Cap
3. Pipette das entsprechende Volumen der Aminosäurelösung (vorbereitet in Abschnitt 1) in jedem Fläschchen mit Peptid, um die gewünschte Konzentration von selbst zusammenbauen Peptid (0,1 mg/mL für lange Peptide mit einer Länge von 16 Aminosäuren oder 0,2 mg/mL zu erreichen kürzere Peptide mit einer Länge von 8 Aminosäuren).
4. Sonicate für 10 min in ein Wasser Bad Sonikator (130 W, 40 kHz) bei Raumtemperatur sicherzustellen, die Lösungen in Fläschchen sind vollständig in das Wasserbad eingetaucht.

3. Vorbereitung der Droge-DMSO oder Droge-Ethanol Stock Solutions

1. kombinieren 1 mg des Medikaments (in diesem Fall, Curcumin mit 100 % DMSO) und weitere 1 mg mit 100 % Ethanol erstelle ich zwei Stammlösungen.
   Hinweis: Wir haben 200 µL DMSO und 400 µL Ethanol, DMSO-Curcumin und Ethanol-Curcumin-Aktien zu machen, die 5 mg/mL und 2,5 mg/mL, bzw. aufgrund unterschiedlicher Löslichkeit in jedem Lösungsmittel waren; Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Konzentration Lager je nach der hydrophoben Droge des Interesses eingestellt werden sollte. Faktoren wie Wirkstofflöslichkeit und wirksame biologische Konzentration sind wichtig bei der Ermittlung dieses Wertes. Auch, denken Sie daran, dass die Aktie 100fach und 50-fach in DMSO und Ethanol Formulierungen bzw. verdünnt werden wird (siehe Abschnitt 4) in Verbindung mit SAP-AA-Lösungen. Es kann bevorzugt werden, bereiten Sie eine größere Menge an Lager abhängig von der Anzahl der Formulierungen erforderlich – würde in diesem Fall mehr als 1 mg Droge verwendet werden. Die Lager kann bei-20 ° C gelagert werden. Tauwetter auf Eis und Wirbel vor dem Gebrauch.
2. Vortex Fläschchen für 15 s das Medikament vollständig auflösen.

4. Vorbereitung der Wirkstoff-Formulierungen

1. Vorbereitung klar, 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen für jede Formulierung. Achten Sie darauf, Label-Röhren mit der beabsichtigten selbst zusammenbauen, Peptid, Aminosäure (und Konzentration) und Co.
2. Fügen Sie 10 µL Droge-DMSO Aktie oder 20 µL Droge-Ethanol Lager zu entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Hinzufügen 990 µL des SAP-AA Säurelösungen an die entsprechenden beschriftet Mikrozentrifugenröhrchen, Droge-DMSO Lager und 980 µL für diejenigen mit Droge-Ethanol Lager enthalten. Dies führt zu 1 mL Wirkstoff-Formulierungen mit 1 % DMSO oder 2 % Ethanol.
   Hinweis: Die Endkonzentration von allen Curcumin Formulierungen betrug 0,5 mg/mL nach dem Protokoll. Dies variiert wieder, wenn mit anderen hydrophoben Verbindungen und/oder beginnend mit einer unterschiedlichen Lager Konzentration (siehe Punkt 3.1)
4. Vortex kräftig für 30 s und Formulierungen für 30 min. ruhen lassen

5. Löslichkeit testen

1. nach Ruhezeit, Wirbel wieder kräftig für 30 s.
2. Zentrifugieren Sie die Formulierungen bei 14.220 x g für 1 min.
3. Analysieren unten Mikrozentrifugenröhrchen für Niederschlag (Visualisierung).

Ergebnisse

Für die hydrophoben Droge, Curcumin, produzierten wir Formulierungen mit allen 20 natürlich vorhandenen Aminosäuren in geringen Konzentrationen, in Kombination mit nur einer SAP, EAK16-II, als ein Proof-of-Principle. Wir testeten auch Formulierungen mit DMSO und Ethanol als Zusatzlösungsmittel. Insgesamt produziert das 40 Curcumin Formulierungen, jeweils verschiedene Komponenten enthalten. Es ist wichtig zu beachten, dass wir in unseren früheren Studien mit den Src-Inhibitor, PP2, me...

Diskussion

In der Formulierung-Prozedur gibt es verschiedene wichtige Schritte und Punkte, die bei der Problembehandlung. Zunächst, wie wir mit verschiedenen Komponenten und Konzentrationen arbeiten, mehrere Wirbel Schritte im gesamten Protokoll sicherstellen, dass alle Konzentrationen einheitlich und korrekt sind. Einige der hoch-Konzentration, hydrophobe Aminosäuren-Lösungen kann immer noch nicht vollständig aufgelöst werden nach dem aufschütteln und kann in diesem Fall kräftig geschüttelt werden, von Hand, in den Prozess...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
EAK16-I	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EAK16-II	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EAK16-IV	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EFK8-II	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
A6KE	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
P6KE	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
Alanine	Sigma-Aldrich	A7469-100G	L-Alanine
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I7403-100G	L-Isoleucine
Leucine	Sigma-Aldrich	L8912-100G	L-Leucine
Methionine	Sigma-Aldrich	M5308-100G	L-Methionine
Proline	Sigma-Aldrich	P5607-100G	L-Proline
Valine	Sigma-Aldrich	V0513-100G	L-Valine
Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P5482-100G	L-Phenylalanine
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941-100G	L-Tryptophan
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T8566-100G	L-Tyrosine
Glycine	Sigma-Aldrich	G8790-100G	L-Glycine
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159-100G	L-Asparagine
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540-100G	L-Glutamine
Serine	Sigma-Aldrich	A7219-100G	L-Serine
Threonine	Sigma-Aldrich	T8441-100G	L-Threonine
Histidine	Sigma-Aldrich	H6034-100G	L-Histidine
Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-100G	L-Lysine
Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-100G	L-Arginine
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A7219-100G	L-Aspartic Acid
Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G8415-100G	L-Glutamic Acid
Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-100G	L-Cysteine
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	DMSO
Ethanol	Sigma-Aldrich	277649-100ML	Anhydrous
Curcumin	Sigma-Aldrich	08511-10MG	Hydrophobic drug, curcumin
Rottlerin	EMD Millipore	557370-10MG	Hydrophobic drug, rottlerin
PP2	Enzo	BML-EI297-0001	Hydrophobic drug, PP2
Scintillation Vials	VWR	2650-66022-081	Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide.
Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes	VWR	352070	Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions.