JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede insan myometrium ex vivo kasılmalar ve ilaç keşif. bunların uygulama çalışmaya deneysel protokoller Uyuşturucu adaylarını veya bu teknik myometrial fizyolojisi ve roman araştırma probları farmakolojik verileri doğrulamak için de patofizyolojisi anlayışı geliştirmek için kullanılır.

Özet

Keşif ve roman ilaç bileşikleri veya biyokimyasal probları karakterizasyonu sağlam ve fizyolojik olarak ilgili tahlil sistemlerde güveniyor. Ex vivo myometrium contractility ölçmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Bu tahlil faktörleri araştırmak için kullanılabilir ve söz konusu olursa molekülleri myometrial daralma ve onların eksitatör veya inhibitör eylemleri belirlemek için modülasyon ve dolayısıyla onların tedavi potansiyel içinde vivo. Biyopsi sezaryen teslimat ile aydınlatılmış onam geçiren kadınlar elde edilir. Myometrium ince şeritler disseke, kirpik ve 1 mL organ banyoları 37 ° C'de fizyolojik serum fizyolojik solüsyonu ile superfused içinde bir güç çevirici bağlı Şeritler set gerilim altında 2-3 saat içinde kendiliğinden kasılma geliştirmek ve saatlerce stabil (> 6 h). Şeritler de konsantrasyon bağımlı modülasyon kasılma sıklığı neden, oksitosin ve vazopressin, endojen hormonlar tarafından zorla ve süresi, daha yakından benzer emek kasılma gibi sözleşme için teşvik. Bu nedenle, bilinen ve yeni ilaç müşteri adayları etkisi spontan ve agonist indüklenen kasılmalar üzerinde test edilebilir.

Bu iletişim kuralı özellikle bu tahlil insan myometrial daralma çeşitli parametreler üzerindeki etkileri ölçerek bilinen ve yeni aracıları potens belirlemek için nasıl kullanılabileceğini ayrıntıları. Biz oksitosin ve V1a reseptör antagonistleri, atosiban ve SR49059 örnek olan oksitosin ve vazopressin indüklenen kasılmalar inhibe ve tamamlayıcı ve doğrulamak için bu yöntemi nasıl kullanılabileceğini gösteren bilinen bileşikler olarak kullanın farmakolojik verilerini deneyleri--dan hücre-esaslı ilaç geliştirme yardım etmek için. Oksitosin ve vazopressin göre roman agonistler etkileri de karakterize edilebilir. Oksitosin örneği kullandığımız iken / vazopressin sistem, bu yöntem de olabilir diğer reseptörleri ve rahim kasılma ve gevşeme insan rahim fizyolojisi ve patofizyolojisi anlayışı ilerletmek için bir rol oynamaktadır iyon kanalları çalışırdım.

Giriş

İlaç keşif amacı roman, güçlü ve etkinleştirme veya hücresel sinyal yolları inhibe bir terapötik yanıt üretmek çok seçici ligandlar üretmektir. Bu hangi kurşun bileşikleri ile güvenilir, sağlam ve ilgili sonuçlar1test etmek bir uygun tahlil sistemi gerektirir. Ligand-reseptör bağlama ve fonksiyonel deneyleri gibi farmakolojik teknikleri kez kapaklı hücre tabanlı sistemleri, hangi başka türlü-mevcut2olmaz overexpress reseptörleri için tasarlanmış kullanır. Bu teknikler değerli bilgiler sağlamak için reseptör Farmakoloji ve erken ilaç geliştirme iken, elde edilen veriler doğru vivo senaryo yansıtmıyor olabilir. Bu nedenle hücre tabanlı deneyleri farmakolojik veri aynı zamanda fizyolojik ilgili modellerinde doğrulanır önemlidir.

Rahim düz kas (myometrium) efface ve dilate serviks ve fetüsün3sağlayan emek sırasında kasılmalar için sorumlu olan rahim kas tabakası kabul ettiğiniz anlamına gelir. Myometrium spontan oluşturulmuştur; 4sözleşme için hormonal veya gergin giriş gerektirmez. Kasılmalar getirdi tarafından kendiliğinden depolarizasyon myometrial hücre zarının açılması gerilim ile çalışan Ca2 +yol açar-kanalları (L-tipi kanal) ve akını Ca2 + 5hücre içine. Kalsiyum kompleksleri ile calmodulin ve hangi sırayla çapraz köprü döngüsü oluşumu aktin ve daralma ile etkinleştirme myosin phosphorylates myosin hafif zincir kinaz etkinleştirir. Gevşeme genellikle myosin myosin fosfataz ve Ca2 + yolu ile onun ekstrüzyon hücre ve/veya (SR)5,6 sarcoplasmic retikulum iyon konsantrasyonu bir azalma de-fosforilasyon tarafından aracılık ettiği ,7.

Myometrial işlevi ve myometrial kökenli8 dönüştürülmüş veya ölümsüzleştirdi hücre üretimi için in vivo iç ve dış tocography ve intrauterin basınç Kateterler, fonksiyon bozukluğu eğitim için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir ,9,10,11,12. Hücre kültür sistemleri bir madde hücresel düzeyde hareket edebilir olup olmadığını algılayabilir iken şeritler organ banyosu içinde dokuların farmakolojik reaktifler bütün dokuların fonksiyonel yanıtlarını ölçmek için araç olarak kullanılabilir. Geleneksel organ Banyosu genellikle Holding arasında 5 ve 50 mL fizyolojik serum (PSS) yeteneğine sahip olan bir büyük ısıtmalı cam dolu bir yer. Bu büyük Odaları içinde şeritler genellikle oksijen ve PSS geniş hacimli havalandırma gerekir. Şeritler doku disseke ve Banyo odası içinde askıya ve ölçen gerginlik, değişimler gibi bir kasılma sırasında bir güç çevirici bağlı. 17,18şeritler, myometrium insanlar ve hayvanlar dahil olmak üzere, eskiden şiling şimdi domuz13, fare14, sıçan15, tavşan16ve diğerleri, bir araştırma gruplarının sayısını incelemek için kullanılan myometrial fizyolojisi ve patoloji, preterm ve işlevsel olmayan uğraşları da dahil olmak üzere ilgili birçok soru. Örneğin, myometrial şeritler düzenleyen ve myogenic etkinliği19,20,21değiştirmek, organel işlevi SR22gibi faktörler tanımlamak için kullanılan yanı sıra İyon modülatörler soruşturma myometrial Fizyoloji rolünü belirlemek için23,24,25,26, pompalar ve değiştiriciler27 kanalları.

Bu ex vivo teknik doku daralma performans değerlendirilmesi ve farklı ajanlar doğrudan etkisi daralma parametrelere ölçülecek sağlar dahil olmak üzere, kasılma gücü (gücü), sıklığı ve süresi, hem de entegrasyon toplam çalışma yapılan (ortalama ayrılmaz kuvvet ya da AUC eğri altındaki alan) bir dizin oluşturmak için bu değerleri. İzole doku şeridi hazırlama birden fazla hücre tipi bir model teşkil eder gibi bütün doku fizyolojik tepki ölçülebilir. Organ banyosu ve izole doku şerit bu nedenle hücre kültür iş ve tüm hayvan arasında köprü sağlayan yararlı bir araç vardır /vivo içinde çalışma. Bu nedenle, ilaç bulma, onların eksitatör açısından yeni ajanların etkileri alanında (Yani, uyarıcı) veya inhibitör (Yani, gevşeme) potansiyel vivo içinde daha yakından değerlendirildi. Bu teknik oksitosin ve V1agelişiminde başarıyla kullanıldı-(OTR ve V1aR) reseptör antagonisti atosiban preterm doğum kasılmaları inhibe ve erken doğum gecikme için bir tocolytic ajan olarak. Atosiban üzerinde myometrial şeritler in vitro test bulundu antagonisti oksitosin (OT) önemli ölçüde azaltmak mümkün-indüklenen kasılmalar28,29,30. Önemlisi bu çalışmalar atosiban translasyonel değerini doğrulamak için yardımcı oldu ve prototip, veri almak için klinik çalışmalarda31,32,33' e,34 ileterek oluşturulan . Atosiban, Avrupa'nın emek geciktirmek için Şimdi seçim uyuşturucu olarak yaygın olarak kullanılır. Benzer kanıtı-of-concept çalışmalar sonrası kanaması35,36,37önlemede tedavi potansiyel göstermek oksitosin analog carbetocin için yapılmıştır. Bu tahlil ile şu anda geliştiriliyor diğer kurşun bileşikleri retosiban (GSK221149A)38 ve nolasiban (yayınlanmamış veri) içerir. Bu yöntemler aynı zamanda başarılı bir şekilde hasta grupları39,40,41,42,43,44arasında, karşılaştırmak için kullanılmıştır 45,46,47 ve içi-türler farklılıklar için inceleyin.

Burada izole ex vivo doku şeritler hamile insan myometrium tamamlayıcı ve farmakolojik veri--dan hücre-esaslı deneyleri elde doğrulamak için bu yöntemi nasıl kullanılacağını göstermek için küçük (1 mL) özel yapım organ banyosu içinde nasıl kullanılacağını açıklar . Biyopsi büyük ölçüde önceden işçi seçmeli sezaryen (CS) teslim olarak planlanan cerrahi vardır ve bu nedenle biyopsi toplamayı zamanlar, myometrium kolay erişimi kolay ve dokularda herhangi birine maruz kalmış değil geçiren kadınlardan elde edilmiştir uterotonic uyarıcı ya da ameliyat öncesi gevşetici. Ancak, biyopsi de plansız (Acil) CS teslim tamamen hasta kabul için yeterli zaman sağlayan emek geçiren kadınlardan elde edilebilir. Örnekleri üst segment48,49edinmek mümkündür ancak çoğu biyopsi cerrahi kesi yerinde rahim alt segmentten ameliyat sırasında elde edilir. Vajinal doğumu takiben birkaç durumda punch biyopsi plasental yatağı da50elde edilmiştir. Ancak, bu en geleneksel rota değildir ve myometrial doku alındı küçük miktarıdır. Sigara hamile myometrium benign jinekolojik koşulları için histerektomi ameliyatı öncesi ya da sonrası menopoz kadın elde edilebilir. Tam kalınlıkta biyopsi örneklenen sonrası patoloji muayene, serviks, uzak alt gövde üzerinden ve myometrium seröz ve endometrium yüzeyler kaçınarak rahim duvarı ortasından alınır.

Protokol

Uygun kurumsal, etik inceleme kurulu ve güvenlik onay insan doku ile deneyler için herhangi bir insan kurcalayarak çalışmaya başlamadan önce eklenmiş olması gerekir. Bütün iş burada alınan onay yerel araştırma Etik Komitesi açıklanan (Liverpool Doğu, REC Ref 10/H1002/49) ve araştırma ve geliştirme departmanı, Liverpool kadın hastane ve Liverpool Üniversitesi Kurumsal inceleme kurulları.

Not: Bu protokol için açıklanan tüm biyopsiler katılmaya çalışan öncesi emek seçmeli CS teslim Liverpool kadın hastane ve her kadın verdi aydınlatılmış onam yazılı geçiren kadınlardan elde edilmiştir.

1. çözümler

  1. Değiştirilmiş Krebs fizyolojik serum çözüm (PSS) ile aşağıdaki kompozisyon hazırlamak: 154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 7,8 mM glikoz, 10.9 mM HEPES ve 2.0 mM CaCl2.
    Not: yapılacak birim doku banyoları operasyonda, akış hızı (1 mL/dk) sisteminin sayısına göre belirlenir ve denge ve Silinerek geçiş süresi dahil olmak üzere deneme uzunluğu tahmini.
  2. PH 7.4 4 M NaOH kullanarak için ayarlayın.

2. doku banyo kurmak

  1. Doku banyo sistem rezervuar ~ 45 ° c 55-60 ° C'de ayarla dolaşım bir su banyosu kullanarak önceden ısıtmak
    Not: ~ 45 ° C, hangi aracılığıyla, çalışan Peristaltik hortum PSS ile ısı değişimi için izin sonra doku banyoda PSS 37 ° C'de sağlar aparatı tabanındaki su deposu ısıtılır Sıcaklıklar ayarlamak için biraz ayar PSS doku banyo sıcaklığı 37 ° c ulaşır emin olmak için gerekli olabilir Bu kullanılan ve akış oranları ayarlama aparatı bağlı olarak değişir.
  2. El ile amplifikatör, veri toplama ve kayıt sistemi ve pompa modellerine dahil olmak üzere herhangi bir diğer gerekli ekipman üzerinde geçiş.
  3. Silindirler Peristaltik pompa kafasının etrafında her Peristaltik besleyici tüp (banyo başına bir tüp) konumlandırın. İstinat duraklı ve sıkıştırma cams sıkma ve tüpler çevresinde tuşları kilitleme güvenli. Peristaltik besleyici borular ücretsiz uçları PSS bir 1 L kap yerleştirin ve pompa sürekli doku banyo sıvı için PSS izin başlayın.
  4. Pompa modellerine düzgün olarak çalıştığını ve böyle banyo akışına oranı kaldırma oranı eşittir çözüm banyoda düzeyini sabit olduğundan emin olun. PSS kademede doku banyo banyoda modelleyici'nın kil kullanarak emme borusu derinliği işleyerek ayarlanabilir.
  5. Bir bilinen ağırlık (1 millinewton (mN, kuvvet birimi) eşdeğer) dönüştürücü kanca üzerine yerleştirip satın alma yazılımı tarafından tespit saptırma kayıt kuvvet Transdüserleri kalibre.
    Not: kaydedilen değerler otomatik olarak herhangi bir daha fazla dönüşüm sırasında çözümleme yapmak için ihtiyacı inkâr mN dönüştürülür öyle ki yazılımda değerleri ayarlanabilir. Kuvvet Transdüserleri kalibrasyonu doku montaj önce gerçekleştirilmelidir.

3. doku hazırlık ve şeritler diseksiyon

  1. Hamile insan myometrium (1-2 cm3) biyopsi bebek ve plasenta doğumdan sonra CS toplamak. Perimetrium (rahim dış serosa katman) ve decidua (rahim iç tabakası) mevcut olan (tipik) tam kalınlıkta biyopsi alın. Sadece myometrial doku (Merkez kas Katmanı) kullanın. Şekil 1A-Bbakın.
    1. Bu doku myometrial contractility değiştirebilirsiniz maddeler üretmek bilinmektedir olarak (temel) decidua ve herhangi bir yapisan fetal membranlar (varsa) çıkarın.
      Not: ameliyatta, örnekleri Hanks dengeli tuz çözüm (HBSS) veya taze PSS yerleştirilir ve 4 ° C'de depolanan İdeal olarak çalışmalar koleksiyon ile depolama 4 ° C5118 h sonra contractility yok zararına göstermiştir ancak dokuların cerrahi, 12-16 saat içinde kullanılmalıdır. Doku canlılığı ve işlev 4 ° C'de uzun süreli depolama sonra onaylamak için uygun kontrollerin yapılması gerekir Buraya örnekleri daha düşük rahim segmente kesi sitenin üst kenarından ve üst segmentteki değil alınır. Rahim alt ve üst kesimleri benzer şekilde48sözleşme göstermiştir, bu nedenle alt segment biyopsi üst segment myometrial aktivite iyi bir yansıması olarak kabul edilir.
  2. Diseksiyon alanı ve gerekli aletleri de dahil olmak üzere hazırlamak: geniş diseksiyon makası, küçük kenasen diseksiyon makası, iki diseksiyon forseps, diseksiyon iğne ve alüminyum doku klipleri, çevresinde bir diseksiyon mikroskop ile sabit her ikisi ve yakınlaştırma büyütme.
  3. Biyopsi örnek üzerinde bir açık Silastik tabanlı diseksiyon yemek (bkz. Tablo reçetesi) dolu PSS ve dikkatli bir şekilde yer yönlendirmek biyopsi serosa ve decidua kenarlar tanımlanır böylece şekil 1B.
  4. İğne biyopsi çanak üssün güvenliğini sağlamak için kullanın. Doku PSS ile diseksiyon süreci boyunca susuz kalır emin olun.
  5. El ile mikroskop ışık kaynağında geçin ve doku myometrium ücretsiz skar dokusu, serosa, decidua ve herhangi bir yapisan fetal membranlar varsa bölgelerinde tanımlamak için 10 x büyütme, mikroskop altında incelemek.
  6. Künt diseksiyon iki uçak veya kas yaprak iki bitişik doku katmanları ayırmak için geniş diseksiyon makası kullanarak gerçekleştirin.
    Not: Sık sık ayırma başlamak için doku katmanları arasında küçük bir cep bulmak daha kolay olur ama 'cep' için yanlış olabilir biyopsi kenarındaki küçük gemiler önlemek için özen göstermelidir.
  7. Güvenli için iğneler doku her köşesinde dissekan yer. Kas kas bölgeler için seyir paralel olarak çalışan lifleri ile sayfaları inceleyin.
    Not: Bölge kimlik küçük kılcal doku ile Ventriküler yönünü takip ederek destekli. Yumuşak doku kenarında çekerek aynı zamanda hangi lifler seyahat yönünü tanımlamaya yardımcı olabilir.
  8. Doku şeritler kesip ~ 2 mm geniş x 8 mm uzun x 1 mm kalın kas lifleri küçük diseksiyon makası kullanarak yönü ile uyumlu boyuna ekseni boyunca.
    Not: Doku kucaklayabilmek için zarar görmemesi için ilk kesme kenar tarafından özen göstermelidir.
  9. Deney için gerekli şeritler sayısını incelemek için işlemi yineleyin.
  10. Her şerit düzeltmek ve streç üzerinde dikkat değil çekici çanak, doku güvenliğini sağlamak için her iki uçta da pin.
  11. Aralarında doku alüminyum doku klipleri her sonunda ekleyin ~ 5 mm uzun ve dikkatli bir şekilde herhangi bir aşırı doku (şekil 1 c) sadece... kes gitsin.
  12. PSS montaj için hazır dolu bir temiz tabak aktarın.

4. Hamam ve dokularda montaj

  1. Şeritler deneysel doku hamama aktarın. Şeritler yatay yerine dikey olarak daha mount (olduğu gibi geleneksel organ Hamam) (şekil 2B).
  2. Her şerit bir ucunu tarafından küçük doku daralma ölçer, güç dönüştürücü için iliştirin ve sabit bir diğerine her ikisi de doku odası içinde kanca.
    Not: ~ 1 mL şeritler tamamen banyoda batık emin olmak için yeterli büyüklükte doku Bath kapasitesidir.
  3. Her kanca banyoda temelini şeritler olduğundan emin olun.
  4. Kayıt yazılımı yazılım simgesine çift tıklayarak açın.
  5. Bu görünümde kanal penceresinde kayıt her kanal için ayarlamak.
  6. Sağ tıklayarak Y ekseni, seçme 'ölçek' ve giren minimum ve maksimum değerleri 0 ve 10, sırasıyla 0-10 V (0-10 mN yazı kalibrasyon eşdeğer) arasında okumak için Y ekseni ölçeği ayarlayın. 'Tamam' ı seçin. Her kanal kayıt için işlemi yineleyin.
  7. 'Kaydet' yazılım canlı kayıt başlamak için tuşuna basın.
    Not: Eğer şeritler her kanca tabanına güvenli değil, onlar kayıt üzerinde 'biraz' olarak görünür kasılması sırasında kayabilir. Set gerginlik değişecek ve bu nedenle kasılmalar sonrası kayma farklı olabilir.
  8. Doku el ile her dönüştürücü için bağlı micromanipulators çevirerek her banyoda ger. Yukarı doğru doku hareketi satır taban çizgisinden izleyin ve temel gerginlik 0.2 g (~ 2 mN) ulaşıncaya kadar micromanipulators açmak devam edin.
    Not: Doku hemen (tarafından temel gerginlik bir düşüş kaydetti) rahatlamaya başlar genellikle 0.5-1 arasında sürekli bir gerginlik ulaşan mN. Tanımlanan bu gerilim bizim deneysel koşullarda bu büyüklükte doku şeritler için optimize edilmiştir. Ölçekli diğer dokulara kullanılacak ise, uygun uzunluk-gerilim ilişkisi araştırmalar uygulanacak dinlenme gücü optimize etmek için gerçekleştirilen esastır.
  9. Dokular için equilibrate izin ~ 2s spontan kasılmalar ortaya kadar.
    Not: küçük bir bakış açısını temel gerginlik genellikle görülmektedir ve doku canlılık iyi bir göstergesidir ve o-ecek var olmak contractile.

5. 40 mM potasyum (yüksek K+) ile doku zorlu

  1. Kendiliğinden yok kasılmalar montaj 2 h oluşursa, şeritler, potasyum için 40 mM NaCl isosmotic ikame KCl için tarafından yükselmiş bir yüksek potasyum tuz solüsyonu ile meydan. Yüksek K+, sayfalarımızda (mM) ekleme: 119.6 NaCl, 40 KCl, 1.2 MgSO4, 7,8 glikoz, 10,9 HEPES ve 2.0 CaCl2.
    Not: myometrium gibi düz kas içinde daralma dolaylı olarak işletilen gerilim kalsiyum kanalları maksimal akını Ca2 + için doku hücreleri lider açarak yüksek K+ uygulanmasına neden olur. Yüksek K+ bu nedenle doku bütünlüğünün yanı sıra maksimum doku yanıtının bir ölçü elde genel dizin test etmek için bir tedbir olarak kullanılabilir.
    1. 1-2 min için yüksek K+ içeren bir cam laboratuvar şişe içine meydan için şerit içeren banyo için besleyici tüp yerleştirin.
    2. Besleyici tüp PSS kapsayıcıya dönün.
    3. Bir yanıt-e doğru yüksek K+ elde nerede daha fazla 1 h için şerit izleme devam. Yüksek k+ contractile yanıt veya elde edildi spontan aktivite sonrası yüksek K+ yanıt, şerit atmak.
      Not: Deneyci de ölü boşluk (doku banyo ulaşmak çözüm için geçen süre) haberdar olmak gerekir yüksek K+yanıtı değerlendirirken önce besleyici boru içinde. Bu 2-3 dk sürebilir ve akış hızı üzerinde bağlıdır.
    4. Yüksek k+ tam fiyasko, sonraki manevralar etkileyebilecek, banyo ve besleyici tüpler, emin olmak için kendiliğinden kasılma öncesi yüksek K+ genlik devam etmeden önce geri dönene kadar beklemek daha fazla deneme ile.

6. Myometrial daralma bilinen ve yeni bileşikler etkilerini test

Not: roman uyuşturucu ve reaktifler myometrial işlev üzerindeki etkisini test etmek için deneyler spontan (şekil 3A) veya agonist uyarılmış kasılmalar (şekil 3B-C) üzerinde gerçekleştirilebilir. Kasılmalar, agonist için uyarılmış OT veya arginin vasopressin (VP) 0.5 bir konsantrasyon vermek için PSS eklendi nM ve deney (şekil 3B-C) boyunca kullanılır. Doğa40,52phasic kasılma sağladığından OT toplama bu tahlil için optimize edilmiştir. Agonistler bu uzun ömürlü, uzun süreli (tonik) kasılma (Ref41,44 örnekleri için bkz:) altında açabilir daha büyük konsantrasyonları hangi çeşitli ajanlar etkisini değerlendirmek zordur ve deneysel zaman dilimi büyük ölçüde bireysel kasılmalar ve azaltma artan süresi frekans karşılamak için genişletilmiş gerekiyor. Bu örnek deneyde kasılmalar çok uyarmak için OT veya VP eklenir bu husumet bilinen OTR ve V1aR antagonistleri, atosiban ve SR49059 veya bizim roman bileşik [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT), değerlendirildi.

  1. PSS test compound(s) konsantrasyonları hazırlamak (ile ya da ezelî 0.5 nM OT/VP) en az 1/1.000 seyreltme sağlayarak çok çeşitli konsantrasyonları bir yanıt maksimal aşan konsantrasyonları temin değil bu gibi dahil, seyreltilmiş yanıt.
  2. Araç (örneğin, Dimetil sülfoksit, Asetonitril veya distile su) eşit miktarda içeren dilutions eşdeğer bir dizi hazır olun.
    Not: En yüksek konsantrasyonu, Yani, 10-6 M (10-3 M, bir stoktan) hazırlamak ve seri dilutions (örneğin, 10-6-10-10 M) bir Logaritmik ölçek boyunca gerçekleştirmek kolayıdır. Uygulama, Debi cihazları ve şeritler incelenmesine sayısı, örneğin, saat 25 dk uygulama reaktif ve bir akış hızı 1 mL/dk için hazırlanacak birim bağlıdır, en az her konsantrasyon doku banyo başına 25 mL requir Ed.
  3. Bileşik ilk konsantrasyonu yanında duvar ilanı besleyici boru doku banyo için istenen konsantrasyon, reaktif içeren cam laboratuvar şişe içine doku için geçerlidir.
    Not: bir kez kendiliğinden ya da OT/VP-uyarılmış kasılma istikrarlı bir temel elde bu yapılmalıdır.
  4. İkinci bir banyo için aynı şekilde karşılık gelen araç kontrol çözümü uygulayın.
  5. Uygulama (besleyici boru ne zamanYani,) zamanını kaydetmek.
  6. Ardışık olarak besleyici boru serideki sonraki konsantrasyon içeren cam laboratuvar şişe içine yerleştirerek her konsantrasyon için işlemi yineleyin ve tüm konsantrasyonlarda uygulanan kadar tekrarlayın.
    Her toplama uygulama 15 ve 30 dk arasında olabilir ancak uygulanan her yoğunlaşması ve deneyler arasında tutarlı olması gerekir. OT veya kasılmalar VP uyarılmış ilgili olanlar uzun uygulaması dönemleri (örneğin, 25 dk) stimülasyon altında gözlenen daralma sıklıkla azaltma için hesabınıza gerektiren eğilimindedir. En iyi uygulama zamanı belirlemek için ön deneyler önceden test edilen herhangi bir yeni reaktif ile yapılmalıdır.
  7. Besleyici tüp PSS (ile ya da ezelî OT/VP) silinerek geçiş için dönün.
  8. ' Canlı Kayýt iþlemini bitirmek için ''u tıklayın. Hemen verileri uygun bir klasöre kaydetmek ve bir sürüm '.mat' dosyası olarak verin.

7. veri analizi

Not: Veri yakalama ve çözümleme piyasada bulunan veri toplama yazılım paketleri herhangi bir sayı ile gerçekleştirilebilir. Malzemeler tablo bu protokol için kullanılan yazılım ilgili ayrıntılar için bkz:. Contractile aktivite doğru bir değerlendirme için kasılma ölçülecek parametreler yer: i) kasılma genlik, frekans II) daralma, III) süresi kasılma ve IV) kaba kuvvet integral (şekil 4). Kaba kuvvet ayrılmaz daralma eğri altındaki alan eşdeğerdir ve bu nedenle doku roman ile belirli bir süre içinde yapılan toplam çalışma dizinidir. Bazı veya tüm parametrelerin analiz edilebilir. En az, ortalama ayrılmaz kuvvet ve genlik daralma analiz53olduğunu önerilir. Burada açıklanan deneylerde kasılma ve eğri altındaki alan genliği değişiklikleri ölçülür.

  1. The.mat dosyasını analiz yazılımı alın.
  2. Frekans örnekleme aralığı dikkate alarak deneysel zaman yansıtmak için X ekseni için karşılık gelen sütun ayarlayın. Deneyler genellikle 10 10 örnekleri/s veya 600 örnekleri/dk'ya karşılık gelen Hz'de kaydedilir.
  3. Bir xy koordinat grafik kullanarak verileri çizmek "arsa | Bekleme"fonksiyonu.
  4. Temel yazılım 'Dikey Çevir' işlevini kullanarak daralma sıfır.
  5. Bir uygun kontrol dönemi seçin.
    Not: Bu ilk konsantrasyon Regent ama reaktif (şekil 4A) uygulama süresi eşit uygulanması hemen önceki süreyi olduğunu. Uyuşturucu X uygulanması için 25 min ise, örneğin, uyuşturucu X ilk uygulama denetim olarak önceki 25 dk kullanın.
  6. Y ekseni okumak, max zirvesinde daralma seçili süre içinde meydana gelen her kasılma genliğini (kuvvet) kaydetmek ve ortalama bir değer hesaplamak.
  7. Başlangıç ve bitiş her daralma, X ekseni kapalı okuyarak bu maksimum Peak % 50 kasılma süresi ölçmek ve ortalama değeri kaydedin.
  8. Sıklık için bir değer oluşturmak için zaman çerçevesindeki meydana gelen kasılmalar saymak.
  9. AUC hesaplamak için 'bütünleşme' işlevini kullanın (rasgele birimlerindeki yapıyordum) için seçili süreyi.
    Not: AUC doğru bir şekilde kaydetmek için bu temel kasılma sıfırdan Y ekseninde ayarlanır esastır.
  10. Sırayla her konsantrasyonları ile hareket ve daralma farklı parametreler kayıt.
  11. Denetim verisinin % 100 olarak ayarlayın ve ifade reaktif her konsantrasyon bu yüzdesi olarak altında elde edilen değerler Yanikontrol, uyarılması için değerleri-meli var olmak > 100 gevşeme olması gerekir iken % < % 100.
    Not: Bu şekilde veri normalleştirme şeritler ve farmakolojik tedaviler arasında sonuçları karşılaştırmak kullanıcı izin vermelisiniz.
  12. Her deneme için yineleyin ve grafik paketi için veri aktarımı.

Sonuçlar

Bu modeli kullanarak, çeşitli agonistleri ve antagonistleri daralma yanı sıra roman ajanlar bilinen veya bilinmeyen işlev yanıtı muayene sayılabilir ve. EC50 ve ŞA50 değerleri gibi standart farmakolojik parametreleri zaman reaktifler konsantrasyonları, örneğin, 10-5–10-9 M geniş bir alanda kullanılan ve konsantrasyonları boyunca artırmada eklendi hesaplanabilir bir Logaritmik ölçek.

Oksitosin reseptör antagonisti konsantrasyon-yanıt deneyler
Bu deneyde, insan myometrium eşleştirilmiş şeritler yukarıda açıklandığı gibi kesip Resim 1 Resim 2' de gösterildiği gibi doku banyolarında monte, gösterilen ve eşit genlik istikrarlı kasılmalar üretmek için equilibrate için izin ve frekans. Şeritler daha sonra endojen OTR agonist, OT maruz (0.5 nM) kasılmalar uyarmak için. İstikrarlı aktivite OT (genellikle 45 dk) altında bir süre sonra atosiban artan konsantrasyonları Logaritmik ölçek (10-9–10-6 M) boyunca tek şerit uygulandı. İkinci şerit OT içinde yalnız olarak zaman denetim kaldı. Atosiban cevaben örneği şekil 5A' görülebilir. Hemen atosiban ilk toplama denetimi (%100) olarak önceki kasılmalar alarak, genlik ve AUC uygulanan her yoğunlaşması hesaplanmıştır şekil 4' te gösterildiği gibi. Zaman kontrol deneyleri için deneysel manevraları zaman denk ölçüldü. Verileri daha sonra çizildi ve bir grafik yazılım paketi (şekil 5B-C) doğrusal olmayan regresyon işlevini kullanarak eğrileri ile donatılmış. İnhibitör etkisi hesaplama açısından atosiban göreli potens konsantrasyon neden yarım maksimal (% 50) inhibitör yanıttır IC50 ölçerek hesaplanır. Aynı agonistler veya daralma Bitikilerin için yapılabilir. Bu durumda bileşik potens EC50 (yarım maksimal uyarıcı yanıt neden konsantrasyonu) hesaplanır.

Yanıt roman bileşiklerin araştıran ve onların reseptör seçicilik sınama
Biz bu fizyolojik ilgili model ex vivo insan myometrial kasılma yeni sentezlenmiş bir bileşim, [D-Arg8] antagonistik etkileri incelemek için kullanılan-inotocin ([D-Arg8] INT) üzerinde kasılmalar uyarılmış ikisinden biri ile yerel V1a R agonist, VP veya yerel OTR agonist, OT. Bu tahlil daha önce farmakolojik hücre tabanlı yöntemler tarafından bir antagonisti V1aR ancak OTR54olduğu tespit edilmiştir [D-Arg8] INT reseptör selectivity doğrulamak için kullanılan.

Bu deneyde, 0.5 nM VP veya yaklaşık 1 h için 0.5 nM OT konsantrasyonları (şekil 6A ve şekil artan bizim roman bileşik [D-Arg8] INT eklemeden önce şekil 3' te gösterildiği gibi kasılmalar uyarmak için insan myometrial şeritler sinin 6 C). bu o zaman piyasada bulunan, bilinen V1aR antagonist için SR49059 karşılaştırıldığında (şekil 6B). Şekil 6A ile [D-Arg8] Int. konsantrasyonları artan insan myometrial VP uyarılmış kasılmalar konsantrasyon bağımlı düşüşler gösterir Şekil 6Aii-IIIdaralma genliği için verileri ve AUC her yoğunlaşması özetlenmiştir. Şekil 6Bi-IIIgösterilen bilinen V1aR engelleyici, SR49059, konsantrasyonları artırmak için gösterilen için benzer sahiptir. [D-Arg8] INT V1aR doğru ama OTR doğru değil selectivity [D-Arg8] INT genlik ve AUC değil OT (şekil 6C) ile uyarılmış azalma insan myometrial kasılma yok aslında gösterdiği kaldı istikrarlı (şekil 6Cii-III).

