Solubilidad de compuestos hidrófobos en la solución acuosa mediante combinaciones de uno mismo-montaje de péptidos y aminoácidos

Resumen

Este protocolo describe un medio clínicamente aplicable de disolver compuestos hidrofóbicos en un ambiente acuoso utilizando combinaciones de uno mismo-montaje de soluciones de péptidos y aminoácidos. Nuestro método tiene una limitación importante de la terapéutica hidrofóbica, que carecen de seguro y eficiente medio de solubilidad y entrega de métodos en contextos clínicos.

Resumen

Uno mismo-montaje péptidos (SAPs) son prometedores vehículos para la entrega de tratamientos hidrófobos para aplicaciones clínicas; sus propiedades anfipáticos que puedan disolver compuestos hidrofóbicos en el ambiente acuoso del cuerpo humano. Sin embargo, soluciones de peptide uno mismo-montaje tienen compatibilidad sanguínea deficiente (p. ej., baja osmolaridad), lo que dificulta su aplicación clínica a través de administración intravenosa. Recientemente hemos desarrollado una plataforma generalizada para la entrega de drogas hidrofóbicas, que combina programas de ajuste estructural con soluciones de aminoácidos (SAP-AA) para mejorar la solubilidad de la droga y aumentar la osmolaridad de la fórmula para alcanzar los requerimientos para aplicaciones clínicas. Esta estrategia de formulación fue probada a fondo en el contexto de tres compuestos hidrofóbicos estructuralmente diferentes: PP2 rottlerin y curcumina – para demostrar su versatilidad. Además, se analizaron efectos de cambiar componentes de la formulación mediante el análisis de 6 diferentes programas de ajuste estructural, 20 aminoácidos existentes naturalmente en concentraciones bajas y altas y dos diversos solventes Co dimetil sulfóxido (DMSO) y etanol. Nuestra estrategia demostrado para ser efectiva en la optimización de componentes para un determinado fármaco hidrofóbico y función terapéutica del inhibidor formulado, PP2, fue observado tanto in vitro como in vivo. Este manuscrito describe nuestro método de formulación generalizada utilizando SAP AA combinaciones de compuestos hidrofóbicos y análisis de solubilidad como un primer paso hacia el posible uso de estas formulaciones en estudios más funcionales. Incluyen los resultados de solubilidad representativas para la formulación de la curcumina compuesta hidrofóbica y discutir cómo nuestra metodología sirve como una plataforma para futuros estudios biológicos y modelos de la enfermedad.

Introducción

Programas de ajuste estructural son una clase de biomateriales que han sido estudiados extensivamente como andamios 3D en medicina regenerativa^1,2,3,4. Más recientemente sin embargo, ellos han sido explotados como vehículos para la entrega de la terapéutica debido a sus propiedades biológicas únicas^5,6,7,8. Programas de ajuste estructural naturalmente montan en nanoestructuras estable⁹, proporcionando así un medio de encapsulación del fármaco y la protección. Programas de ajuste estructural son anfipáticos, conformada por un patrón específico de repeticiones del aminoácido hidrofóbico e hidrofílico, conducir su uno mismo-Asamblea de^9,10 y lo que les permite servir como un medio entre hidrofóbico e hidrofílico ambientes. En consecuencia, para la administración clínica de drogas hidrofóbicas, que tienen muy baja biodisponibilidad y absorción en el cuerpo debido a la falta de solubilidad en ambientes acuosos^11,12 – SAPs son prometedores como una entrega vehículo. Además, su patrón de secuencia implica que SAPs pueden racionalmente diseñados y desarrollados para maximizar la compatibilidad con cualquier fármaco dado o compuesto (es decir, basadas en grupos funcionales) y además ayudar a la solubilidad.

Programas de ajuste estructural se han aplicado como vehículos de entrega de drogas eficaces en muchos in vitro e in vivo configuración^13,14,15,16. También han mostrado gran seguridad y biocompatibilidad. Sin embargo, debido a la baja osmolaridad de preparaciones SAP de la droga, no puede utilizarse para inyecciones intravenosas como en ajustes clínicos¹³. Teniendo en cuenta esta restricción, recientemente hemos desarrollado una estrategia que combina programas de ajuste estructural con soluciones de aminoácidos con el fin de reducir el uso de solventes tóxicos Co y aumentar la osmolaridad de la formulación y por lo tanto, relevancia clínica. Se decidió utilizar los aminoácidos como son los bloques de edificio del SAPs, ya son clínicamente aceptados, y en combinación con programas de ajuste estructural, que aumentan la solubilidad de la droga hidrofóbica mientras que reduce la cantidad de SAP^17,18.

Hemos escudriñado combinaciones AA SAP como plataforma generalizada de solubilidad de la droga hidrofóbica y posterior entrega crear una tubería de la proyección de múltiples pasos y aplicando a inhibidor de la fuente, PP2, como un compuesto hidrofóbico modelo. En este proceso, se examinó el efecto de cambiar componentes de la formulación, en última instancia prueba 6 diferentes programas de ajuste estructural, todos los 20 aminoácidos en 2 concentraciones diferentes (bajo y alto; bajo basados en concentraciones en aplicaciones clínicas existentes y de alta las concentraciones fueron x 2, x 3 o x 5 la concentración clínica se basa en la solubilidad máxima de cada aminoácido en el agua) y 2 diferentes solventes Co – y las combinaciones que solubilizados PP2 para su posterior análisis. Esta formulación de la droga demostró para ser eficaz como un vehículo de entrega de droga en cultivo celular, así como en vivo modelos utilizando administración intratraqueal e intravenosa. Además, nuestro trabajo se refirió a la versatilidad de combinaciones de SAP-AA en múltiples solubilizantes, estructuralmente diferentes compuestos hidrofóbicos en ambientes acuosos; específicamente, los medicamentos rottlerin y curcumina¹⁸. Este manuscrito describe el método de formulación SAP-AA y el análisis de solubilidad de la curcumina como ejemplo de la etapa primaria en nuestros proyectos de investigación. Este protocolo proporciona una forma simple y reproducible a la pantalla de las óptimas combinaciones de SAP-AA, que disuelven cualquier compuesto hidrofóbico dado.

Protocolo

1. preparación de las soluciones del aminoácido

1. prepara y etiqueta dos 50 mL cónico tubos de centrífuga para cada aminoácido (uno para los dos " bajo " y " alta " concentraciones).
2. Preparar un gran frasco de 2 L que contenga agua purificada (18.2 MΩ·cm a 25 ° C).
3. Calcular la cantidad de cada aminoácido (en gramos) para alcanzar la concentración deseada y pesar la cantidad adecuada de aminoácidos en sus tubos de centrífuga de 50 mL respectivos con una espátula de.
   Nota: Para la " alta " concentración de los dos aminoácidos con carga negativa, PBS se utiliza en lugar de agua. No podría aumentar sus concentraciones debido a su solubilidad de agua baja y utilizando PBS en lugar de agua ayuda a mantener el pH bajo. Además, los cálculos de concentración fueron obtenidos usando un volumen final de 40 mL para cada solución de aminoácido. Todas las concentraciones de aminoácidos se contornean en la tabla 3. Asegúrese de enjuagar la espátula entre aminoácidos para evitar la contaminación. Se recomienda un enjuague con agua, seguido por limpieza con etanol al 70%.
4. Agregar 40 mL de agua purificada (o PBS) en cada tubo de 50 mL con una pipeta serológica. Tapa los tubos y agitar o sacudir vigorosamente hasta que se disuelva. Sonicación de baño de agua (a temperatura ambiente, 130 W, 40 kHz) puede utilizarse también para ayudar en el proceso de solubilidad.
   Nota: Las siguientes soluciones de aminoácidos son sensibles a la luz y debe cubrirse con papel de aluminio: triptófano, fenilalanina y tirosina (que consisten en estructuras de anillo aromáticas) y cisteína (reactivo - SH del grupo).

2. Preparación de soluciones de SAP-AA

1. viales de centelleo preparar 20 mL de la uno mismo-montaje de péptidos. Para un péptido dado de uno mismo-montaje, preparar un frasco por preparados aminoácidos solución (cada combinación se realizará en un frasco aparte).
2. Utilizando una balanza analítica de alta performance (con una legibilidad de hasta 0.1 mg o menos), pesan aproximadamente 1 ± 0.2 mg de péptido en el fondo de cada frasco. La tapa después de pesar y registrar el peso exacto del péptido en el cap.
3. Pipetear el volumen apropiado de solución de aminoácidos (preparado en la sección 1) en cada frasco contiene péptidos, para alcanzar la concentración deseada de uno mismo-montaje de péptido (0,1 mg/mL para péptidos largos con una longitud de 16 aminoácidos, o 0,2 mg/mL para péptidos más cortos con una longitud de 8 aminoácidos).
4. Someter a ultrasonido durante 10 minutos en un agua baño sonicador (130 W, 40 kHz) a temperatura ambiente, garantizando las soluciones dentro de los frascos se sumergen completamente en el baño de agua.

3. Preparación de drogas-DMSO o soluciones Stock de drogas etanol

1. cosechadora 1 mg de droga (en este caso, la curcumina con 100% DMSO) y otro 1 mg con etanol 100% a crear dos soluciones.
   Nota: Agregó 200 μL de DMSO y el 400 μL etanol para hacer acciones DMSO cúrcuma y curcumina etanol que fueron 5 mg/mL y 2.5 mg/mL, respectivamente, debido a la diferente solubilidad en cada disolvente; sin embargo, es importante tener en cuenta que la concentración de población se debe ajustar dependiendo de la droga hidrofóbica de interés. Factores como la solubilidad de la droga y concentración biológica efectiva son importantes en la determinación de este valor. También, tenga en cuenta que el stock se diluirá 50 veces y 100-fold en formulaciones DMSO y etanol, respectivamente, cuando se combina con soluciones de SAP-AA (ver sección 4). Puede ser preferido para preparar un volumen mayor de acciones dependiendo del número de formulaciones requeridas – en este caso, se utilizará más de 1 mg de droga. La acción puede ser almacenada a-20 ° C; deshielo en hielo y agitar antes de usar.
2. Frascos de vortex por 15 s para disolver totalmente la droga.

4. Preparación de formulaciones de drogas

1. Prepare claros, tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada formulación. Asegúrese de que a los tubos de la etiqueta con el previsto autoensamblada péptido del aminoácido (y concentración) y co-solvente.
2. Añadir 10 μl del stock de drogas-DMSO, o 20 μl etanol drogas stock a tubos de microcentrífuga apropiado.
3. Agregar 990 μl de soluciones ácidas de SAP-AA al apropiado etiquetado tubos de microcentrífuga con stock de drogas-DMSO y 980 μl a los que contienen stock de drogas-etanol. Esto produce formulaciones de drogas de 1 mL con etanol al 1% DMSO o 2%.
   Nota: La concentración final de todas las formulaciones de curcumina fue 0.5 mg/mL según el protocolo. Una vez más, esto variará cuando utilizando otros compuestos hidrofóbicos o comenzando con una concentración de acciones diferentes (ver paso 3.1)
4. Vortex vigorosamente por 30 s y permiten formulaciones reposar 30 min

5. pruebas de solubilidad

1. después de período de descanso, vigorosamente nuevamente vortex por 30 s.
2. Las formulaciones a 14.220 x g durante 1 minuto de la centrífuga
3. Analizar la parte inferior de los tubos de microcentrífuga para precipitación (visualización).

Resultados

Para la droga hidrofóbica, curcumina, produjimos formulaciones con 20 todos naturalmente existen aminoácidos en concentraciones bajas, en combinación con un único SAP, EAK16-II, como una prueba de principio. También probamos formulaciones utilizando DMSO y etanol como co solventes. En total, esto produjo 40 curcumina formulaciones, cada una con diferentes componentes. Es importante señalar que, en nuestros estudios anteriores utilizando el inhibidor Src, PP2, incluido más opciones ...

Discusión

En el procedimiento de formulación, hay varios pasos críticos y puntos a considerar en la solución de problemas. En primer lugar, como estamos trabajando con diversos componentes y las concentraciones, varios pasos de vórtice a través del protocolo que sean todas las concentraciones de uniforme y correcta. Algunas de las soluciones de alta concentración, hidrofóbico aminoácido pueden todavía no ser disuelto totalmente después de Vortex, y en este caso, pueden ser sacudidos vigorosamente a mano para ayudar en el...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
EAK16-I	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EAK16-II	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EAK16-IV	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EFK8-II	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
A6KE	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
P6KE	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
Alanine	Sigma-Aldrich	A7469-100G	L-Alanine
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I7403-100G	L-Isoleucine
Leucine	Sigma-Aldrich	L8912-100G	L-Leucine
Methionine	Sigma-Aldrich	M5308-100G	L-Methionine
Proline	Sigma-Aldrich	P5607-100G	L-Proline
Valine	Sigma-Aldrich	V0513-100G	L-Valine
Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P5482-100G	L-Phenylalanine
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941-100G	L-Tryptophan
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T8566-100G	L-Tyrosine
Glycine	Sigma-Aldrich	G8790-100G	L-Glycine
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159-100G	L-Asparagine
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540-100G	L-Glutamine
Serine	Sigma-Aldrich	A7219-100G	L-Serine
Threonine	Sigma-Aldrich	T8441-100G	L-Threonine
Histidine	Sigma-Aldrich	H6034-100G	L-Histidine
Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-100G	L-Lysine
Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-100G	L-Arginine
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A7219-100G	L-Aspartic Acid
Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G8415-100G	L-Glutamic Acid
Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-100G	L-Cysteine
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	DMSO
Ethanol	Sigma-Aldrich	277649-100ML	Anhydrous
Curcumin	Sigma-Aldrich	08511-10MG	Hydrophobic drug, curcumin
Rottlerin	EMD Millipore	557370-10MG	Hydrophobic drug, rottlerin
PP2	Enzo	BML-EI297-0001	Hydrophobic drug, PP2
Scintillation Vials	VWR	2650-66022-081	Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide.
Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes	VWR	352070	Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions.