Visualização dinâmica de lignificação em plantas com química clique: dupla rotulagem é uma bênção!

Resumo

BLISS, um protocolo de rotulagem duplo para estudar a dinâmica de lignificação, foi desenvolvido. Usando o monolignol sintético repórteres e uma combinação sequencial de SPAAC e CuAAC opaco clique em reações, abre esta metodologia o caminho para uma análise detalhada dos fatores que regulam a biogênese de Ligninas em planta.

Resumo

Lignina é um dos biopolímeros mais prevalentes do planeta e um componente importante da biomassa lignocelulósica. Este polímero fenólico desempenha um papel vital de estrutural e proteção no desenvolvimento e na vida das plantas superiores. Embora os intrincados mecanismos regulação fortemente lignificação processos na vivo impactam da valorização industrial dos muitos produtos de origem vegetal, a comunidade científica ainda tem um longo caminho a percorrer para decifrá-las. Em um fluxo de trabalho de três passos simples, o protocolo de rotulagem dual apresentado permite estudos de bioimaging de ativamente lignifying zonas de tecidos vegetais. O primeiro passo consiste na incorporação metabólica de dois repórteres de químicas independentes, substitutos das duas monolignols nativos que dão origem a lignina G e H --unidades. Após incorporação crescente de polímeros de lignina, cada repórter então é especificamente rotulada com sua própria sonda fluorescente através de uma combinação sequencial de opaco SPAAC/CuAAC clique em reações. Combinado com autofluorescência de lignina, esta abordagem conduz à geração de mapas de localização de três cores de lignina na parede celular das plantas por microscopia de fluorescência confocal e fornece informações espaciais precisas sobre a presença ou ausência de ativo máquinas de lignificação na escala da fábrica de tecidos, células e camadas diferentes de parede celular.

Introdução

Nas últimas duas décadas, a estratégia de química repórter tem emergido como uma metodologia poderosa em duas fases para investigar a dinâmica e funções das biomoléculas não geneticamente codificadas. ^{1 , 2 , 3} nesta estratégia um análogo sintético da biomolécula de interesse com uma modulação pequena – o repórter químico -é primeiro metabolizado pelo organismo vivo e então uma sonda de química (ex., um fluoróforo para fluorescência imagem de microscopia confocal) está ligada covalentemente o repórter incorporado através do opaco clique em química. A sonda deve reagir rapidamente e especificamente com a modificação química introduzida ao ser inerte a qualquer biomoléculas presentes no sistema de vida. Em muitos aspectos, este método supera as limitações das técnicas comuns de bioconjugation através do uso de ligadura de química clique altamente específicas proporcionando assim a oportunidade de acompanhar metabolitos ou macromoléculas que eram anteriormente inacessíveis em vida sistemas^4,5,6.

Apesar da popularidade de rápido crescimento desse método poderoso nas células bacterianas e animais, relatórios descrevendo o seu uso em biologia vegetal são surpreendentemente poucos e distante entre^{7,8,9,10, 11,12}. Nós estávamos particularmente interessados em aplicar esta estratégia em plantas para estudar a formação de lignina, dentre os biopolímeros mais prevalentes do planeta e um componente importante da biomassa lignocelulósica. ^{13 , 14} a lignina é um polímero fenólico que desempenha um papel estrutural e proteção vital no desenvolvimento e na vida das plantas superiores.

Geralmente é composto de três partes de 4-hydroxyphenylpropanoid: H (p- hidroxifenil), G (guaiacil) e S (siringil) unidades, respectivamente, derivada de três 'monolignols' (p- coumaryl, coniferílico e sinapílico álcoois) que são sintetizados através da via de fenilpropanoides no citoplasma da célula (Figura 1). Depois de ser exportada para a parede celular, monolignols são oxidados a radicais por peroxidases ou laccases depois que elas passam por reações de acoplamento radical puramente químico para polimerizar para polímeros de lignina, um processo denominado lignificação. ^{15 , 16} embora Ligninas impacto fortemente a valorização industrial de muitos de origem vegetal produtos, a comunidade científica ainda tem um longo caminho a percorrer para decifrar os intrincados mecanismos regulação lignificação.

