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Resumen

Se presenta una nueva técnica para la visualización rápida de antígeno en una superficie bacteriana, que implica la Biotinilación superficial seguida por la exposición a las proteínas de interés en fusión con avidina monomérica. Carga del BCG con antígenos seleccionados con éxito mejora su inmunogenicidad, lo que sugiere que la decoración superficial puede sustituir los métodos genéticos tradicionales.

Resumen

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa grave y el bacilo de M. bovis sólo disponible vacuna de Calmette-Guerin (BCG) es seguro y eficaz para la protección contra la meningitis de TB severa de los niños y algunas formas de tuberculosis diseminada, pero no protege contra la tuberculosis pulmonar, que es la forma más prevalente de la enfermedad. Estrategias prometedoras para mejorar la BCG en la actualidad basan en su transformación con genes que codifican inmunodominante M. tuberculosis (Mtb)-antígenos específicos o complementación con genes que codifican factores que estimularían el antígeno las células presentadoras. Principales limitaciones de estos enfoques incluyen el incierto nivel de seguridad de los vectores de expresión, baja eficiencia y baja estabilidad. En este estudio, presentamos un enfoque alternativo a la mejora de la vacuna, que consiste en complementación de BCG con proteínas exógenas de interés en la superficie de las bacterias, en lugar de transformación con los plásmidos codifican genes correspondientes. En primer lugar, las proteínas de interés se expresan en fusión con avidina monomérica en estándar e. coli sistemas de expresión y utilizarlas para decorar la superficie de biotinilado BCG. Con superficie de BCG con antígenos de sustituta ovoalbúmina los experimentos con animales demuestran que la bacteria modificada completamente inmunogénica y capaces de inducir respuestas de células T específicas. En conjunto, los datos presentados aquí fuertemente apoyan un novedoso y eficaz método para remodelar la actual vacuna BCG que reemplaza el enfoque convencional laborioso de complementación con ácidos nucleicos exógenos.

Introducción

Diversas estrategias se han propuesto para reemplazar la actual vacuna TB BCG, incluyendo proteína adyuvante sistemas, tecnologías virales virales, cepas de m. vivo atenuadas y modificadas genéticamente cepas de BCG, ya sea para introducir genes sobre-expresan antígenos de BCG que no expresan suficientemente durante la infección1 o Mtb-antígenos específicos no presentan en BCG2. Ingeniería genética, sin embargo, se enfrenta a muchas barreras incluyendo el incierto nivel de seguridad, el proceso desperdiciador de tiempo y la baja eficiencia de expresión vectores4,5. Con respecto a la mejora de la BCG, es necesario un enfoque alternativo para mejorar la inmunogenicidad sin necesidad de alteraciones genéticas inciertos.

En este estudio, presentamos una nueva estrategia para la visualización de proteínas recombinantes de interés en la superficie celular de BCG que se basa en la interacción bien conocida de alta afinidad de avidina con biotina. Este enfoque permite el accesorio rápido y reproducible avidina recombinante de proteínas de fusión en la superficie de biotinilado BCG, que facilita las manipulaciones amplia de BCG para lograr un perfeccionamiento máximo de su eficacia manteniendo su excelente seguridad registro, observado durante décadas de uso.

Avidina afinidad para la biotina es extremadamente alta (Kd = 10−15 M) y una vez formado, el complejo biotina-avidina es muy estable y sólo puede ser interrumpido bajo desnaturalizar condiciones6. Sin embargo, para este tipo de interacción para servir como una alternativa de método de transferencia génica, exposición a largo plazo pero reversible de proteínas recombinantes se requiere. Por lo tanto, aquí presentamos una avidina monomérica de baja afinidad (Kd = 10−7 M) que conduce a la liberación reversible de la proteína de la superficie decorada BCG una vez ingerido dentro de las células presentadoras de antígeno. Con el fin de proporcionar una prueba de concepto, probamos este método utilizando una proteína quimérica de avidina monomérica corresponde a un antígeno de sustituto derivado de ovoalbúmina (OVA)7,8. Los resultados mostraron que la superficie de la célula de BCG puede ser fácilmente y rápidamente decorada con proteínas de fusión de avidina monomérica y que esta Unión a la superficie de la BCG es estable y reproducible sin cambios perceptibles en el crecimiento bacteriano y la supervivencia. También, encontramos que la BCG con avidina monomérica con óvulos (AviOVA) puede inducir una respuesta inmune similar a la inducida por la BCG genéticamente expresando el mismo antígeno tanto in vitro como in vivo. Esta tecnología de pantalla reversible de proteínas de interés en la superficie bacteriana es un efectivo reemplazo de enfoques de transferencia génica tradicional y puede proporcionar una plataforma para grandes manipulaciones de BCG y otras aplicaciones de vacuna desarrollo.

Protocolo

Todos los animales fueron mantenidos según los protocolos aprobados por los comités de uso en la Universidad de British Columbia y de Animal Care. Experimentos fueron aprobados por los comités de uso y de cuidado Animal y realiza de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre directrices de cuidado Animal. El número de bienestar animal seguro es A11-0247.

1. generación de proteínas de fusión de avidina monomérica expresando plásmidos

  1. El clon avidina monomérica secuencia12 en plásmido pDEST17 entre los sitios "CTC" y "GAA" que corresponde a 133-134bp. (es decir, entre la 6-histag y el sitio de recombinación pDEST17 Attr1 ) para obtener p17-Avi.
    Nota: A continuación se muestra la secuencia de ADN monomérica avidina. En caracteres en negrita se muestran las tres mutaciones en avidina de tipo salvaje para obtener avidina monomérica.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    ACAAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg CAAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. Diseño de primers flanqueados con sitios AttB1 y B2 Attcorrespondiente a OVA polipéptido757-1035 (-Ab- y H-2_Kb-restringido epitopos) secuencia de ADN. Secuencias de la cartilla son: Attb1-OVA
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT y Attb2-OVA
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 y b2 Attlas secuencias están en negrita).
    1. Amplificar por PCR OVA polipéptido757-1035 secuencia de la DNA con los iniciadores utilizando el plásmido pUC57-OVA como plantilla.
    2. Clonar los productos PCR en pDONR 221 a través de una site-specific en vitro recombinación reacción (p. ej., BP Clonase) para obtener óvulos pDONR.
  3. Transferir el gen de interés en p17-Avi usando la reacción en LR Clonase a obtener p17-Avi-OVA.
    Nota: Para detalles de clonación de recombinación BP y LR, consulte el manual del fabricante.

2. expresión de proteínas de fusión monomérica avidina, purificación y Refolding

  1. Transformar p17-Avi-OVA plásmido en e. coli BL21 e inducir 250 mL de e. coli BL21 cultura con IPTG (0,1 M) de 3 h a 37 ° C.
  2. Lisis de bacterias y solubilización de los cuerpos de inclusión
    1. 250 mL de cultura BL21 inducida de pellets por 30 minutos de centrifugación a 4.000 x g y a 4 ° C.
    2. Recoger pastillas en 10 mL de tampón de lisis (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidina-HCL, pH 1.5-2.5) e incubar durante 15 min a 95 ° C. Incubar durante una noche a temperatura ambiente en un agitador.
    3. Centrífuga de 30 min a 15.000 x g y 4 ° C y recoger sobrenadante.
  3. Purificar el Avi-OVA de sobrenadante (fracción de cuerpos de inclusión solubilizados) usando columnas de Ni-NTA.
    1. Diluir 1:2 de cuerpos de inclusión con tampón de lisis.
    2. Utilizar 4 mL de resina Ni-NTA por 250 mL derivadas de cultivo de cuerpos de inclusión.
    3. Lavar 3 x con 10 mL de tampón de lisis (pH 7.0).
    4. Procederá a la elución con 10 mL de tampón de elución (lysis buffer pH 7.0 con imidazol de 250 mM).
  4. Replegar proteínas eluídas por dilución gradual (1:10) y rápida Vortex en buffer Tris (pH 7,5) que contiene 1 mM TDT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0.5 mM Tween 80, arginina de 500 mM y 200 mM NaCl durante 30 min a temperatura ambiente.
  5. -Sal y cambio de tampón replegado proteína de tampón Tris en PBS con concentradores de proteínas según los protocolos del fabricante.
  6. Retirar agregados por centrifugación durante 30 min a 3.500 x g y a 4 ° C y guardar alícuotas de proteína soluble a-20 ° C.

3. Biotinilación de superficie de la célula de BCG

  1. Crecer BCG en Middlebrook 7H 9 caldo con 10% OADC (ácido oleico, albúmina, solución de dextrosa) y 0.05% de Tween 80 a 37 ° C en una plataforma del agitador a 50 rpm hasta OD = 0.5-1.
    Nota: BCG es un patógeno de nivel 2 de bioseguridad y todos los experimentos sobre BCG deben realizarse en un gabinete con equipo de protección personal adecuado de bioseguridad.
  2. Lavar 109 BCG 3 veces con 500 μl de PBS libre de endotoxina helada más 0,1% Tween80 (SAFT) (pH 8.0). Suspender el sedimento de la BCG en PBS libre de endotoxina estéril.
  3. Inmediatamente antes del uso, preparar 1 mL de biotina de Sulfo-NHS SS de 10 mM en agua estéril filtrada.
    1. Incubar las bacterias con 1 mL de 0,5 mM de biotina Sulfo-NHS SS a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  4. Etiquetado bacterias 3 veces con 500 μl de helado frío SAFT para quitar no reaccionó Biotinilación reactivo de lavado.
    1. Vuelva a suspender el sedimento en 1 mL de SAFT.
  5. Para evaluar la eficiencia de Biotinilación, mancha 108 biotinilado BCG con estreptavidina-FITC (1: 100, 25 μl) a temperatura ambiente durante 20 minutos.
    1. Incubar bacterias teñidas en 1 mL de 2% PFA por 20 min a temperatura ambiente y luego examinar niveles de Biotinilación por análisis de citometría de flujo.

4. fenotipo de biotinilado micobacterias: crecimiento y supervivencia

  1. Crecen las cepas de BCG en Middlebrook 7H 9 caldo con 10% OADC (ácido oleico, albúmina, solución de dextrosa) y 0.05% de Tween 80 a 37 ° C en una plataforma del agitador a 50 rpm.
    1. Anotar la densidad óptica (OD600) de la cultura bacteriana durante un período de 8 días.
  2. Utilizar BCG-Luc (previamente descritos9) para detectar la supervivencia de las bacterias en los macrófagos.
    1. Infectar células 264.7 con biotinilado BCG-Luc (MOI 10:1) o sin tratamiento BCG-Luc (control) y se incubó a 37 ° C durante 48 horas período de tiempo.
    2. Monocapas de células de lavado y luego lyse con 0,025% de SDS para liberar las bacterias ingeridas.
    3. Medir la producción de bioluminiscencia con sistema de ensayo de luciferasa y luminómetro.
      Nota: La señal de luminiscencia es indicativa de la viabilidad bacteriana. Por favor consulte el manual del fabricante para detalles de ensayo de luciferasa.

5. Unión de la proteína avidina-Fusion Monomeric biotinilado BCG superficie

  1. Mezclar 5 x 108 biotinilado BCG con Avi-proteína (final de 10 μg/mL en PBS-T) por 1 h a temperatura ambiente en la plataforma de la coctelera.
  2. Bacterias de lavado 3 veces con 500 μl de SAFT frío helado y tinción con anticuerpos anti-avidina (Ab) (dilución 1: 100, previamente descritos10) por 20 min a temperatura ambiente y luego con FITC conjugan anti-conejo de cabra IgG Ab en las mismas condiciones.
  3. Lave las bacterias 3 veces con 500 μl de Saft y analizar mediante citometría de flujo para evaluar la extensión de la decoración de la superficie.