figure-results-4144
Şekil 1: insan myometrial biyopsi diseksiyon. (A) A insan rahim rahim duvarı oluşturan üç doku katmanları gösteren diyagram. En içteki tabakasıdır endometrium (hamilelik, kırmızı ok decidua), Orta tabaka kasılmalar oluşturur (kas katmanı, siyah ok) myometrium ise en dış katmanı perimetrium (veya seröz membran, mavi ok) hangi formların bir Rahim çevresinde koruyucu kaplama. Bölge için biyopsi örnekleme ilgi siyah dikdörtgen tarafından tasvir edilir. Sezeryan sırasında alınan bir hamile kadına ait bir örnek biyopsi (B) decidua ve myometrial katmanları vurgulanan (serosa ile görünür değil) gösterilir. Böylece myometrium şeritler doğru deneme için disseke farklı doku katmanları tanımlanır esastır. Bir örnek şerit disseke ve kırpılmış myometrium (C) gösterilir. Tipik olarak 2-6 şeritler kesti ve gösterildiği gibi kırpılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-5355
Şekil 2: çoklu organ banyo deneysel seti kadar insan myometrium kasılmalar ölçmek için kullanılan. (A)şeritler myometrium küçük (1 mL) organ yerleştirilir banyo Odaları bir ısıtmalı rezervuar (i) üzerine yerleştirilir ve fizyolojik serum fizyolojik solüsyonu (PSS) yoluyla bir Peristaltik pompa (II) superfused. Havzanın dolaşan bir su banyosu (III) yoluyla ayarlama bir sıcaklıkta tutulur. Her şerit gerginlik kasılma sırasında değişiklikleri kaydeder bir güç çevirici (IV), bağlı olduğu. Bu bir transbridge amplifikatör (v) tarafından güçlendirilmiş ve ilişkili satın alma yazılımı çalıştıran bir bilgisayar sisteminde (VII) kaydedilen bir dijital sinyal (VI), dönüştürülmüştür. (B) ile bir ucunu PSS içinde banyo büyütülmüş görüntü bir organ Banyo odası ile insan myometrium in situ (kırmızı ok), bir şerit bağlı bir güç çevirici ve diğer sabit bir kanca. (C) kurma şematik genel bakış. PSS ile dolu doku chambers sürekli olarak 37 ° C'de ısıtılmış su deposu altında (45 ° C'de muhafaza) Hamam ve 55 ° C'de ayarla dolaşan bir su pompası ile ısı değişimi ile olan ılık PSS ile derin Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-6846
Şekil 3: insan myometrium spontan ve agonist uyarılmış kasılmalar tüp bebek. Agonist-Alerjik koşullarda kendiliğinden kasılma 3 h üzerinden genlik veya alan-altında--curve (AUC) (bütün, Aiii), önemli kaybı olmadan kayıt için stabil soruşturma için bu modeli sağlamlık gösteren uygulama kendiliğinden kasılma üzerinde çeşitli ajanların. İstikrarlı, kendiliğinden kasılma kurulduktan sonra 0.5 nM oksitosin (B, OT) veya vazopressin (C, VP) fizyolojik serum çözüm (PSS) eklendi. Kasılmalar stimülasyon altında da kalır kararlı birkaç saat daralma genlik (BII, CII) veya AUC (Bill, Ciii), önemli kaybı olmadan için için çeşitli contractile ajanların etkisi etkinleştirme myometrial agonistler huzurunda araştırıldı. Veri olarak ortalama ± standart hata ortalamaya (SEM) sunulmaktadır. Dikkat, kasılmalar stabilize bir kez agonist uyarılmış kasılmalar için (B, C), agonist uygulanması ilk 45 dakika sonra kontrol dönemi (% 100) alınır. Her durumda, şeritler superfused PSS ile 37 ° c, pH 7,4 (yayınlanmıştır gelen Arrowsmith vd. 40 izniyle Üreme Bilimleri ve Di Giglio vd. 54 yaratıcı ortak açık erişim lisansı altında Bilimsel raporlardan izniyle). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-8584
Şekil 4: veri analizi. (A) Kırmızı ile gösterilen bir uygun kontrol dönemi hemen önceki test bileşik (uyuşturucu X) uygulanması kasılmalar seçerek belirlendi. Bu kontrol dönemi de zamanında uygulama uyuşturucu x (örneğin, bu örnekte 40 dk) eşittir. Ölçülen değer için bir kez kontrol dönemi % 100 olarak ayarlanır. Tüm sonraki ölçümler sonra Denetim yüzdesi olarak ifade edilir. (B) 4 farklı parametre ölçülebilir daralma vardır: (i) kasılma gücü (kuvvet, mN), (ii) kasılma, (iii) kasılma süresi oranını ölçen kasılma sıklığı ölçer kasılması genliği hangi yarım maksimal peak daralma ve genel çalışma yapılan bir ölçü verir (olarak da bilinen kuvvet ayrılmaz, rasgele birimler) eğri altındaki alan (IV), ölçülür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-9687
Şekil 5: atosiban oksitosin indüklenen kasılmalar üzerindeki antagonistik etkisi insan myometrium kayıt. Bir kez kendiliğinden kasılma kuruldu, kasılmalar oksitosin reseptör agonist oksitosin (OT) ile teşvik. Kasılmalar daha fazla 45 dk.(a)V1a ve OT reseptör antagonisti stimülasyon altında stabilize etmek için izin verildi, atosiban sonra artan konsantrasyonları Logaritmik ölçek (10-9-10-5M) boyunca uygulandı. Atosiban ilk konsantrasyonu önceki dönemdeki kasılmalar ölçülen ve (% 100) ele. Sonraki her konsantrasyon altında faaliyet ölçülen ve denetim bir yüzdesi olarak ifade edilir. Aynı şeritler rahat deneysel manevraları zaman denk kullanarak OT için maruz kez yapıldı. Veri çizilen grafik yazılımı: (B, C) göstermek için atosiban antagonistik etkisi konsantrasyon-yanıt eğrileri (mavi) ve OT kaynaklı myometrial daralma genlik üzerinde uygun aracın (gri, zamanı denetimi) seyreltme ve (AUC), eğri altındaki alan sırasıyla. Verileri ortalama ± standart hata genlik demek (SEM) yüzdesi ve AUC denetim faaliyet (atosiban uygulamadan) olarak sunulmaktadır. ŞA50 değerleri daha sonra vermek hangi yarım maksimal inhibitör (% 50) yanıt genlik daralma ve kuvvet integral (AUC) için olan konsantrasyonu elde (yayınlanmıştır Arrowsmith vd üzerinden hesaplanan 40 ÜremeBilimler izniyle). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-11441
Şekil 6: bir roman üzerinde insan myometrial daralma bileşik etkisi ve reseptör selectivity testi. İnsan myometrium kendiliğinden kasılma kuruldu sonra kasılmalar vazopressin reseptör agonist, vazopressin (VP) (AI, BI) ile veya oksitosin reseptör agonist oksitosin (OT) (CI) ile teşvik. [D-Arg8] etkisi-inotocin ([D-Arg8] INT) ve ticari olarak mevcut V1aR antagonisti SR49059 kasılmalar VP tarafından uyarılan üzerinde artan konsantrasyonları bileşiklerin uygulayarak değerlendirildi. Tipik yanıt (AI, BI) gösterilir. İlişkili analiz veri için genlik ve (AUC) eğri altındaki alan (II) gösterilir ve (III), sırasıyla nerede etkisi kontrol yüzdesi olarak ifade edilmiştir etkinliği (% 100). [D-Arg8] INT ve bilinen V1aR antagonisti SR49059 genlik ve AUC [D-Arg8] INT rol V1aR reseptör antagonisti olarak insan myometrium destekleme, doz bağımlı azalmasına neden oldu. Buna ek olarak, [D-Arg8] INT OT (CI-III), bu nedenle aynı şekilde bizim bulgular için temel hücre deneyleri uyarılmış kasılmalar etkilemedi, [D-Arg8] INT da insan myometrium (Di veri çoğaltılamaz V1aR doğru selectivity gösterir Giglio vd. 54 yaratıcı ortak açık erişim lisansı altında Bilimsel raporlardan izniyle). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Çoğu ilaç geliştirme insan bozuklukları tedavisi için tasarlanmıştır iken, en temel araştırma öncelikle hayvansal dokularda gerçekleştirilir. Burada, biz birkaç önemli sorular rahim ile ilgili fizyolojisi ve patoloji adrese gibi fonksiyonel yanıt-e doğru doğrulamak için kullanılabilecek cerrahiden elde edilen insan myometrium ex vivo kasılmalar araştırmak için yöntemleri tarif ilaç geliştirme yardım etmek için bilinen ve yeni farmakolojik ajanlar için. Özellikle, biz yanıt ve reseptör belirlemek için bir bilinen OTR ve V1aR rekabetçi antagonisti, atosiban hamile myometrial OT indüklenen kasılmalar, de üzerinde antagonistik yanıt araştırmak için bu tahlil kullanımı vurgulayın bir yeni geliştirilen seçmeli V1aR antagonisti, [D-Arg8] Int. seçicilik Biz hangi ile de Farmakoloji hücre tabanlı verileri hizalama EC50 ve IC50 gibi önemli farmakokinetik parametreleri hesaplanabilir göstermek.