Figura 1: O processo de lignificação em células vegetais. Monolignols são biossintetizados de fenilalanina no citosol. Depois de ser exportada para a parede celular, monolignols são oxidados a radicais por peroxidases ou laccases depois que elas passam por reações de acoplamento radical puramente químico para polimerizar para polímeros de lignina, um processo denominado lignificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Apesar de numerosos relatórios sobre o uso de reações opaco para análise de glicano,^2,3,17 seus exemplos de aplicação para outros tipos de biomoléculas são menos. A utilização da química opaco para fins de bioimaging de lignina só recentemente foi pioneira por Tobimatsu et al ⁸ em Arabidopsis thaliana para fornecer informações sobre a incorporação de coniferílico substitutos do álcool para o polímero de lignina, onde forma a unidades G,^8,9 , demonstrando assim a prova de conceito que estratégias de repórter químicos são aplicáveis neste contexto. O uso de CuAAC foi também ilustrado usando um derivado do Álcool coniferílico diferentes alguns meses mais tarde por Bukowski et al. ⁹ Todavia, lignina também contém unidades de H e S e uma compreensão mais profunda do processo de lignificação requer mais conhecimento sobre como todos os monolignols são incorporados ao polímero e quais os fatores que podem controlar a sua composição. Novos avanços nesta área dependem atualmente o desenvolvimento de metodologias eficientes para controlar vários repórteres químicos simultaneamente em sistemas vivos. Apesar de alguns artigos sobre os glicanos têm as bases em anos recentes^{18,19,20,21,22}, dupla rotulagem abordagens permanecem um grande desafio em química de opaco. Se um protocolo de clique único-rotulagem reprodutível é difícil desenvolver, então dupla rotulagem abordagens que exigem a otimização em tandem de dois mutuamente compatíveis opaco reações em dois repórteres químicas separadas são ainda mais difícil. Os poucos exemplos que foi pioneiro neste aspecto usou uma combinação de tensão-promovido azida-alquino cicloadição (SPAAC) e reações de Diels-Alder (DA_inv) alceno-tetrazine inversa demanda eletrônica para estudar os glicanos em células animais. No entanto, pensamos que o bioorthogonality da reação de DAinv não pode ser garantida nesta aplicação devido as características estruturais da lignina (que consiste de monômeros de rico em elétrons substituídos Cinamil-tipo que podem reagir com elétron-pobres Dienes, tais como as sondas de tetrazine usadas em reações de DAinv) e que isso pode gerar a não-específicas de rotulagem. Além disso, a reação de_inv DA requer alças químicas sinteticamente difíceis de acesso, bem como sendo volumoso e lipofílicos, assim, levantando a possibilidade que a taxa de incorporação, transporte e/ou localização do produto químico repórter na vivo pode ser afetada. Como consideramos que a último aspecto foi particularmente relevante no caso de uma abordagem de química clique para estudar lignificação, escolhemos uma direção diferente e desenvolvido um opaco ligadura Imaging sequencial estratégia (felicidade) usando um combinação de cicloadição azida-alquino Strain-Promoted (SPAAC) e cobre catalizada azida-Alkyne cicloadição (CuAAC) in vivo. ²³

Estas duas reações são de fato os dois principais opaco clique em reações que foram usadas até à data, e mais particularmente em poucos exemplos de lignina de imagens que foram recentemente publicados. ^{8 , 9} nossa estratégia dupla rotulagem permite o uso de um agrupamento de azida na um monolignol repórter e um alquino terminal do outro, duas alças químicas ii) muito pequeno no tamanho (Figura 2 e i) ́ para estruturas biologicamente relevantes ). Como resultado, o impacto destas modificações sintéticas sobre as propriedades físico-químicas a biomolécula sob estudo é minimizado, reduzindo possíveis discrepâncias entre os substratos de monolignol naturais e não naturais em termos de transporte e taxas de metabolização durante a etapa de incorporação metabólica. Embora a combinação de SPAAC e CuAAC à primeira vista parece muito intuitiva, é para o nosso conhecimento apenas o segundo exemplo de dupla marcação usando esta estratégia e a primeira aplicação em estruturas que não sejam os glicanos. ^{12 , 23}

Figura 2: BLISS dupla rotulagem estratégia. Química repórteres H_AZ e G_ALK são análogos marcados do nativo monolignols H e G. Primeiro são incorporados a crescente polímeros lignina das paredes das células pela alimentação exógena (etapa 1). Cyclooctyne - e azida-acrescida sondas fluorescentes então são ligadas sequencialmente para os repórteres incorporados pelo opaco clique em química: a reação de SPAAC (passo 2) é altamente específica das unidades de H_AZ e é seguida por um CuAAC (de reação Passo 3) que é específico de unidades G_ALK (etapa 3), permitindo assim a localização específica de ambos os repórteres independentemente na mesma amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em primeiro lugar projetamos e validado o repórter Hde azida-tag monolignol_AZ (substituto de álcool de p- coumaryl) e precursor das unidades de lignina H e então concebeu a BLISS dupla rotulagem de estratégia em que é usado em conjunto com o relatado anteriormente marcados alquino G_ALK,⁹ (substituto do Álcool coniferílico) e precursor de unidades G de lignina. Neste protocolo podem ser reproduzidos, desenvolvido e testado em linho, uma espécie de planta economicamente importante, a dupla metabólica incorporação de H_AZ e G_ALK lignina primeiro é alcançada antes sequencial SPAAC/CuAAC rotulagem. Aqui, etiquetado H_AZ unidades primeiro são rotuladas especificamente através da ligadura de SPAAC de um fluoróforo acrescida de cyclooctyne, seguido por ligadura mediada por CuAAC de uma segunda sonda fluorescente etiquetado G_ALK unidades. Este método foi usado para investigar a dinâmica dos processos de lignificação dentro da parede celular das plantas e pode ser aplicada na vivo para conter secções transversais, vivendo de hastes, bem como mudas de diferentes espécies de plantas.

Protocolo

Nota: Líquidos e sólidos ½ MS mídia deve ser preparada previamente, conforme descrito no quadro suplementar 1.

1. planta cultura

1. Cultura de plantas de linho 2 meses
   1. Semear sementes de linho (Linum usitatissimum L.) em potes de plástico usando o adubo do potting.
   2. Crescer linho em câmaras de crescimento de 22 ° C, com um fotoperíodo de 16 h/8 h dia/noite.
   3. Plantas com apoio vertical após 1 mês de equipar e crescer até que eles são 2 meses de idade.
2. Cultura de mudas de linho 2 semanas
   1. Embrulhe a 12 sementes de linho em um pedaço de pano de queijo e fixe com uma faixa de borracha para fazer um pacote.
      Nota: Execute os próximos passos em condições estéreis sob uma coifa de fluxo laminar.
   2. Coloque o pacote de sementes em um frasco de vidro previamente esterilizado 250ml.
   3. Adicionar 70 mL de 70% EtOH na garrafa e gentilmente mexa por 1 minuto.
   4. Remova cuidadosamente o EtOH por decantação, deixando o pacote na garrafa.
   5. Adicionar 100 mL de hipoclorito de sódio 2% e agite suavemente durante 10 min.
   6. Remova a solução de hipoclorito de sódio por decantação, deixando o pacote na garrafa.
   7. Repita as etapas 1.2.5-1.2.6.
   8. Adicionar 100 mL de água ultrapura esterilizada e mexa por 1 minuto.
   9. Repita a etapa 1.2.8 3 vezes, aumentando o tempo de lavagem para cada enxágue (5, 10 e 15 min).
   10. Aquecer o meio sólido de ½ MS, despeje-o em uma caixa de cultura estéril planta a uma altura de 2 cm e deixe arrefecer até solidificação.
   11. Coloque delicadamente cada semente em meio sólido, utilizando Pinças esterilizadas.
   12. Feche a caixa estéril.
   13. A caixa de transferência para uma câmara de crescimento a 22 ° C, com um fotoperíodo de 16 h/8 h dia/noite e cultivar mudas de linho por 2 semanas.

2. metabólica incorporação de repórteres químicas

Nota: Os três modelos experimentais são apresentados abaixo: i) metabólica rotulagem de secções transversais do caule, hastes ii) toda e iii) planta mudas. Cada protocolo é apresentado para uma replicação biológica e quantidades podem ser adaptadas para o número de repetições biológicas necessárias. As soluções monolignol são preparadas com as soluções que são feitas conforme descrito na tabela 2 , antes do experimento. As soluções estoque podem ser armazenadas vários meses a-20 ° C. O H_AZ: G_ALK ou H:G proporções podem ser ajustadas para caber todos os desenhos experimentais feitos sob medidos.

1. Incorporação de repórter química em 2 seções transversais do caule linho meses
   1. Prepare uma solução de química repórter 300 µ l contendo 10 µM de G_ALK e 10 µM de H_AZ em meio líquido de ½ MS estéril.
   2. Vórtice o H_AZ/G_ALK solução e transferi-lo para um poço de uma placa com uma micropipeta de 48.
   3. Prepare uma solução de controlo negativo 300 µ l contendo 10 µM de G e 10 µM de H em meio líquido de ½ MS estéril.
   4. Vórtice de H/G solução e transferi-lo para um segundo poço da mesma placa de 48.
   5. Corte o caule de uma planta de linho 2 meses a 10 cm acima do nível do solo usando uma nova lâmina de barbear.
   6. Delicadamente, prepare 50 secções transversais à mão livre da haste utilizando a lâmina de barbear (aproximadamente 150-250 µm espessura).
   7. Coloca imediatamente a secção transversal no meio de ½ MS estéril líquido em um vidro de relógio.
   8. Inspecione visualmente e seleccione secções transversais de todo intactos e distribuir aleatoriamente 10 na bem cheia com H_AZ/ soluçãoG_ALK .
   9. Repita a etapa 2.1.8 para o bem preenchida com H/G solução (como controle negativo).
   10. Repita a etapa 2.1.8 para um terceiro bem preenchido com 300 µ l de meio MS ½ (como controle de fundo para ajustar a linha de base da fluorescência durante o processamento de dados subsequente de imagens de microscopia confocal).
   11. Incube a placa na luz contínua em uma câmara de crescimento a 20 ° C para 20 h.
   12. Remova a solução de monolignol em cada poço com uma micropipeta.
   13. Adicionar 500 µ l de meio MS ½ a cada poço, mexa delicadamente por 10 min e remover esta solução com uma micropipeta de enxaguar. Repita 4 vezes e proceder à felicidade rotulagem imediatamente (secção 3).
2. Incorporação de repórter química nos caules toda linho de 2 meses
   1. Prepare uma solução de repórter química de 5 mL contendo 10 µM de G_ALK e 10 µM de H_AZ em meio líquido de ½ MS estéril.
   2. Vórtice o H_AZ/G_ALK solução e transferência para um teste de 20 cm de altura vidro tubo com uma pipeta.
   3. Prepare uma solução de controlo negativo de 5 mL contendo 10 µM de G e 10 µM de H em meio líquido de ½ MS estéril.
   4. Vórtice de H/G solução e transferência para um teste de vidro de 20 cm de altura tubo.
   5. Prepare um terceiro tubo de ensaio de vidro contendo 5 mL de meio MS ½ (como controle de fundo para ajustar a linha de base da fluorescência durante o processamento de dados subsequente de imagens de microscopia confocal).
   6. Corte o caule de uma planta de linho 2 meses a 10 cm acima do nível do solo usando uma nova lâmina de barbear. Descartar o sistema radicular e a parte inferior da haste e prossiga para o próximo passo com a parte superior do caule da planta.
   7. Mergulhe a base do caule todo cortado no tubo contendo o H_AZ/ soluçãoG_ALK . Coloque a haste em sua solução de incubação imediatamente após a remoção do sistema de raiz a fim de evitar a sua secagem.
      Nota: Se o método é aplicado para as plantas mais novo/mais velho e/ou de outras espécies, o volume de soluções de monolignol deve ser ajustado de acordo com o tamanho / idade da planta e o diâmetro do seu caule.
   8. Anexe o tronco para um suporte vertical para mantê-lo reto.
   9. Feche o tubo de vidro com parafilm para evitar a evaporação da solução.
   10. Repita as etapas 2.2.6-2.2.9 para a amostra de controlo negativo com o H/G solução.
   11. Repita os passos 2.2.6-2.2.9 para as amostras de controlo do fundo de fluorescência contendo o meio de ½ MS.
   12. Incube cada haste para 20 h em luz contínua usando uma luz de néon.
   13. Após 20 h de incorporação metabólica, retire a haste incubada no H_AZ/ soluçãoG_ALK e enxaguá-lo com ½ MS médio.
   14. Cortar e descartar a parte inferior da haste usando uma lâmina de barbear de 1 cm e depois preparar um cilindro alto de 1 cm da base da haste restante.
   15. Cuidadosamente, preparar 20 secções transversais à mão livre (aproximadamente 150-250 µm espessura) deste cilindro e coloque-os imediatamente em um vidro de relógio cheio de ½ MS médio.
   16. Colocar 500 µ l de meio MS ½ em um poço de uma placa de 48.
   17. Inspecione visualmente e selecione secções transversais de todo intactos e distribuir aleatoriamente 10 no poço preenchido com solução de ½ MS.
   18. Repita os passos 2.2.13-2.2.17 para a haste de controle negativo incubada com a solução de H/G .
   19. Repita etapas 2.2.13-2.2.17 para a haste de controle de plano de fundo de fluorescência incubadas com ½ MS médio.
   20. Remova cuidadosamente a solução em cada poço com uma micropipeta.
   21. Adicionar 500 µ l de meio MS ½ a cada poço, mexa delicadamente por 10 min e remover esta solução com uma micropipeta de enxaguar. Repita 4 vezes e proceder à felicidade rotulagem imediatamente (secção 3).
3. Incorporação de repórter química em mudas de linho 2 semanas
   Nota: As etapas a seguir são todos realizadas sob condições estéreis.
   1. Prepare uma solução de repórter química de 2 mL contendo 10 µM de G_ALK e 10 µM de H_AZ em meio líquido de ½ MS estéril.
   2. Vórtice o H_AZ/G_ALK solução e transferência para um teste de 20 cm de altura vidro tubo com uma pipeta.
   3. Prepare uma solução de controlo negativo de 2 mL contendo 10 µM de G e 10 µM de H em meio líquido de ½ MS estéril.
   4. Vórtice de H/G solução e transferência para um teste de 20 cm de altura vidro tubo.
   5. Prepare um tubo de ensaio de vidro 20 cm de altura terceiro contendo 2 mL do meio MS ½ (como controle de fundo para ajustar a linha de base da fluorescência durante o processamento de dados subsequente de imagens de microscopia confocal).
   6. Remover delicadamente um seedling de linho 2 semanas do meio sólido de ½ MS usando um longo par de pinças (secção 1.2. acima).
   7. Delicadamente, transferir o seedling no tubo contendo o H_AZ/ soluçãoG_ALK , garantindo que suas raízes estão imersos na solução.
   8. Feche o tubo de vidro com uma tampa de plástico para evitar a evaporação.
   9. Repita as etapas 2.3.6-2.3.8 para o tubo controle negativo com o H / solução G.
   10. Repita etapas 2.3.6-2.3.8 para o tubo de controle de fundo de fluorescência contendo o meio de ½ MS.
   11. Incube cada plântula em luz contínua em uma câmara de crescimento para 20 h a 20 ° C.
   12. Remover delicadamente o seedling incubado no H_AZ/ soluçãoG_ALK e enxaguá-lo com ½ MS médio.
   13. Delicadamente, prepare 20 cortes transversais à mão livre (aproximadamente 150-250 µm espessura) do hypocotyl.
   14. Colocar 500 µ l de meio MS ½ em um poço de uma placa de 48.
   15. Inspecione visualmente e selecione secções transversais de todo intactos e distribuir aleatoriamente 10 no poço preenchido com solução de ½ MS.
   16. Repita os passos 2.3.12-2.3.15 para o controle negativo seedling incubado com a solução de H/G .
   17. Repita etapas 2.3.12-2.3.15 para o seedling de controle de plano de fundo de fluorescência incubadas com ½ MS médio.
   18. Remova cuidadosamente a solução em cada poço com uma micropipeta.
   19. Adicionar 500 µ l de meio MS ½ a cada poço, mexa delicadamente por 10 min e remover esta solução com uma micropipeta de enxaguar. Repita 4 vezes e proceder à felicidade rotulagem imediatamente (secção 3).