6. liofilización de micobacterias

  1. Biotinylate bacterias según paso 3.1-3.4 y capa biotinilado bacterias con OVA Avi según el paso 5.1.
  2. Alícuota biotinilado y bacterias recubiertas (108), lavar con PBS y resuspender en medio de la liofilización de 0,5 mL (medio de Sauton 25%, 75% H2O y 1.5% Na-glutamato).
  3. Transferir las bacterias a los frascos de cristal y congelar en un congelador de-80 ° C durante la noche.
  4. Liofilizar frascos de vidrio rellenos y congelados durante 24 horas utilizando una secador de la helada.
  5. Almacenar las muestras secadas a temperatura ambiente y reconstituir en PBS cuando sea necesario.
  6. Repita el paso 3.5 evaluar Biotinilación y estabilidad de la capa de superficie.

7. fagocitosis ensayo

  1. Crecer células de macrófagos RAW 264.7 en platos de cultura de diámetro de 10 cm en DMEM medio conteniendo 5% FCS, 1% por cada uno de L-glutamina, HEPES, aminoácidos no esenciales y penicilina y estreptomicina hasta 70-80% de confluencia.
  2. 2 x 106 RAW 264.7 células macrófagos en una placa de 6 pozos de la semilla. Permitir que las células se adhieran durante la noche a 37 ° C y 5% CO2.
  3. Generar DsRed BCG (previamente descritos9) decorado con Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) según pasos 3.1-3.4 y 5.1.
  4. Infectar células RAW con DsRed BCG-Avi-OVA o no tratada DsRed BCG en MOI 20:1 durante 24 h a 37 ° C.
  5. Lavar las células 3 veces y trypsinize usando 1 mL de tripsina 0.25% a 37 ° C por 10 min para eliminar las bacterias parcialmente independiente.
  6. Fijar en 2,5% PFA en PBS durante 20 min a temperatura ambiente.
  7. Lavar 3 veces con PBS y analizar mediante citometría de flujo.

8. intracelular tráfico de huevos decoradas biotinilado BCG en macrófagos

  1. Microscopía de fluorescencia
    1. 3 x 105 RAW 264.7 células macrófagos en cubreobjetos en un plato 24-well de la semilla. Permitir que las células se adhieran durante la noche a 37 ° C y 5% CO2.
    2. Infectar las células del macrófago con micobacterias (MOI 10:1) en los medios de mantenimiento sin antibióticos a 37 ° C y 5% CO2 4 a 24 h.
    3. Lavar las células y trypsinize para quitar superficie adjuntas, no ingiere bacterias como en el paso 7.5.
    4. Fix infectada células en 2.5% PFA en PBS durante 20 min a temperatura ambiente seguido por 3 lavados con PBS.
    5. Permeabilizar las células en buffer de bloqueo/permeabilización (0,1% Tritón X-100, BSA 3% en PBS) durante 20 min a temperatura ambiente.
      1. Anticuerpo específico uso de interés (por ejemplo, conejo Ab anti-avidina) 10 μg/ml en la permeabilización buffer por 20 min a temperatura ambiente seguido de anticuerpo secundario (p. ej., IgG de anti-conejo FITC-cabra) durante 20 minutos.
    6. Lavar las células 3 veces con PBS, una vez con agua y el montaje de diapositivas 10 μL de medio de montaje acuoso para minimizar el fotoblanqueo de fluorescencia.
    7. Examinar diapositivas mediante microscopía confocal digital utilizando un microscopio de epifluorescencia equipado con 63 x / 1.4 objetivo Plan-Apochromat. Grabar imágenes con una cámara digital acoplada al software del microscopio.
  2. Immunogold de tinción y la microscopia electrónica
    1. 2 x 106 RAW 264.7 células de macrófagos en las placas de 6 pozos de la semilla.
    2. Fijar los macrófagos BCG infectado con 4% PFA durante 4 horas en temperatura ambiente.
    3. Lavar las muestras dos veces con PBS.
    4. Integrar muestras en agarosa de bajo punto de fusión de 4% y deshidratar en etanol al 70%.
    5. Transferir las muestras de resina acrílica y polimerizar a 50 ° C.
    6. Cortar 60 secciones nm con un micrótomo y recoger secciones en rejillas de níquel.
    7. Etiquetar las muestras con anticuerpos de avidina de 10 μg/mL durante 1 hora a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche en solución de incubación (BSA PBS y 0,1%) y luego lavar con incubación solución conjugados con oro F(ab')2 de ultra pequeña cabra-anti-rabbit IgG (1/20) por 1 h en la sala de temperatura en la solución de incubación.
    8. Lávese las secciones en agua destilada, en glutaraldehído al 2% de la mancha, lavar, secar al aire y examinar con microscopio electrónico.