Aynı anda birden çok şeritler kullanarak birden çok aracı etkileri, rekabet deneyler antagonistleri ve uygun zaman ve araç kontrolleri ile doğrudan karşılaştırma sağlar. Şeritler, 2, 4 veya 8 grup halinde kez hazırlanırken bu teknik orta çıktı, 2 – 4 bileşikler (biyopsi) başına 6 – 8 (kümülatif) konsantrasyonlarda test etkinleştirme sağlar. Bu yöntem aynı zamanda etkileri hızlı bir şekilde tespit edilebilir ve iletişim kuralları ayarlanabilir böylece gerçek zamanlı veri sağlar. Buna ek olarak, bu teknik herhangi bir bileşik faiz sınamak için kullanılan ve myometrial Fizyoloji ilaç keşif odaklı Araştırma gruplarının sayısını tarafından başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu yazıda açıklandığı gibi saf bileşikleri analiz, yanı sıra rahim contractility modeli da olmuştur ve başarıyla gibi karışımları, roman uterotonic bileşikleri için ekran için kullanılması gereken geleneksel tıp7 bitkisel preparatlar , 55 , 56.

Bu model teknik olarak güçlü ve iyi tekrarlanabilirlik gösterir rağmen bazı kısıtlamalar bulunmaktadır: diseksiyon bu doku ile yabancı zor olabilir veya diseksiyonu donanımları kullanarak, bu nedenle yeni kullanıcılar doku optimize etmek için biraz zaman gerektirir Hazırlık ve iletişim kuralları. Ayrıca o insan myometrium önemli ölçüde görünüm olarak fare ve fare gibi diğer modeller farklı dikkat edilmelidir. Çoğu kemirgen uteri iki tüp benzeri rahim boynuzları oluşur, her bir ucunda bir yumurtalık ile tamamlamak ve serviks katıldı. Her boynuzun açıkça insan myometrium farklı fiber türlerinde kez bir 'Ağ' oluşturan iç içe geçmiş bulunmaktadır ederken hangi diseksiyon kolayca ayrılabilen boyuna ve dairesel kas tabakaları tanımlamıştır. Buna ek olarak, insan myometrium daralma profilleri kemirgenler çok farklıdır. En önemlisi insan myometrium kasılma süresi daha uzun daha az sık. Deneysel zaman dilimlerini insan myometrium ile çalışmak için çoğu zaman bu nedenle çok kemirgen modelleri daha uzun. Reseptör ifade türler arasında farklılıklar da agonistler yanıt oldukça belirgin farklılıklar katkıda bulunabilir ve bu türler arasında sonuçları extrapolating Eğer kaynaklı.

Orada da dikkate çıktı bu sistemi en üst düzeye çıkarmak için gereken adımları sayısı. Kritik adımlar diseksiyon sırasında gereksiz herhangi bir zarar görmemesi için dokuları ele alırken veya ne zaman montaj bakımı gibi doku canlılığı korunması içerir. Yetenekli bir göz ince şeritler rahim kas, kas lifleri yönünü boyuna yön ve uçak doku takip, yanı sıra skar doku, decidua ve küçük gemiler kaçınarak sağlanması incelemek için gereklidir. Numune laboratuvarda olduğunda yönlendirme amaçlı yardımcı olmak için seröz kenarına decidual kenarından betimlemek için biyopsi bir yana toplanması sırasında (örneğin, küçük cerrahi dikiş) bir etiket eklemek mümkündür.

Doku fonksiyon sıcaklık derecesi fluctuations tabi olduğu gibi dokuların sürekli bir 36-37 ° C'de deneme sırasında tutulmalıdır. Bu laboratuvar içinde sağlam klima ünitesi ile elde edilebilir. Isıtılan PSS sürekli perfüzyon daralma atık ürünleri dışarı kızarma yanı sıra sıcaklık muhafaza sağlar. Sıcaklık organ banyosu içinde akış hızını değiştirme veya su banyo sıcaklığı doğrudan değiştirerek değiştirilebilir. Geleneksel 5-50 mL hamama karşılaştırıldığında küçük banyo boyutu PSS nispeten hızlı bir ciro ve reaktifler Silinerek geçiş sağlar. Kırılan organ Banyosu burada açıklandığı gibi aynı zamanda PSS hacmi ve böylece maliyeti en aza indirmek ve değerli tutumlu, yeni geliştirilmiş kimyasal gerekli, ilgi Kimyasalları azaltır. Buna ek olarak, küçük banyo boyutu ve HEPES tabanlı bir arabellek kullanarak sayesinde, bu sistem örneğinoksijenlenme, PSS carbogen ile köpüren tarafından gerektirmez. Şeritler için uygulanan gerilim standardizasyon da önemlidir. İçin şeritler (5 x 2 x 1 mm) bu büyüklükte, bu yaklaşık 2 mN (~0.2 g için eşdeğer) olmalıdır. Alternatif yöntemler uygulama yüksek potasyum çözümün maksimal kasılma ve en fazla bu daralma yarısı germe ikna etmek için içerir. Ancak belirtmek gerekir, o uygulanan gerilim vivo içinde farklı olabilir.

Ana zorluklar insan denekler dokular elde içerir, ancak her ne kadar vergi, insan doku açıkça en fizyolojik insan hastalık ve ilaç keşif rahim kasılması çalışmak için ilgili (ve tatmin edici) modeli temsil. Şeritler ancak, mutlaka doku içinde vivo için örneğin, hormonal muaf oldukları ve gergin, giriş olarak daralma için gerekli değil, ancak eşit değil izole doku kasılmalar içinde vivomodüle. Bu tahlil ancak myometrial kasılmalar böyle etkilerden ayrılmış kontrollü bir şekilde analiz etmek için fırsat sağlar. Ayrıca hormonal kontrolü daralma (örneğin, yolu ile OT, VP, Prostaglandinler, vb) gibi faktörlerin etkisi için araştırılması için myometrial işlevi düzenlenmesi için ipuçları sağlamak sağlar. Dokuları farklı kadın elde edilir gibi doğal olarak bazı varyasyon spontan contractile profilleri örnekler arasında olduğunu. Bu nedenle genellikle çok sayıda üzerinde deneyler yapmak gereklidir (~ n = 10) örneklerinin bazı veri kümeleri53varyasyon en aza indirmek için. En önemli farklı hasta grupları arasında contractile aktivite karşılaştırırken bu. Yanıt agonistleri ve antagonistleri etkinliği denetlemek için normalize (Yani, denetim faaliyeti veya yüksek K+yüzdesi olarak ifade) bazı bu varyasyon azaltır. Buna ek olarak, arası şerit varyasyon azaltmak için veri kendi uzunluk ve ağırlık yazı deneme41ölçerek çapraz kesit alanı şerit için normalleştirilmiş. Bu daralma desenleri farklı hasta grupları arasında karşılaştırma özellikle yararlıdır.

Bu teknik sınırlamaları da hastane personeli, özellikle tiyatro personel ile iyi çalışma ilişkileri gerektiren erişim taze dokulara içerir ve bu izni sürece dahil. Yerel araştırma Etik Kurulu ve Enstitü ya da hastane inceleme kurulu etik izinleri de eklenmiş olması gerekir. İnsan myometrium donör cerrahisi uygulanan zaman CS teslim sırasında gerçekleştirilen en olası koleksiyonudur. Aynı rahim kesi siteden bebek teslim etmek için yapılan biyopsi alınır ve bu nedenle hasta herhangi bir daha fazla ek yordamları geçmesi gerekmez. Tiyatro personel ve biyopsi performans cerrah gerekir dokuları sonraki kullanımını öğrenmesini ve bunların sabitleştirici çözümlerinizle böyle bir patoloji bölüm için gönderme gelince değil yerleştirilecek. Deneysel uzun süre başka bir noktadır. İnsan doku ile deneyler birçok saat sürer (genellikle > 6 h) (karşı benzer bir deney faresi veya fare rahim içinde 2-3 h), kasılma ve doku montaj ve spontan kurulması arasında 2-3 h lag zaman daha yavaş sıklığını sayesinde Kasılmalar. Ancak, insan dokusu kasılmalar biz gösterdiği gibi sağlam, ve sözleşme önemli yorgunluk40olmadan birçok saat için kuruldu.