3. dupla fluorescência rotulagem das amostras de seção transversal de planta por SPAAC e CuAAC

Nota: O BLISS protocolo é idêntico para todos os 3 modelos experimentais (secção 2).

1. Estirpe-promovido rotulagem azida-Alkyne cicloadição (SPAAC)
   1. Prepare-se 1 mL de uma solução SPAAC contendo 5 µM de DBCO-PEG₄-5/6-carboxyrhodamine 110 em meio líquido de ½ MS estéril. A solução de vórtice e mantê-lo no escuro.
   2. Após a lavagem final etapas do protocolo de incorporação metabólica [2.1.13, 2.2.21 ou 2.3.19 dependendo do design escolhido experimental], remova o meio MS ½ e adicione 300 µ l da solução de SPAAC por alvéolo com uma micropipeta.
   3. Protege a placa de luz de 48 por coberta com papel alumínio ou colocando-o em uma caixa.
   4. Agite suavemente a placa em um agitador mecânico por 1h no escuro à temperatura ambiente.
2. Cobre-catalisada rotulagem azida-Alkyne cicloadição (CuAAC)
   1. Lave cada um bem 4 vezes como descrito na etapa 2.1.13 mantendo a placa no escuro.
   2. Prepare-se 1 mL de uma solução CuAAC de ascorbato de sódio 2,5 mM, 0.5 mM CuSO₄ e 5 µM de PEG-5-TAMRA₃-azida em meio líquido de ½ MS estéril. A solução de vórtice e mantê-lo no escuro.
      Nota: Esta solução de CuAAC deve ser preparada antes de usar e não pode ser armazenada mais de alguns dias a 4 ° C.
   3. Remover o meio MS ½ em cada poço e adicionar diretamente 300 µ l da solução de CuAAC por bem utilizando uma micropipeta.
   4. Agite suavemente a placa em um agitador mecânico por 1h no escuro à temperatura ambiente.
   5. Remova a solução de CuAAC usando uma micropipeta.
   6. Utilizando uma micropipeta, adicione 500 µ l de ½ MS, mexa no escuro por 10 minutos em seguida remover esta solução de lavagem. Repita duas vezes.
   7. Adicionar 500 µ l de uma solução de água/MeOH 7:3, mexa no escuro durante 1 h, em seguida, remover a solução
      Cuidado: Metanol é tóxico por inalação ou contato de pele e é designado como um carcinógeno humano. Sua utilização requer luvas e exaustores de fumos químicos.
   8. Adicionar 500 µ l de ½ MS, mexa no escuro por 10 min, em seguida, remover a solução. Repita 4 vezes.