9. animales vacunas y procesamiento de órganos

Nota: Todas las medidas deben realizarse en un gabinete de bioseguridad.

  1. Biotinilado de paso proteína revestida y bacterias a través de aguja de1/2G 27 10 veces a hacer suspensión unicelular.
  2. Tomar 1 x 106 bacterias en 100 μL de PBS libre de endotoxinas e inmunizar a ratones C57BL/6 femeninos (-Ab, H - 2 Kb, 5-6 semana de edad) por vía subcutánea en el pescuezo del cuello.
    1. Inyectar a ratones control con 100 μL de PBS solo.
  3. Eutanasia a ratones inmunizados 20 días post-vacunación por CO2 inhalación seguida por dislocación cervical.
    1. Aislar el bazo y la transferencia en Medio RPMI.
  4. Puré del bazo a través de un tamiz celular de 70 μm con un émbolo de la jeringa de 5 mL.
    1. Lavar con 5 mL de RPMI. Centrífuga (800 x g, 3 min) para aislar una suspensión unicelular.
    2. Agotar los RBC con kit de selección positiva de biotina de ratón con células de biotina-Ter119/eritroides Ab.
    3. Centrifugar y resuspender las células en 10 mL de RPMI completo (10% FCS, 1% L-glutamina, 1% de penicilina, estreptomicina de 1% y 50 μM 2-ME).

10. I-Ab tetrámero de tinción para determinar las frecuencias de específica de antígeno CD4+ las células T y citoquinas intracelulares tinción para determinar frecuencias de específica de antígeno T las células liberando citoquinas en los animales inmunizados

  1. La tinción de tetrámero
    1. Esplenocitos de ratones inmunizados (~ 20 x 106 células) conjugado con PE-Aby control de la mancha-tetrámeros de323-339 de OVA (dilución 1/12,5) por 1 h a 37 º C en tampón de unión (PBS y 0,1% NaN32% FCS).
    2. Añadir AF647 CD4 Ab (1:25) y 7-AAD (para detectar las células muertas) de esplenocitos por 20 min a temperatura ambiente.
    3. Análisis de muestras por citometría de flujo.
    4. Adquirir 500.000 eventos en la región positiva de CD4 para determinar la frecuencia de eventos positivos tetrámero.
      Nota: Esplenocitos totales están definidos por lo blot dot SSC/FSC, células vivas por la exclusión de los eventos positivos 7-AAD y subconjuntos CD4 por bloquear eventos positivos AF647.
  2. Frecuencia de antígeno específicos citocinas intracelulares liberando las células T
    1. Transferencia de aproximadamente 1 × 107 esplenocitos en 4 mL de Medio RPMI completo en placas de seis pocillos con o sin OVA recombinante (10 μg/mL) e incúbelo durante 16 h.
    2. Tratar las células con Brefeldin A (1:1, 000) para un adicional 5 h.
    3. Lavar con PBS y del cytokine intracelular tinción como sigue:
      1. Tinción de muestras de células CD8 PE o PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 en tampón de unión) en temperatura ambiente durante 30 minutos.
      2. Fijar en el 4% PFA a temperatura ambiente durante 20 minutos.
      3. Permeabilizar con solución de permeabilización, según las instrucciones del fabricante.
      4. Lavar las células y la etiqueta con conjugado AF647 IFN-γ Ab (1:50) por 20 min a temperatura ambiente.
      5. Lavar las células y sometidos a análisis de citometría de flujo como se describió anteriormente.

Resultados

Con los procedimientos generales descritos anteriormente, se examinó la viabilidad de Biotinilación superficial de BCG y la decoración con antígenos de sustituta OVA. La inmunogenicidad de la BCG modificada entonces fue probado in vivo. La superficie bacteriana fácilmente fue marcada con biotina para la visualización rápida de antígenos quiméricos avidina sin ningún cambio perceptible en fenotipos bacterianos. El BCG modificado resultante se ingiere eficientemente por l...

Discusión

Reportamos en este estudio un enfoque no genéticos para la visualización rápida y eficaz de proteínas exógenas en superficie de BCG para añadir antígenos específicos o propiedades funcionales específicas previstos mejorar eficientemente la inmunogenicidad de la bacteria. Hemos demostrado que la superficie de la célula de BCG podría ser fácilmente biotinilado para decoración instantánea de la superficie con proteínas de fusión de la avidina. El procedimiento total puede realizarse dentro de 2 h, mientras q...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Dr. R Stokes para la cepa BCG Pasteur y Talal A. para soporte técnico. También agradecemos GenScript ayuda con síntesis del gene.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Endotoxin-free RPMI 1640StemCell Technologies 36750
Sulfo-NHS SS biotinThermo Fisher 21328
FITC-conjugated streptavidinSigma-AldrichS3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer MBL International TS-M710-1
7-AADBD Pharmingen559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin Clontech635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4BD Bioscience 557681
AF647 rat anti-mouse IFN-gBD Bioscience 557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-EBD Bioscience 562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4BD Bioscience 552775
PE rat anti-mouse CD8 AbBD Bioscience 561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kbBD Bioscience562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibodyThermo Fisher31635
AF 647 rat anti-mouse CD4BD Bioscience 557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgGElectron Microscopy Sciences25100
Middlebrook 7H9 brothBD Diagnostic Systems271310
OADCBD Diagnostic SystemsB11886
Tween 80Sigma-AldrichP1379
RAW 264.7 murine macrophage cell linesAmerican Type Culture Collection
pDEST17 plasmid Invitrogen11803012
pUC57-OVA plasmid GenScriptSD1176
BP clonase Invitrogen11789020
LR clonase Invitrogen11791043
pDONR221 plasmidInvitrogen12536017
Ni-NTA columns Qiagen31014
Pierce protein concentrators Thermo Fisher 88527
FlurosaveCalbiochem-Novabiochem345789
Axioplan II epifluorescence microscopeCarl Zeiss Inc
CCD digital camera Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope FEI CompanyG2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer Thermo Fisher 87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit StemCell18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibodyBioLegend116203
Brefeldin ABD Pharmingen555029
Cytofix/Cytoperm kit BD Pharmingen554714
Bright-Glo Luciferase assay systemPromegae2620
Turner Biosystem luminometer PromegaTD-20/20
Leica EM UC6 microtome Leica MicrosystemsUC6
Novalyphe NL 500 freeze dryerSavant Instruments NL 50
Wheaton boroscilicate glass vialsWheaton VWR 66011-675

Referencias

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