Bu sistem aynı zamanda ilaç Kimyasalları hamile doku üzerinde test etmek yeteneği dahil aşılması gereken diğer sorunlar vivo içinde çalışma sağlar. Bu teknik kolayca sayede ilk sonuçları teyit devam etmeden önce fare dahil olmak üzere diğer türler için yaygınlaştırılması bütün hayvan çalışmaları daha. Sıcaklık kontrollü değişiklikleri, superfusate (PSS) ve pH kompozisyon kolayca farklı senaryolar içinde vivo taklit ve bu değişikliklerin etkisi bileşik davranışı çözümlemek için yapılabilir. Myometrial şeritler izometrik gerginlik ölçme temel ilkeleri de hücre içi kalsiyum konsantrasyonu veya pH eşzamanlı değişiklikleri ölçmek için Ca'nın floresan veya pH (H+) göstergeleri ve donanımları algılamak için kullandığı Genişletilebilir ve kayıt Floresans57,58,59,60.

Genel olarak, insan myometrium karakterize ve ilaç keşif roman terapötik bileşiklerin doğrulamak için sağlam ve fizyolojik olarak ilgili modelini gösteren — saf bileşikler ve karışımlar. Biz örnek kullanımı uyuşturucu keşif OT/VP sistemi ile ilgili olarak sağlanan ve bileşik etkinlik ve kudret tanımlanmış hedefte belirlemek ve ligand seçicilik doğrulamak için bu model nasıl kullanılacağını göstermek için OTR ve V1birR antagonistleri üzerinde duruldu. Ancak, o bu teknik faiz veya myometrial kasılma (ya da gevşeme) önde gelen yolu herhangi bir hedef çalışmaya gibi ilaç keşfi yeni hedefler ve yollar yardımcı olmak için kullanılabilir ve myometrial bizim anlayışı ilerletmek kaynaklı Fizyoloji ve patofizyolojisi.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu araştırma projesi I3243 yoluyla Avusturyalı Bilim Fonu (FWF) ve Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı (hibe sözleşmesi No 714366) altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) tarafından desteklenmiştir. CWG bir Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) gelecek arkadaş grubu (FT140100730) ve MM bir ark keşif erken kariyer araştırmacı (DECRA) Arkadaş grubu (DE150100784) tarafından desteklenmiştir. SA bir Harris-refah Preterm doğum Araştırma Merkezi refah, kadınlar, UK tarafından yönetilen Grant tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Origin softwareOrigin Lab2015 version
Labscribe SoftwareWPIFormally Datatrax
GraphPad Prism graphical softwareGraphPad PrismPRISM 5
LabTrax 4-Channel Data AcquisitionWPILAB-TRAX-4
Transbridge Transducer AmplifierWPISYS-TBM4M
Force-displacement TransducerWPIFORT10g10 g
BNC to BNC CableWPI500184
Magnetic Clamp standWPIM10
MicrometerReconditioned from microscopes
Peristaltic pumpGilsonMINIPULS3R4 Standard pump head
Suction pumpsVariousAP2 air pump
Circulating Water bathGrant InstrumentsTC1205L
Perspex Tissue BathCustom made
Water reservoir containerthe reallyusefulbox7L
Tissue Hooks (fixed)Hand made in house
Peristaltic tubingGilsonF117948PVC 2.79 mm internal diameter
Tygon TubingFisher Scientificvarious diametersR-3603
Aluminium clipsLaser services, USAcustom made
Stereo Zoom binocular microscopeWPIPZMIV
Microscope Fiber-optic Light SourceWPIPHOTONIC PL 2000
Dissecting DishesHandmade with Sylgard
Sylgard Silicone Elastomer kitDow CorningSylgard 170 Kit
Vannas ScissorsWPI500868.5 cm, straight edge
Iris ForcepsWPI1591410 cm, straight edge (serrated)
Dissecting scissorsWPI1439310 cm, straight
Dissecting pinsSIGMAZ192341B-D precision guide syringe needle 30G
HBSSSIGMAH9269
Physiological Salt SolutionSIGMAvariousPSS
Oxytocin acetate saltSIGMAO6379
[Arg8]-vasopressin acetate saltSIGMAV9879