4. montagem de amostras em microscópio de Slides

1. Lugar 5 gotas de meio de montagem em um vidro de microscópio.
2. Depositar cuidadosamente cada H_AZ/G_ALKmarcados secção transversal no slide.
3. Aplica verniz em dois lados opostos do slide.
4. Cobrir a lâmina com uma lamela. Tenha cuidado para evitar bolhas de ar.
5. Remova o meio de montagem em excesso com uma toalha de papel.
6. Sele a amostra com esmaltes em todos os 4 lados. Deixa a unha verniz seco à temperatura ambiente (aproximadamente 30 min).
7. Repita as etapas 4.1-4.6 para a secção transversal H/G do controle negativo.
8. Repita as etapas 4.1-4.6 para a secção transversal da fluorescência controle do plano de fundo.
9. Armazene os slides a 4 ° C no escuro até observação sob um microscópio confocal.
   Nota: Slides preparados podem ser armazenados durante várias semanas a vários meses, dependendo da qualidade da preparação. Se uma nova observação deve ser feita após o armazenamento, certifique-se de que as amostras não secaram.

5. imagem aquisição pela microscopia Confocal de fluorescência

1. Ligue todas as unidades necessárias do sistema de microscopia confocal na ordem certa, de acordo com as instruções do fabricante.
2. Selecione o objectivo pretendido com a máxima abertura numérica e adaptado de excitação e emissão de comprimentos de onda (por exemplo, obj. 60 x, N.A. 1.2. Canal de autofluorescência: λ_ex 405 nm, λ_em 450 nm 25; Canal de H_AZ SPAAC: λ_ex 488 nm, λ_em 525 nm 25; CuAAC G_ALK canal: λ_ex 561 nm, λ_em 595 nm 25; modo sequencial).
3. Selecione os parâmetros desejados para geração de imagens no software (12 ou 16 bits exigido, pixel tamanho adaptado ao critério de Nyquist).
4. Coloque o slide HAZ/g_ALK no palco microscópio e posicionar a amostra sob a lente objetiva.
5. Observar e localizar a região desejada do tecido vegetal.
6. Adquirir imagens confocal de alta qualidade de duplamente etiquetados HAZ/g amostra_ALK .
   1. Selecione o plano mais fluorescente no eixo z.
   2. Ajustar o ganho, deslocamento e laser poder conseguir distribuição óptima do sinal ao longo da faixa de nível todo cinza para cada canal (autofluorescência, H_AZ e G_ALK). Os mesmos parâmetros devem ser aplicados para todas as aquisições de seguintes.
   3. Lançar a aquisição da imagem selecionada e salve o arquivo. Repita para cada área relevante da amostra.
      Nota: reconstruções 3D de Z-pilha também podem ser adquiridas se necessário.
7. Usando as mesmas configurações, adquira imagens de amostra sem marcas de formatação apenas incubada em ½ MS para determinar o nível de autofluorescência (controle de fundo fluorescência conforme descrito na secção 2).
8. Usando as mesmas configurações, adquira imagens para as amostras de controlo negativo incubadas com nativo monolignols H/G para determinar a adesão de fluoróforo específico para a amostra.
9. Aplica o tratamento de dados para as imagens adquiridas para subtrair sinais de autofluorescência de fundo em imagens de controlo negativo H/G e HAZ/g_ALK imagens.

Resultados

Usando o protocolo de BLISS apresentado envolvendo opaco e análogos sintéticos monolignol clique em química, é possível visualizar a dinâmica do processo de lignificação em plantas vivas. Ao contrário de técnicas estabelecidas para lignina visualização (tais como histoquímicas de coloração, immunolocalization ou autofluorescência), este 'duplo clique' protocolo exclusivamente destina-se a lignina produzida de novo durante a integração metabólica passo e diferencia a lignina preexistente da amostra com três canais celulares imagens por microscopia de fluorescência confocal (Figura 3). H _AZ-unidades são detectadas usando os excitação e emissão de comprimentos de onda do DBCO-PEG₄-5/6-carboxyrhodamine 110 especificamente é clicado para funções de azida de incorporados H_AZ moléculas durante a etapa SPAAC (λex 501 nm /λ_em 526 nm, canal verde), Considerando que G_ALK-unidades da mesma forma são detectadas em comprimentos de onda característicos da sonda azidefluor 545 é clicado especificamente para as marcas incorporadas alquino terminal de G _ALK durante a etapa de CuAAC (λex 546 nm /λ_em 565 nm, vermelho canal); o terceiro canal corresponde a lignina pré-existente, que é detectada usando sua autofluorescência intrínseca em 405 nm (canal azul). Essa abordagem conduz à geração de mapas de localização de três cores de lignina na parede celular das plantas que fornecem informações espaciais precisas sobre a presença ou ausência de maquinaria de lignificação ativo entre diferentes tecidos de um órgão (Figura 3A ), entre diferentes tipos de células do mesmo tecido (Figura 3B-C) e nas camadas da parede diferentes da mesma célula (Figura 3D). Em outras palavras, esta metodologia permite-nos destacar e especificamente localizar os sites de lignificação 'ativa' (H_AZ e canais_ALK G) por diferenciando-os das zonas onde a lignina foi formada em uma anterior estágio de desenvolvimento da planta (canal de autofluorescência). Além disso, a sensibilidade da técnica é dramaticamente maior quando comparado a autofluorescência e muito menores quantidades de lignina recém sintetizada podem ser detectada (Figura 3B).

Figura 3: imagem latente de repórteres de química monolignol incorporado em hastes de linho. (A) metade de uma seção transversal feito à mão de uma haste de linho, imagens reconstruídas. (B) close-up das camadas primeiras de diferenciar o xilema. Deixou o painel: lignina autofluorescência (azul, 405 nm), painel médio: mesclado autofluorescência de lignina (azul) e H_AZ fluorescência (verde, 526 nm) canais, painel direito: mesclado autofluorescência de lignina (azul) e G_ALK fluorescência (vermelho, 565 nm) canais. A seta indica a parede de pilha primeira rotulada do cambium ilustrando a sensibilidade aumentada de felicidade comparada com autofluorescência. (C) rotulagem em células de diferentes tipos de xilema secundária e (D) close-up em células de xilema secundário, ilustrando as rotulagem variações nas diferentes camadas da parede celular do mesma. Deixou o painel: mesclado autofluorescência de lignina (azul) e H_AZ fluorescência (verde, 526 nm) canais, painel médio: mesclado autofluorescência de lignina (azul) e G_ALK fluorescência (vermelho, 565 nm) canais, direito painel: mesclado autofluorescência de lignina (azul), H_AZ (verde) e canais de fluorescência G_ALK (vermelho). Localização de co H_AZ e G_ALK é representada em amarelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estratégias de repórter químicos tais como o método BLISS aqui apresentados ou os procedimentos de single-rotulagem anteriormente publicados por Tobimatsu et al ⁸ , portanto, pode permitir que um estudo muito mais fino do que anteriormente acessíveis métodos como imuno - ou coloração histoquímicos estando muito simples de implementar. Por exemplo, a Figura 4 ilustra que a intensidade de sinal para H_AZ/G_ALK incorporação em Traqueidos/vasos (FT) de fibra de linho xilema secundária é muito elevada no primeiras poucas paredes das células do cambium mas progressivamente diminui em células mais velhas. Este perfil é oposta da autofluorescência e indica que aquela máxima lignificação é alcançada muito rapidamente nas camadas primeiras célula dois ou três FT do cambium. Em contraste, as células de raio (R) parecem continuar lignificação de muito estágios posteriores de seu desenvolvimento como H_AZ/G_ALK incorporação é muito mais constante nas paredes de todas as células do cambium para o miolo. Não é surpreendente que a FT e R tipos de célula exibem lignificação contrastada dinâmica, desde que estes tipos de células têm diferentes papéis biológicos com diferenças associadas em seu programa de desenvolvimento. FTs são tubos com efeito alongados que amadurecem e morrem rapidamente, deixando morto vazias células com paredes espessas de alisamento prévio que desempenham um papel essencial no suporte mecânico e transporte vertical de água e minerais, Considerando que as linhas estreitas de R as células que compõem a xilema os raios estão vivos em seu estado maduro e funcional sem ter paredes grossas de alisamento prévio.

Figura 4: incorporação de repórter de monolignol células específicas em linho xilema. Vista de microscopia confocal Bright-campo (A) da parte de uma secção à mão livre de uma haste de linho. Rosa (Células cristalíferas de parênquima, R) e amarelo (células de fibra traqueides, FT) setas indicam vetores abrangendo da zona cambial em direção a medula e digitalizados para autofluorescência de lignina em 405 nm (B), H_AZ fluorescência em 526 nm (C) e G _ALK fluorescência em 565 nm (D). (E) exibição de xilema secundária. Deixou o painel: fundiu-se canais de fluorescência (vermelho) lignina autofluorescência (azul), H_AZ (verde) e G_ALK . Localização de co H_AZ e G_ALK é representada em amarelo. Painel direito: ilustração esquemática da estrutura de xilema secundário na haste de linho. V, navio; FT, traqueides de fibra; R, célula de parênquima do raio. Esta figura foi modificada de leão et al . ²³ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além disso, o uso de dois repórteres químicos distintos correspondentes a H-G-unidades e com duas reações opaco no BLISS protocolo permite mais resultados quantitativos a serem obtidos. Multiplexado rotulando estratégias tais como felicidade poderia fornecer insights adicionais sobre o controlo de monolignol proporções de incorporação em diferentes condições e pode contribuir para decifrar o processo de lignificação indescritível. Se as porcentagens relativas de H, G e S monolignols em Ligninas são realmente muito variáveis de acordo com a espécie, tecido, idade ou condições ambientais da planta, os intrincados mecanismos que regulam esta composição são ainda não completamente entendidos. A tecnologia de rotulagem duplo representa uma forma poderosa de investigar alguns dos parâmetros que regem a composição de lignina. Por exemplo, variando a H_AZ: G_ALK relação com felicidade nos permitiu demonstrar que a composição de lignina nos tecidos do xilema secundário é diretamente dependente da disponibilidade de monolignol dentro das paredes da célula, em vez de especificidade de peroxidase/lacase (Figura 5).

Figura 5: Efeito de incubação seções de tronco de linho com percentuais diferentes rácios de H_AZ e G_ALK. H_AZ: G_ALK% rácios são dadas acima de cada coluna de figuras. Top: fundiu-se canais H_AZ e G_ALK . Fundo: histogramas indica a intensidade de fluorescência média de H_AZ e G_ALK para as relações de diferentes %. Os valores são expressos como média da intensidade média de fluorescência em níveis de cinza ± SD. escala barra = 100 µm. esta figura foi modificada de leão et al. ²³ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Linho é cultivado para suas fibras liberianas (BF) que são usadas para fabricar produtos têxteis, artigos de luxo ou ambiente materiais compósitos. Um aspecto importante de sua valorização industrial é que eles contêm níveis muito baixos de lignina em suas paredes celulares, que se caracterizam por uma extremamente grossa S2/G camada secundária^19,24. FELICIDADE pode destacar diferenças de lignificação dinâmica entre as diferentes camadas da parede celular do mesma. Figura 6A mostra que H_AZ e G_ALK incorporação repórter limitam-se aos cantos de celular e lamela média/primário parede celular de algumas mas não todas as fibras liberianas. A ausência total de lignificação na camada grossa fibras liberianas secundário celular parede mesmo quando monolignol química repórteres são exogenamente fornecido revela que seu estado de hypolignified decorre a ausência de um ambiente molecular adequado para oxidação mediada enzimaticamente e incorporação de monolignols em uma cadeia de polímero crescente, e que não é apenas devido à regulação transcricional de genes de biossíntese de monolignol como anteriormente relataram²⁵. Esta observação também se correlaciona bem com o fato desse linho peroxidase de genes são acima-está regulada nos tecidos estaminais exterior do linho química lbf1 mutante que possui alisamento prévio fibras liberianas²⁶.

Figura 6: BLISS destaca as diferenças específicas de subestrutura ou camada de parede celular. Painel da esquerda (A): imagem brilhante-campo de uma seção de tronco de linho. O círculo indica um feixe de fibras. Painel direito: close-up em fibras liberianas. Fundiu-se canais H_AZ e G_ALK (com e sem campo claro) mostrando que lignificação é limitada aos cantos da célula () e parede celular de lamela média/principal de algumas fibras liberianas. BF, fibras liberianas; Par, células de parênquima; M, lamela média; P, parede celular primária; S1, primeira camada da parede de pilha secundária; S2/G, secundária camada/gelatinosa camada da parede de pilha secundária. (B) fatia 2D e reconstrução 3D de zoom confocal z-pilha da região de linho raiz endoderme. Faixa de Caspari () só exibe autofluorescência e não incorporar H_AZ ou G_ALK. O associado fluorogram mostra um G_ALK/H_AZ anticorrelação: alta fluorescência verde é associada ao baixo sinal vermelho (córtex) e vice-versa (endoderme). Periciclo (P), endodermes (E), Cortex (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Finalmente, esta metodologia de duas cores também pode fornecer informações valiosas sobre o 'estado de lignificação' de subestruturas de parede celular em vários estádios de desenvolvimento e em órgãos da planta que não seja o caule. Por exemplo, a endoderme da raiz de linho é caracterizada pela existência de uma faixa de Caspari em suas paredes celulares radiais e transversais durante os estágios iniciais de desenvolvimento. Esta banda de biopolímero hidrofóbico, feito de suberina ou lignina, impede que a água e solutos retomados pela raiz de entrar passivamente através do apoplasto e obriga-os a atravessar a membrana plasmática através da rota simplástica, contribuindo para a capacidades de absorção seletiva das raizes da planta. Quando aplicado às raízes de linho, nossa estratégia mostrou que H_AZ e G_ALK são incorporados nas paredes tangenciais das pilhas endodermal, bem como em partes das paredes radiais onde a banda de Caspari está ausente (Figura 6B). No entanto, total ausência de incorporação de repórter monolignol na faixa de Caspari propriamente dito indica que é maduro nesta fase do desenvolvimento enquanto as outras paredes ainda são o local de deposição de biopolímero ainda mais. Reconstruída vista 3D de um z-pilha claramente traz a banda de Caspari à luz. Curiosamente, as paredes de algumas células corticais adjacentes para a endoderme também provou ser capazes de incorporar H_AZ preferencialmente (assim, indicando a presença de lignina/suberina no córtex da raiz de linho) mas não G_ALK. Análise de localização co mostrou uma anti-correlação H_AZ e G_ALK, que sugerem a existência de maquinaria enzimática/estrutura de parede celular específico nestes dois tipos de célula adjacente.

Suplementar tabela 1: preparação do meio sólido MS ½ Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementar tabela 2: preparação de soluções estoque repórter química Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Como mencionado anteriormente, o protocolo de BLISS duplo rotulagem apresentado neste trabalho é um dos primeiros exemplos de uma combinação SPAAC/CuAAC em vivo^12,23. Cada passo foi cuidadosamente otimizado e validado, e é muito importante que seja respeitada a ordem em que os dois clique química reações de rotulagem são executadas sequencialmente (i.e., SPAAC em primeiro lugar, seguido por CuAAC). Todos os controles-Cruz mostram que cada etapa de rotulagem é específica, quando o protocolo de BLISS é aplicado²³ : primeiro efectuar o passo SPAAC leva para o chemoselective altamente rotulagem das funções de azida de_AZ Hpelo cyclooctyne-acrescida fluoróforo através de uma reação de cicloadição [3 + 2] com cinética rápida. Uma vez que H_AZ unidades são marcadas, o passo de CuAAC, necessitando de cobre catalisada por ativação de G_ALK alcinos terminais para gerar links de triazole pela reação com a sonda 545 azida-fluor pode ser realizado. Em contraste, a ordem inversa (ou seja, CuAAC em primeiro lugar, seguido por SPAAC) não deve ser usado como conduz a unidade G_ALK e H_AZ acoplamento cruzado, que concorre com o fluoróforo ligadura e induz uma dramática perda de sinal . É também importante salientar a necessidade das etapas de lavagem intermediária para evitar coloração não específica.

Mostramos que o nosso método pode ser aplicado a vários projetos de experimento biológico. O BLISS protocolo foi primeiro aplicado a secções transversais à mão livre de hastes de linho (aproximadamente 150-250 µm espessura) que anteriormente foram cortadas e incubados com o monolignols clique-pronto. Embora este projeto tem a vantagem de minimizar as quantidades necessárias de repórter química (como volumes de incubação são reduzidos) e de facilitar a produção de estatísticas Replica, não é, estritamente falando, um sistema em vivo e em alguns casos, podem não refletir todos os aspectos da dinâmica de lignificação real espácio-temporais. Em um segundo projeto experimental, adaptamos, portanto, o protocolo de felicidade para um método que foi usado anteriormente para estudar a incorporação de radiolabeled monolignols em pinho e gingko²⁷. Nesta abordagem, as raízes e caule da planta são fisicamente separados e a base do caule inteiro é incubada na solução monolignol no que pode ser apelidado da abordagem de 'vaso de flor'. Depois de deixar as hastes o tempo desejado (incubação), secções transversais são o corte e o protocolo de felicidade realizado. Isto nos permitiu mostrar (i) que o monolignols modificados são transportados através da haste de vida e são incorporados no cultivo de polímeros de lignina dentro das paredes da célula e (ii) que o padrão de localização foi essencialmente idêntico da secção transversal abordagem. Este tipo de experiência tem o mérito de ser executada em uma planta de vida real / célula viva abordagem permitindo mais experiências e estudos mais aprofundados, mas requer maiores quantidades de químico repórter. Finalmente, o protocolo de felicidade também foi usado com mudas da planta do linho, que representa um verdadeiro modelo de planta, em que os repórteres químicos devem ser absorvidos através das raizes antes de ser transportada até o tronco a viver. Enquanto este modelo tem a clara vantagem de ser realizada em plantas vivas, na prática, é limitado para seedlings novos e não é muito adequado para investigar a dinâmica de lignificação em plantas mais velhas por razões práticas (tempo de incubação longa, elevado quantidade de repórteres químicas). No entanto, estes projetos de três experimento são complementares e todos têm seus prós e contras em relação a aspectos práticos e significado biológico, dependendo do tipo de biológica pergunta a ser respondida.

Desenvolvido para estudar a dinâmica de lignificação em linho, nosso protocolo é altamente adaptável, não só em termos de design de experiência biológica, mas também em termos de sua aplicação para outro plantar espécies e órgãos/tecidos. Por exemplo, BLISS facilmente pode ser transferido para a Arabidopsis ou Populus gêneros que são mais receptivos a estudos com mutantes de mata-mata ou knock-down por vários genes. Em princípio, duplos rotulagem estudos com nossa abordagem também podem ser estendidos a outras biomoléculas usando dois precursores modificados distintas de polímeros de parede celular de plantas - incluindo todos os três principais monolignols ou seus precursores metabólicos, bem como vários monossacarídeos que constituem a matriz de polissacarídeo. Desde a sua criação, opaco química de fato foi principalmente desenvolvida para investigar os glicanos/polissacarídeos através de oligossacarídeo metabólica engenharia (MOE)^4,5,17,28, Mas surpreendentemente há apenas poucas aplicações para a biologia da planta até agora^{7,8,9,10,11,12}. Em termos de compatibilidade das reações, o estudo da lignina era de fato um caso complexo para resolver como ambos os repórteres químicos são incorporados o mesmo polímero reticulado. A possibilidade de sem rótulo H_AZ- formação de ligações cruzadas_ALK Gera o principal problema para superar devido à proximidade espacial de G_ALK e H_AZ unidades dentro do 3D estrutura de lignina²³, uma limitação que pode não estar presente se o dois repórteres químicos não são incorporados no mesmo tipo de biopolímero ou na mesma região espacial de qualquer determinada célula.

Em um âmbito mais vasto a metodologia BLISS essencialmente poderia ser aplicada a qualquer estudo de imagens de fluorescência de duas cores em modelos animais ou bacterianos usando dois repórteres químicos distintos tendo uma azida e marca alquino terminal, respectivamente.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ)			Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK)			Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
2% sodium hypochlorite
20 cm high glass tube
250 mL Schott glass bottle
48-well Plate
5/6-TAMRA-PEG3-Azide	Jena Bioscience	CLK-AZ109-1
Aluminium foil
Cheese cloth
Compost containing clay
Coniferyl alcohol (G)	Sigma Aldrich	MFCD00002922
Copper (II) sulfate pentahydrate
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110	Jena Bioscience	CLK-A127-1
Milli-Q Ultrapure water
Eppendorf 1,5 mL
EtOH
Flax seeds (L. usitatissimum L.)
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Glass coverslip
Glass microscope slide
Growth chamber	CLF-Plant Climatics		For 2-week-old plants culture
Growth chamber	Angelantoni Life Sciences		For 2-month-old plants culture
Magenta plant culture box			For 2-week-old seedling culture
Methanol			Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood
Micropipette
Nail polish
Nikon A1R confocal microscope	Nikon
Orbital shaker
Parafilm
p-Coumaryl alcohol (H)	Carbosynth	FC145653
Plastic cap
Plastic pipette
Plastic pot			For 2-month-old plants culture
Razor blade
Rubber band
Sodium Ascorbate
Sterile clamp
Vertical support
Vortex
Reagents for liquid and solid ½ MS medium
KH2PO4
KNO3
NH4NO3
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
Glycine
Nicotinic acid
Myo-inositol
Saccharose
MES hydrate
Agar