Referanslar

  1. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  2. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398 (1), 227-238 (2010).
  3. Wray, S. Insights into the uterus. Exp Physiol. 92 (4), 621-631 (2007).
  4. Wray, S., Kupittayanant, S., Shmygol, A., Smith, R. D., Burdyga, T. The physiological basis of uterine contractility: a short review. Exp Physiol. 86 (2), 239-246 (2001).
  5. Matthew, A., Shmygol, A., Wray, S. Ca2+ entry, efflux and release in smooth muscle. Biol Res. 37 (4), 617-624 (2004).
  6. Wray, S., et al. Calcium signaling and uterine contractility. J Soc Gynecol Investig. 10 (5), 252-264 (2003).
  7. Gruber, C. W., O'Brien, M. Uterotonic plants and their bioactive constituents. Planta medica. 77 (3), 207-220 (2011).
  8. Maul, H., Maner, W. L., Olson, G., Saade, G. R., Garfield, R. E. Non-invasive transabdominal uterine electromyography correlates with the strength of intrauterine pressure and is predictive of labor and delivery. J Matern Fetal Neonatal Med. 15 (5), 297-301 (2004).
  9. Newman, R. B. Uterine contraction assessment. Obstet Gynecol Clin North Am. 32 (3), 341-367 (2005).
  10. Haran, G., Elbaz, M., Fejgin, M. D., Biron-Shental, T. A comparison of surface acquired uterine electromyography and intrauterine pressure catheter to assess uterine activity. Am J Obstet Gynecol. 206 (5), 412-e415 (2012).
  11. Condon, J., et al. Telomerase immortalization of human myometrial cells. Biol Reprod. 67 (2), 506-514 (2002).
  12. Soloff, M. S., et al. Immortalization and characterization of human myometrial cells from term-pregnant patients using a telomerase expression vector. Mol Hum Reprod. 10 (9), 685-695 (2004).
  13. Buxton, I. L., Vittori, J. C. Cholesterol depletion enhances both spontaneous and agonist-evoked uterine smooth muscle contractions in a reversible manner. Proc West Pharmacol Soc. 48, 126-128 (2005).
  14. Matthew, A., Kupittayanant, S., Burdyga, T., Wray, S. Characterization of contractile activity and intracellular Ca2+ signalling in mouse myometrium. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11 (4), 207-212 (2004).
  15. Heaton, R. C., Taggart, M. J., Wray, S. The effects of intracellular and extracellular alkalinization on contractions of the isolated rat uterus. Pflugers Arch. 422 (1), 24-30 (1992).
  16. Hutchings, G., Deprest, J., Nilius, B., Roskams, T., De Ridder, D. The effect of imatinib mesylate on the contractility of isolated rabbit myometrial strips. Gynecol Obstet Invest. 62 (2), 79-83 (2006).
  17. Wilson, R. J., Allen, M. J., Nandi, M., Giles, H., Thornton, S. Spontaneous contractions of myometrium from humans, non-human primate and rodents are sensitive to selective oxytocin receptor antagonism in vitro. BJOG. 108 (9), 960-966 (2001).
  18. Choudhury, S., Garg, S. K., Singh, T. U., Mishra, S. K. Functional and molecular characterization of maxi K+ -channels (BK(Ca)) in buffalo myometrium. Anim Reprod Sci. 126 (3-4), 173-178 (2011).
  19. Smith, R. C., McClure, M. C., Smith, M. A., Abel, P. W., Bradley, M. E. The role of voltage-gated potassium channels in the regulation of mouse uterine contractility. Reprod Biol Endocrinol. 5, 41 (2007).
  20. Jones, K., Shmygol, A., Kupittayanant, S., Wray, S. Electrophysiological characterization and functional importance of calcium-activated chloride channel in rat uterine myocytes. Pflugers Arch. 448 (1), 36-43 (2004).
  21. Popescu, L. M., et al. Imatinib inhibits spontaneous rhythmic contractions of human uterus and intestine. Eur J Pharmacol. 546 (1-3), 177-181 (2006).
  22. Taggart, M. J., Wray, S. Contribution of sarcoplasmic reticular calcium to smooth muscle contractile activation: gestational dependence in isolated rat uterus. J Physiol. 511 (Pt 1), 133-144 (1998).
  23. McCallum, L. A., Pierce, S. L., England, S. K., Greenwood, I. A., Tribe, R. M. The contribution of Kv7 channels to pregnant mouse and human myometrial contractility. J Cell Mol Med. 15 (3), 577-586 (2011).
  24. Bernstein, K., et al. Calcium-activated chloride channels anoctamin 1 and 2 promote murine uterine smooth muscle contractility. Am J Obstet Gynecol. , (2014).
  25. Khan, R. N., Morrison, J. J., Smith, S. K., Ashford, M. L. Activation of large-conductance potassium channels in pregnant human myometrium by pinacidil. Am J Obstet Gynecol. 178 (5), 1027-1034 (1998).
  26. Phillippe, M., Basa, A. Effects of sodium and calcium channel blockade on cytosolic calcium oscillations and phasic contractions of myometrial tissue. J Soc Gynecol Investig. 4 (2), 72-77 (1997).
  27. Ausina, P., et al. Effect of inhibition of the electrogenic Na+/K+ pump on the mechanical activity in the rat uterus. Fundam Clin Pharmacol. 10 (1), 38-46 (1996).
  28. Melin, P., Trojnar, J., Johansson, B., Vilhardt, H., Akerlund, M. Synthetic antagonists of the myometrial response to vasopressin and oxytocin. J Endocrinol. 111 (1), 125-131 (1986).
  29. Hahn, D. W., et al. Evaluation of 1-deamino-[D-Tyr(Oethyl)2, Thr4, Orn8] vasotocin, an oxytocin antagonist, in animal models of uterine contractility and preterm labor: a new tocolytic agent. Am J Obstet Gynecol. 157 (4 Pt 1), 977-982 (1987).
  30. Demarest, K. T., et al. Profile of an oxytocin antagonist, RWJ 22164 for treatment of preterm labor in laboratory models of uterine contractility. American journal of perinatology. 6 (2), 200-204 (1989).
  31. Goodwin, T. M., et al. The pharmacokinetics of the oxytocin antagonist atosiban in pregnant women with preterm uterine contractions. Am J Obstet Gynecol. 173 (3 Pt 1), 913-917 (1995).
  32. Goodwin, T. M., et al. The effect of the oxytocin antagonist atosiban on preterm uterine activity in the human. Am J Obstet Gynecol. 170 (2), 474-478 (1994).
  33. Goodwin, T. M., et al. Treatment of preterm labor with the oxytocin antagonist atosiban. American journal of perinatology. 13 (3), 143-146 (1996).
  34. Romero, R., et al. An oxytocin receptor antagonist (atosiban) in the treatment of preterm labor: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial with tocolytic rescue. Am J Obstet Gynecol. 182 (5), 1173-1183 (2000).
  35. Norstrom, A., Andersson, A., Vilhardt, H. Contractile effect of oxytocin and 1-deamino-1-carba-2-tyrosine (0-methyl)-oxytocin in myometrial tissue from non-pregnant and term pregnant women. Acta Endocrinol (Copenh). 122 (5), 566-568 (1990).
  36. Atke, A., Vilhardt, H. Uterotonic activity and myometrial receptor affinity of 1-deamino-1-carba-2-tyrosine(O-methyl)-oxytocin. Acta Endocrinol (Copenh). 115 (1), 155-160 (1987).
  37. Hunter, D. J., Schulz, P., Wassenaar, W. Effect of carbetocin, a long-acting oxytocin analog on the postpartum uterus. Clin Pharmacol Ther. 52 (1), 60-67 (1992).
  38. Moraitis, A. A., Cordeaux, Y., Charnock-Jones, D. S., Smith, G. C. The Effect of an Oxytocin Receptor Antagonist (Retosiban, GSK221149A) on the Response of Human Myometrial Explants to Prolonged Mechanical Stretch. Endocrinology. 156 (10), 3511-3516 (2015).
  39. Al-Qahtani, S., et al. Diabetes is associated with impairment of uterine contractility and high Caesarean section rate. Diabetologia. 55 (2), 489-498 (2012).
  40. Arrowsmith, S., Neilson, J., Bricker, L., Wray, S. Differing In Vitro Potencies of Tocolytics and Progesterone in Myometrium From Singleton and Twin Pregnancies. Reprod Sci. 23 (1), 98-111 (2016).
  41. Arrowsmith, S., Quenby, S., Weeks, A., Burdyga, T., Wray, S. Poor spontaneous and oxytocin-stimulated contractility in human myometrium from postdates pregnancies. PloS one. 7 (5), e36787 (2012).
  42. Arrowsmith, S., Robinson, H., Noble, K., Wray, S. What do we know about what happens to myometrial function as women age?. J Muscle Res Cell Motil. 33 (3-4), 209-217 (2012).
  43. Quenby, S., Matthew, A., Zhang, J., Dawood, F., Wray, S. In vitro myometrial contractility reflects indication for caesarean section. BJOG. 118 (12), 1499-1506 (2011).
  44. Turton, P., et al. A comparison of the contractile properties of myometrium from singleton and twin pregnancies. PloS one. 8 (5), e63800 (2013).
  45. Zhang, J., Bricker, L., Wray, S., Quenby, S. Poor uterine contractility in obese women. BJOG. 114 (3), 343-348 (2007).
  46. Higgins, C. A., et al. Maternal obesity and its relationship with spontaneous and oxytocin-induced contractility of human myometrium in vitro. Reprod Sci. 17 (2), 177-185 (2010).
  47. Crankshaw, D. J., O'Brien, Y. M., Crosby, D. A., Morrison, J. J. Maternal body mass index and spontaneous contractility of human myometrium in pregnancy. J Perinatol. 37 (5), 492-497 (2017).
  48. Luckas, M. J., Wray, S. A comparison of the contractile properties of human myometrium obtained from the upper and lower uterine segments. BJOG. 107 (10), 1309-1311 (2000).
  49. Chapman, N. R., Kennelly, M. M., Harper, K. A., Europe-Finner, G. N., Robson, S. C. Examining the spatio-temporal expression of mRNA encoding the membrane-bound progesterone receptor-alpha isoform in human cervix and myometrium during pregnancy and labour. Mol Hum Reprod. 12 (1), 19-24 (2006).
  50. Robson, S. C., Simpson, H., Ball, E., Lyall, F., Bulmer, J. N. Punch biopsy of the human placental bed. Am J Obstet Gynecol. 187 (5), 1349-1355 (2002).
  51. Popat, A., Crankshaw, D. J. Variable responses to prostaglandin E(2) in human non-pregnant myometrium. Eur J Pharmacol. 416 (1-2), 145-152 (2001).
  52. Arrowsmith, S., Neilson, J., Wray, S. The combination tocolytic effect of magnesium sulfate and an oxytocin receptor antagonist in myometrium from singleton and twin pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 789-e789 (2016).
  53. Crankshaw, D. J., Morrison, J. J. Methodology and pharmacological analysis of effects of uterotonic compounds in human myometrium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 205 (2), 155-e156 (2011).
  54. Di Giglio, M. G., et al. Development of a human vasopressin V1a-receptor antagonist from an evolutionary-related insect neuropeptide. Sci Rep. 7, 41002 (2017).
  55. Attah, A. F., et al. Ethnobotanical survey of Rinorea dentata (Violaceae) used in South-Western Nigerian ethnomedicine and detection of cyclotides. J Ethnopharmacol. 179, 83-91 (2016).
  56. Koehbach, J., et al. Oxytocic plant cyclotides as templates for peptide G protein-coupled receptor ligand design. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21183-21188 (2013).
  57. Taggart, M. J., Burdyga, T., Heaton, R., Wray, S. Stimulus-dependent modulation of smooth muscle intracellular calcium and force by altered intracellular pH. Pflugers Arch. 432 (5), 803-811 (1996).
  58. Luckas, M. J., Taggart, M. J., Wray, S. Intracellular calcium stores and agonist-induced contractions in isolated human myometrium. Am J Obstet Gynecol. 181 (2), 468-476 (1999).
  59. Parratt, J. R., Taggart, M. J., Wray, S. Functional effects of intracellular pH alteration in the human uterus: simultaneous measurements of pH and force. J Reprod Fertil. 105 (1), 71-75 (1995).
  60. Taggart, M., Wray, S. Simultaneous measurement of intracellular pH and contraction in uterine smooth muscle. Pflugers Arch. 423 (5-6), 527-529 (1993).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 131fizyolojiFarmakolojimyometriuminsan rahimkas lmaorgan Banyosupeptidoksitosinvazopressinila bulma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır