Proyección de imagen multimodal jerárquica de secciones seriadas para encontrar dianas celulares específicas dentro de grandes volúmenes

Resumen

Este protocolo está dirigido a células específicas en el tejido para la proyección de imagen en resolución de nanoescala utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM). Gran número de secciones seriadas del material biológico embebido en resina es primero reflejada en un microscopio de luz para identificar el destino y luego de manera jerárquica en la SEM.

Resumen

Dirigidos a células específicas en resolución ultraestructural dentro de una población de mezclado de la célula o un tejido pueden lograrse mediante la proyección de imagen jerárquica utilizando una combinación de luz y microscopia electrónica. Muestras incrustadas en resina son seccionadas en matrices consisten en cintas de cientos de secciones ultrafinas y depositadas sobre trozos de oblea de silicio o cubreobjetos conductively cubierto. Arreglos de discos son imagen en baja resolución usando un consumidor digital como cámara del smartphone o microscopio de luz (LM) para una visión rápida área grande o un microscopio de fluorescencia de campo ancho (fluorescencia microscopía (FLM)) después de etiquetar con fluoróforos. Después de la tinción con metales pesados, arreglos de discos son imagen en un microscopio electrónico de barrido (SEM). Selección de objetivos es posible de reconstrucciones 3D generadas por FLM o de reconstrucciones 3D hacen de las pilas de imágenes de SEM en resolución intermedia si no hay marcadores fluorescentes están disponibles. Para el análisis ultraestructural, objetivos seleccionados finalmente se registran en el SEM en alta resolución (píxeles de imagen de algunos nanómetros). Se demuestra una herramienta de manejo de la cinta que puede ser adaptada a cualquier ultramicrótomo. Ayuda con matriz producción y eliminación del sustrato desde el barco de cuchilla de seccionamiento. Una plataforma de software que permite la proyección de imagen automatizada de matrices en el SEM se discute. En comparación con otros métodos de generación de datos de gran volumen EM, como la cara de bloque serie SEM (SBF-SEM) o viga de ion enfocada SEM (FIB-SEM), este enfoque tiene dos ventajas importantes: (1) la muestra embebido en resina se conserva, aunque en una versión en rodajas. Puede ser teñido de diferentes maneras y reflejada con diferentes resoluciones. (2) como las secciones pueden ser post-manchadas, no es necesario utilizar muestras fuertemente teñidas de bloque con metales pesados para introducir contraste para la proyección de imagen de SEM o bloques de representación de los tejidos conductores. Esto hace que el método aplicable a una amplia variedad de materiales y cuestiones biológicas. Materiales especialmente con prefijo por ejemplo, de los bancos de la biopsia y laboratorios de patología, puede directamente ser incrustado y reconstruido en 3D.

Introducción

Para la reconstrucción de grandes volúmenes de tejido en resolución ultraestructural de los diferentes métodos de proyección de imagen basada en SEM han sido usadas¹: exámenes amplios están disponibles por ejemplo., SBF-SEM², FIB-SEM³y matriz Tomografía (a)⁴. Mientras que para este último método la muestra del material se conserva como un conjunto de secciones seriadas en un substrato, SBF-SEM y FIB-SEM son métodos destructivos, trabajando en el bloque de muestra y consumirla durante proyección de imagen. Debido a la carga de la resina en el SEM, también dependen fuertemente metalizada muestra bloques⁵.

Por otra parte, identificar ciertas células o estructuras de interés dentro de una muestra de tejido puede beneficiar particularmente de correlativa luz y microscopia electrónica (CLEM)^6,7,8. Utilizando FLM para apuntar excluye la aplicación de grandes cantidades de metales pesados ya que esto sería apagar la señal de la fluorescencia del⁹. Para dichas muestras ligeramente metalizados único, AT es el método de elección desde matrices pueden ser fácilmente posterior tinción con metales pesados después de la proyección de imagen de LM. Por otra parte, casi cualquier tipo de muestra puede utilizarse para AT, incluso rutinarias muestras desde el patólogo tesoro pecho¹⁰.

Otra gran ventaja del AT es el potencial de jerárquico¹¹ o proyección de imagen de resolución múltiple¹²: no es necesario a la imagen todo en alta resolución, como metas pueden seleccionarse en una modalidad diferente (por ejemplo, FLM) o en baja resolución imágenes de SEM. Sólo las regiones interesantes de una población de tejido o células en alta resolución de imagen ahorra espacio de almacenamiento de datos digitales y produce pequeños conjuntos de datos de la imagen, que son más fáciles de manejar. Aquí, el flujo de trabajo de AT se demuestra utilizando una muestra más bien débil metalizada: alta presión congelados a raíz de la planta (Arabidopsis thaliana) incrustado en resina hidrofílica.

Se explicó cómo los arreglos son preparados, manchados y reflejados en FLM y SEM, y cómo se colocan las pilas de imágenes. Además, se ilustra cómo la reconstrucción 3D del volumen FLM se puede utilizar para seleccionar celdas específicas para la proyección de imagen en el SEM en escala nanométrica resolución.

Protocolo

Nota: Muestra los bloques deben ser polimerizados y contienen algunos metales pesados. Fijación y embebido de protocolos para las dos muestras que se muestra en la figura 1A-B se han describen en otra parte¹¹. En Resumen, la muestra que se muestra en la figura 1A se fijó químicamente, teñidos en bloque primero con 1% OsO₄, luego con el 1% acetato de uranilo y embebida en resina de Spurr. La muestra se muestra en la figura 1B se alta presión congelada, congelar sustituidos con acetato de uranilo de 0.4% en acetona y embebida en resina Lowicryl HM20. Utilice guantes sin talco para los pasos de preparación.

1. creación de matrices

1. Corte del bloque de muestra
   Nota: Apriete siempre los tornillos bien al insertar piezas.
   1. Inserte el bloque de muestra en el portamuestras de la ultramicrotomía, coloque el soporte en el bloque de ajuste y deslice en la etapa más baja de la ultramicrotomía.
   2. Adorno resina lejos alrededor del tejido embebido con una cuchilla dejando solo un pequeño borde de resina alrededor de la muestra. Recorte de la parte superior hasta llega a la meta.
      Nota: La forma de la cara de bloque puede ser trapezoidal o rectangular (nosotros hemos utilizado con éxito ambas formas). Es importante utilizar los lados más largos del rectángulo como el líder y el borde de fuga para asegurarse de que un área está cubierto por la mezcla de pegamento que estabiliza las cintas.
   3. Inserte el soporte de la muestra en el brazo de la ultramicrotomía y reemplace el bloque de corte en la etapa inferior de soporte de la cuchilla. Inserte un cuchillo de corte de diamante (normalmente 45°), soporte de la cuchilla. Alinee la cara de bloque exactamente paralela al borde de cuchillo de corte.
      Nota: Para producir exactamente paralelo (parte inferior) y líderes trailing bordes (superiores), girar o mover sólo la cuchilla para recortar los lados opuestos. Para volúmenes grandes (más de varios cientos secciones), un cuchillo de corte de 90° es ventajoso.
   4. Suavizar los cuatro lados, luego gire el sostenedor de la muestra para que el borde de fuga y líderes están ahora en posición horizontal.
   5. Cubra cuidadosamente los lados principales y al final del bloque con mezcla adhesiva. Utilice un cepillo pequeño formado de pelos unos fijado a un palillo de dientes¹³. Realizar este paso rápidamente, porque el solvente de esta mezcla se evapora en segundos. No contamine el bloque de cara con esta mezcla. Deje que se seque durante 5-10 min el bloque de muestras revestidas.
      Nota: para un mayor número de secciones (> 200), puede ser mejor cubrir el borde solamente, porque con el tiempo, un bombeo de cola podría construir en el borde de fuga y potencialmente tire las secciones sobre el filo de la navaja.
2. Preparación del sustrato
   1. Cortar las obleas de silicio a un tamaño que encaja en el barco de cuchillo (aproximadamente 2 x 2, 5 cm² para el cuchillo Jumbo). Si es necesario, marcar los trozos de oblea (números o letras) con una punta de trazar del diamante antes de limpiar o con marcador permanente después de la limpieza. Limpie la oblea de silicio manualmente con isopropanol y pelusa.
      Nota: Para la proyección de imagen correlativa utilice óxido de estaño indio (ITO)-recubiertas de vidrio cubreobjetos. Debe manejarse con mucho cuidado y limpieza extra no es necesario.
   2. Fijar el sustrato a un extremo de la placa portadora con un adhesivo removible.
      Nota: Como alternativa, los bordes del sustrato pueden ser inmovilizados paralelo al filo de la navaja con dos bandas de cinta adhesiva.
   3. Plasma Active (descarga del resplandor) el sustrato con aire para obtener una superficie hidrofílica. Esto debe hacerse de tal manera que una gota de agua se coloca sobre el sustrato se extiende a una capa muy delgada (ángulo de contacto baja, figura 2, D). Hydrophilization parámetros dependen del dispositivo usado; para los parámetros utilizados aquí, consulte la Tabla de materiales.
      Nota: Activación de Plasma es muy volátil, así que realizar este inmediatamente antes del uso del sustrato.
   4. Introduzca el portador en la abrazadera de un soporte de sustrato, con el sustrato montado más cerca para el filo de la navaja para lograr la óptima adherencia de soldadura del sustrato en el barco de cuchillo.
      Nota: Una descripción detallada de la titular de sustrato, incluyendo los dibujos de diseño asistido por ordenador (CAD), se da en Wacker et al. ¹¹
3. Preparación de seccionamiento
   1. Inserte un cuchillo del diamante enorme soporte de la cuchilla, ajuste el ángulo de separación (a 0° para cuchillo Jumbo) y llenar el barco de cuchillo con agua destilada. Enfoque el cuchillo a una distancia de 1-2 mm a la muestra.
   2. Baje el sustrato en el agua usando tornillos de 1-3 (figura 2A) del soporte del sustrato. Compruebe que la línea de flotación está situado en el tercio superior del sustrato.
      Nota: Compruebe que el pegamento entre el sustrato y portador de la placa es bien curado por empujar el sustrato con pinzas limpias. No debe moverse.
   3. Porque es difícil ver la distancia al suelo cuando se utiliza una oblea de silicio, baje el sustrato hasta que sienta que toquen el suelo. Ahora Levante el sustrato un poco. Asegúrese de que el sustrato ni el portador toca el barco de la cuchilla durante el corte.
   4. Utilice una jeringa o pipeta para ajustar el nivel del agua en el barco. Mirando por los binoculares, agregar o quitar el agua hasta que el área completo de la superficie del agua muestra una reflexión homogénea de la iluminación de la luz superior de la ultramicrotomía.
   5. Encender la luz inferior de la ultramicrotomía. Asegúrese que el brazo esté en la posición intermedia y no en Contracción mediante el volante de la ultramicrotomía. Enfoque el cuchillo a la muestra hasta que el reflejo del filo de la navaja es visible en la cara del bloque.
   6. Utilice las opciones de ajuste de la ultramicrotomía para alinear la muestra para el cuchillo. En primer lugar girar el cuchillo, luego gire e incline la muestra.
      Nota: Se alinea correctamente si la franja de luz, que puede verse en la diferencia entre la muestra y el cuchillo, muestra aristas paralelas (rectas paralelas y no en forma de cuña).
   7. Compruebe la inclinación de la muestra: Asegúrese de que la franja de luz no es más gruesa o más delgado mientras se mueve hacia arriba y hacia abajo la muestra. Si es necesario, utilice el tornillo de ajuste del arco para corregir esto. Mover la cuchilla más cercano a la muestra hasta que está justo encima de la cara de bloque (pero sin tocarlo).
   8. Ajuste grueso de la sección (alimentación), corte de velocidad y ventana de corte en la unidad de control.
   9. Iniciar sección. Si es necesario, espere a que la primera sección completa se está cortando. Cortar algunas secciones para asegurarse que peguen a cintas de forma (de lo contrario el pegamento debe aplicarse otra vez). Empezar con un alimento de alto valor (máximo 200 nm para el cuchillo Ultra) hasta que se corte la primera sección completa. A continuación, establezca el valor deseado de la alimentación. Para la estabilidad de la cinta adecuada, un espesor de sección de 100 nm y una velocidad de corte de 1 mm/s es un buen punto de partida. El menor espesor de sección alcanzables es alrededor de 60 nm, dependiendo de la calidad de la muestra.
   10. Deje de seccionamiento. Uso de pelo de un gato de la pestaña de barcos y elimine todas las secciones (cortadas parcial) innecesarias desde el filo de la navaja. Si hay muchos pequeños escombros flotando alrededor, quitar el agua con una pipeta y llenar el bote con agua fresca. Ahora el proceso está listo para la primera cinta productiva.
4. De seccionamiento
   1. Iniciar sección. Una vez que se ha cortado varias secciones (el número depende del tamaño de las secciones y el substrato), detener el proceso de seccionamiento y suelte la cinta desde el filo de la navaja por acariciando suavemente sobre el filo de la navaja con una pestaña¹⁴ o mejor aún, con una muy pelo suave de la piel de un gato.
   2. Manipular (vaivén) la cinta con la pestaña hacia el sustrato y la primera sección en el sustrato.
      Nota: Es necesario empujar suavemente la cinta hasta que se pega a la parte seca del sustrato.
   3. Continuar seccionamiento y colocar las cintas al sustrato. Empezar en un lado y poco a poco más hacia el otro con cada nueva cinta.
      Nota: Evitar movimientos del agua enorme para evitar aflojar las cintas ya adjuntas. Lo mismo vale para las corrientes de aire. Utilice el protector de respiración con el ultramicrótomo. En condiciones ambientales desfavorables, un recinto para la ultramicrotomía se recomienda¹⁵.
   4. Cuando el sustrato está completamente forrado con cintas (generalmente 4-5 cintas son factibles), suavemente Levante-hacia fuera el sustrato desde el barco de cuchillo con los tornillos micromanipulador del soporte del sustrato.
      Nota: Los movimientos convenientes son: levantar verticalmente (tornillo 1) y rotación e inclinación (tornillo 3), o una combinación de ambos.
   5. Deje que se seque antes de guardarlo en un ambiente libre de polvo la matriz de cinta. Después de secar, quitar el sustrato adhesivo de montado tan pronto como sea posible de la compañía (en el mismo día, si no el substrato puede ser difícil de quitar o incluso se puede romper durante el desmontaje).

2. tinción para la proyección de imagen de LM

Nota: Diferentes métodos de tinción/etiquetado son posibles, incluyendo protocolos de inmunofluorescencia. Aquí una mancha directa, más bien inespecífica es elegida para delinear las paredes celulares.

1. Tinción de yoduro de propidio
   1. Cubrir el fondo de un vaso grande de Petri (30 cm de diámetro) con parafilm y la línea del borde del plato con tejido mojado para crear una cámara húmeda.
   2. Utilice aproximadamente 300-500 μl de solución por cubreobjetos. Coloque una gota de cada cubreobjetos en el parafilm y poner el vaso boca abajo en la gota, para que las secciones están en contacto con el líquido de tinción. Cubrir el plato y envolver con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz. Incubar las muestras durante 16 horas a 4 ° C.
   3. Quite el cubreobjetos con pinzas y lavarlo moviéndolo arriba y abajo en un vaso de precipitados de 100 mL con 80 mL de agua destilada. Repita este paso en otro vaso de precipitados con agua fresca. Seque el cubreobjetos cuidadosamente con aire comprimido.

3. la pila de imágenes de la grabación en la FLM

1. Coloque el cubreobjetos en el escenario de un FLM gran campo común.
2. Elija el conjunto de filtro apropiado (Tabla de materiales) para que la fluorescencia que se observarán.
3. Con un objetivo conveniente, tomar una imagen del objeto en cada sección: tratar de llenar el campo de visión y mantener la orientación constante. Para la punta de la raíz, se utilizó el objetivo 40 X aire.
   Nota: Si las cintas no son perfectamente rectas, un escenario giratorio puede ayudar a reorientar las secciones mientras esté tomando imágenes. Si es posible, centrar la imagen en una característica específica o mantener una característica como el borde de la sección a la misma distancia al borde de la imagen grabada.
4. Si es posible, utilizar 16 bits para limitar pixeles saturados y mantener constante el tiempo de exposición.

4. el registro de la pila de la imagen FLM

1. Importar la imagen de la serie en Fiji¹⁶ como una pila virtual.
2. Abra un nuevo TrakEM¹⁷ (en blanco) desde el menú archivo.
3. Haga clic derecho en el campo de la imagen e importar la pila en TrakEM como "Una rebanada por capa".
4. Alinear capas (click derecho en el campo de la imagen), el rango (imagen primero al último) y elija ninguno como referencia. Para todos los ajustes, utilice los valores predeterminados y elija rígido como la transformación deseada.
5. Cuando el registro está terminado y satisfactorio, excepto el conjunto de datos alineado por clic derecho y elija Exportar. Imagen plana, establecer el intervalo de la primera a la última imagen y deje que el software muestre la pila resultante. Guarde la pila en formato tif.

5. tinción y montaje para la proyección de imagen de SEM

Nota: Para la preparación de soluciones de tinción véase Tabla de materiales. Soluciones pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta por 12 meses, protegido de la luz y el aire.

PRECAUCIÓN: Citrato y uranilo acetato de plomo contienen metales pesados que son tóxicos. Utilice guantes y desechar los residuos de acuerdo con las instrucciones de las autoridades locales.

1. Cubrir el fondo de un vaso grande de Petri (30 cm de diámetro) con parafilm y la línea del borde del plato con tejido mojado para crear una cámara húmeda.
   Nota: Es importante que varias pastillas de NaOH se colocan dentro de la caja Petri cerca de las gotas de tinción para prevenir la precipitación excesiva de citrato de plomo.
2. Tinción de acetato de uranilo
   1. Centrifugue la solución de acetato de uranilo a 2.680 x g durante unos segundos a las pequeñas partículas de sedimento.
   2. Utilice aproximadamente 300 – 500 μl de solución por cubreobjetos. Coloque una gota de cada cubreobjetos en el parafilm y poner el vaso boca abajo en la gota, para que las secciones están en contacto con el líquido de tinción.
   3. Incubar 10 min a temperatura ambiente y cubrir el plato durante la coloración.
   4. Quite el cubreobjetos con pinzas y colada moviendo hacia arriba y hacia abajo en un vaso de precipitados lleno de agua destilada (ver paso 2.1.3).
3. Provocar manchas de citrato
   1. Durante la incubación de acetato de uranilo, preparar la solución de citrato de plomo.
      Nota: Citrato de plomo siempre debe filtrarse inmediatamente antes del uso para quitar cualquier precipitados. También centrifugar la solución de citrato de plomo a 2.680 x g durante unos segundos como en el paso 5.2.1.
   2. Utilice aproximadamente 300 – 500 μl de solución por cubreobjetos. Coloque una gota para cada cubreobjetos en el parafilm inmediatamente antes de lavar los cubreobjetos después de la tinción de acetato de uranilo y poner el vaso boca abajo en la gota, para que las secciones están en contacto con el líquido de tinción. Coloque las gotas (300 – 500 μl) en el parafilm inmediatamente antes de lavar los cubreobjetos después de la tinción de acetato de uranilo.
      Nota: Para evitar la formación de precipitados, no respirar sobre las gotas de citrato de plomo.
   3. Coloque el cubreobjetos lavado boca abajo sobre la gota (no es necesario secarla).
   4. Incubar por 5 min a temperatura ambiente y cubrir el plato durante la tinción.
   5. Quite el cubreobjetos con pinzas y lavarlo como se describió anteriormente en un vaso con agua (paso 5.2.4).
4. Seque el cubreobjetos cuidadosamente con aire comprimido.
5. Montaje de las muestras para la proyección de imagen de SEM
   1. Monte las obleas de silicio en los talones de aluminio con una almohadilla adhesiva carbono.
      Nota: Cubreobjetos recubierto ITO pueden o bien montarse mediante pintura de plata y cinta de Cu, asegúrese de que la superficie del conductor está conectada a la evacuación, o con pastillas de carbón que el anterior. En ese caso, es posible una Unión de la superficie de ITO para el talón con una gota de pintura de plata.

6. proyección de imagen en el SEM jerárquica

Nota: En una emisión de campo SEM, elegir una energía primaria baja (3 kV o menor), una viga actual en un rango de 50 a 800 pA para evitar la carga y una distancia de trabajo adecuada para la recolección eficiente de electrones secundarios o back-esparcidas. Selección de la corriente de la viga depende de las propiedades de la muestra (por ej., incrustación de resina); la dosis de electrones también será un compromiso entre una pequeña corriente (menos perjudicial para la muestra) y una corriente alta, que es beneficioso para la velocidad de la proyección de imagen y por lo tanto disminuye el tiempo de adquisición de imagen total. Detectores de dedicado para los electrones detrás-dispersados proporcionan buen contraste, son menos sensibles a la carga de la muestra y ver menos de artefactos de superficie de la muestra (pliegues, marcas de cuchillo). Brillo y contraste deben ajustarse tales que el histograma esté centrado.

1. Proyección de imagen de SEM
   1. En primer lugar definir las cuatro esquinas de la matriz por el acaparamiento de una imagen de cada esquina en la ampliación baja, de 100 x. Crear una región de interés (ROI) que encierra la matriz entera. Asignar un imagen protocolo con los siguientes parámetros: un detector de electrones secundarios (SE), que permite la proyección de imagen de alta velocidad en un tamaño de píxel de imagen grande (por ejemplo 1.000 nm) y en un tiempo corto (por ejemplo, 0,2 μs).
      Nota: Para superar las limitaciones ópticas electrones en un gran análisis campos de vista (FOV), que podría dar lugar a distorsiones en la periferia de las imágenes, usar modos de ampliación baja dedicada (proporcionados por la mayoría de los fabricantes SEM) o medio, campos de exploración de 1 a 2 k para imágenes individuales.
   2. Generar una sección mediante la creación de un ROI que sólo el tejido en la primera sección. Clonar a todas las secciones posteriores utilizando la herramienta Tampón. Gire el ROIs cuando sea necesario para acomodar las cintas dobladas.
   3. Grabar la serie de imagen con un tamaño de píxeles intermedios (alrededor de 50 nm) y una permanencia de tiempo el tiempo suficiente para identificar y reconocer la estructura diana. Utilizar un campo de visión de imágenes individuales en un rango de 6-10 k píxeles.
      Nota: El software Atlas 5 puede recopilar automáticamente mosaicos compuesto por imágenes adyacentes para cubrir áreas grandes de ROI de sección a través de las secciones seriadas.
   4. Crear un sitio dentro de este conjunto de sección, que contiene la estructura de destino para la proyección de imagen de mayor resolución SEM. Realizar el retorno de la inversión bastante grande en cuenta para la precisión de la etapa. Comprobar y ajustar las posiciones de los sitios.
      Nota: Es importante colocar el ROIs de tal manera que el centro, donde se realizará el autofocus y autostigmation, no se siente "vacío" material con ningún detalle estructural, por ejemplo., vacuolas.
   5. Definir los ajustes de enfoque automático y comprobar el rendimiento al menos la longitud de una cinta (es decir, la distancia más larga que la etapa tiene para viajar) en un pequeño ROI cerca del sitio que será fotografiado.
   6. Definir un protocolo para la adquisición de SEM de alta resolución de imagen. Ver compartimentos de membrana, elegir tamaño de pixel de imagen de 3 a 5 nm. Seleccione un tiempo de permanencia según el detector de modo que la imagen no es muy ruidosa.
   7. Antes de iniciar la adquisición, definir los valores de foco en por lo menos la primera sección de cada cinta utilizando la opción de protocolo de verificación.
   8. La proyección de imagen automatizada de SEM a empezar toda la serie de destino ROIs.
   9. Exportar los datos adquiridos como serie de imagen, preferiblemente en formato tif.

7. el registro de la pila de la imagen de SEM

1. Importar imagen de la serie en Fiji como una pila virtual.
   Nota: Estos serán grandes archivos de datos en la gama de pocos GB dependiendo el número de secciones y el tamaño del ROI.
2. Cultivo la imagen SEM del apilado para su posterior procesamiento en un área tan cerca de la estructura de interés posible y ajustar el brillo y contraste.
3. Abra un nuevo TrakEM¹⁷ (en blanco) desde el menú archivo.
4. Haga clic derecho en el campo de la imagen e importar la pila en TrakEM como "Una rebanada por capa".
5. Alinee las capas (click derecho en el campo de la imagen), elige mínimos cuadrados como modo, establecer el intervalo (primera imagen a la última) y elija ninguno como referencia. Para la configuración, utilice los valores predeterminados y elija rígido como la transformación deseada.
6. Cuando el registro es completa y satisfactoria, excepto el conjunto de datos alineado por haga clic derecho y seleccione Exportar. Hacer una imagen plana, establecer el intervalo de la primera a la última imagen y deje que el software muestre la pila resultante. Guarde la pila en formato tif.

Resultados

El flujo de trabajo descrito aquí (figura 1) se inicia con una muestra en un bloque de resina. Durante la preparación de la muestra, algunos metales pesados debe ser introducido en el tejido, pero no es necesario utilizar protocolos optimizados para Encapado de metal algo fuerte. Figura 1A muestra una raíz de la planta (Berro) bloque manchada convencionalmente con 1% OsO₄ y 1% acetato de uranilo, mientras que la raíz de Arabidopsis en la figura 1B es solamente débil había metalizado usando 0,5% acetato de uranilo. El tipo de muestra esta última es ideal para acercamientos correlativos como algunos metales pesados tienden a apagar de la fluorescencia. Con un soporte dedicado de sustrato (figura 2), matrices de varias cien secciones pueden ser producido (figura 1). Después de etiquetado fluorescente, tales arreglos son reflejadas en un estándar amplio campo FLM (figura 1), luego teñidas con soluciones de metales pesados y reflejadas en un SEM en diferentes resoluciones (Figura 1E–G).

Herramientas importantes para la generación reproducible de arreglos de discos, particular cuando la coloque varias cintas de barco de cuchilla de micrótomo sobre un sustrato, son el soporte del sustrato (figura 2A, diseñado en laboratorio de los autores) y un diamante de Jumbo cuchillo con un barco lo suficientemente grande para acomodar portaobjetos (figura 2B). Un menisco plano, permitiendo la buena observación de las cintas, es necesario y puede lograrse mediante plasma limpieza del sustrato: una pequeña gota de agua destilada no forman una estructura en forma de lente en el sustrato como en la figura 2 (sustrato), pero una película fina (Figura 2D, sustrato de plasma activada). En estas condiciones, a la parte seca de un cubreobjetos recubierto ITO las cintas son fácilmente visualizada (Figura 2E) y puede ser observado y controlado durante la extracción del sustrato del agua.

Por ejemplo, arreglos de discos de teñidos con ioduro de propidio para etiquetar las paredes celulares de plantas fueron reflejadas con un estándar amplio campo FLM (Figura 3A). Puesto que las secciones son sólo 100 nm de espesor, incluso demasiado tinción como se muestra a continuación presenta poco desenfoque. Después del registro, se seleccionaron las dos células totalmente incluidas en el volumen reconstruido de la pila de la imagen (figura 3B) para la proyección de imagen de alta resolución en 3D (véase también Suplementario S1 de la película). Tras tinción adicional con uranilo acetato, citrato de plomo, los arreglos de discos se reflejada en la SEM. figura 3 C muestra un resumen, con píxeles de imagen de 60 nm; el cuadrado oscuro en el centro de la imagen indica la posición donde ejecutaron a las funciones de enfoque automático, y la dosis adicional condujo a contaminación ligera. Caso de ROIs en esas secciones seriales (rodajas de 51 a 248 de 435 rebanadas en total) que contiene las células de dos destino seleccionadas en la pila de la FLM se registraron entonces con un tamaño de pixel de imagen nm 5 (figura 3D; vea también Suplementario S2 de película).

Automatizado la proyección de imagen jerárquica de las matrices en el SEM se describe aquí se hizo con la solución de la plataforma de software y hardware ZEISS Atlas 5. En primer lugar, un resumen de toda la serie fue creado con el detector SE muy grande (1.000 nm) de la imagen píxeles y tiempo de permanencia muy baja (Figura 4A). Un ROI que sólo el tejido puesto en la primera sección, propaga al resto de las secciones de la matriz. Este conjunto de sección se registró entonces con 60 píxeles de imagen nm utilizando un mayor tiempo de permanencia (Figura 4B). Finalmente, se estableció un sistema de sitio, que contiene las células dos blanco más uno "capa" de alrededor de las células para tener en cuenta la imprecisión de la etapa, con los siguientes parámetros: tiempo de detector de ESB (dispersión de retorno selectivo de energía), imagen de nm 5 píxeles, muy largo (40 μs) Moran ( Figura 4). Zoom a una imagen tan muestra detalle subcelular (figura 4) como las vacuolas (V), mitocondrias (M), núcleo (N) y el retículo endoplasmático (flechas). Vea también el Suplemento S3 película de zoom de un resumen de la matriz de todo al detalle subcelular de una célula diana.

La matriz que se muestra a continuación (200 secciones) más un adicional de 250 secciones tomó alrededor de 8 h para producir, una noche a la mancha para que la LM y un día grabar (manualmente) en la FLM. Post coloración toma aproximadamente 1-2 h en total, dependiendo del número de matrices individuales. Para la grabación de SEM, un par de horas se requiere para configurar el funcionamiento de Atlas, y grabación automatizada fue 3-4 h para el conjunto de sección intermedia de la resolución (tamaño de píxel de 60 nm) (secciones de 200, 450 x 200 μm²) y cerca de 5 días para la alta resolución (5 nm tamaño de píxel) ROI que contiene las células de la dos blanco (200 secciones, 55 x 30 μm²). Tenga en cuenta que debido al bajo contenido en metal de la muestra que se muestra aquí, una muy lenta velocidad de exploración que se utiliza para alcanzar una buena detección de señal a ruido, que implicaba (para los detectores disponibles en la actualidad) un tiempo de permanencia de 40 μs para el ROI de alta resolución.

Hay varios pasos en el flujo de trabajo todo propenso a errores: idealmente deben ser cintas más o menos recto y se coloca en el orden correcto (figura 5A). Sin embargo, se producen a menudo doblado (figura 5B), curvadas (figura 5) o incluso rotos cintas. Esto puede resultar debido a recorte incorrecto (principal y posterior bordes no paralelos) o pegamento no uniformemente aplicada, sino también de una muestra asimétrica o desigual infiltrada. Especialmente molestas son las muestras que contienen componentes muy duros y suaves. Los componentes de este último pueden ser difíciles infiltrarse como la pared celular de las raíces de la planta que se muestra a continuación (figura 5). En ese caso, los pliegues (flecha) fácilmente pueden ser causados por la compresión variable y relajación durante el seccionamiento. Para automatizado de proyección de imagen en el SEM, cintas curvas no son un gran problema, ya que el ROI se puede girar para acomodar la curvatura de la cinta.

Otro paso fundamental en el protocolo es tinción: lavado insuficiente puede dar lugar a residuos en la sección (figura 5E, F) y en el peor de los casos, cubrir el área más interesante (círculo en una de las celdas de dos destino en figura 5F). También, polvo (figura 5, las partículas de la dispersión de la luz fuertemente) introducido en el barco de cuchillo, por ejemplo, con un portador de sustrato sucio, puede causar serios problemas: en la FLM, el polvo puede ser altamente fluorescente (cf. lonchas de película suplementario S1) a tal punto que algunos algoritmos de registro no funcionan. Sin embargo, la función de "alinear" en TrakEM¹⁷ puede manejar tantas pilas como se muestra en Suplementario S1 de la película.

Figura 1: flujo de trabajo para la proyección de imagen jerárquica correlativo. A partir de una muestra incrustado en un bloque de resina (A, muestra fuertemente metalizada), la muestra es primera recortada (B, muestra débil metalizado) y luego las matrices consisten en varias cintas de secciones seriadas (C), colocado aquí en un Cubreobjetos recubierto ITO, se producen utilizando un ultramicrótomo. Después de la tinción con un colorante fluorescente, montones de imágenes se registran en un amplio campo FLM (D). Después sales de tinción más rondas con metales pesados, pilas se reflejada en un SEM (E–G) en diferentes resoluciones (tamaños de pixel de la imagen). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: herramientas para la preparación de matrices. Soporte de sustrato montado de micromanipuladores con siete ejes de movimiento conectado a un ultramicrótomo estándar (A): los tornillos, con círculos, son verticales (1) y (2) el movimiento horizontal y de inclinación (3) sustrato portador de la . El cuchillo del diamante enorme con un barco de gran tamaño para dar cabida a grandes sustratos (flecha), aquí con un pedazo de oblea de silicio activado por plasma montado en un portador de aluminio tamaño de diapositiva (B). Gotas de 20 μl de agua destilada colocaron sobre un substrato de la oblea de silicio sin tratar (C) o sobre un sustrato de plasma activada (D). Cuatro cintas flotando en el barco de cuchillo, unido a un cubreobjetos recubierto ITO por sus extremos inferiores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: correlación de los datos de LM con SEM datos. Descripciones (A, C) y las células diana (B, D) grabado con FLM (A, B) y SEM (C, D). (B) es un zoom de software y los datos originales se registraron con un objetivo de X 40 sobre un chip de cámara 1.388 x 1.040 píxeles, mientras que (C) se registra con 60 tamaño de pixel de la imagen de nm y (D) con 5 nm píxeles tamaño de la imagen, que ilustra el verdadero aumento de resolución en el SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: jerárquica de proyección de imagen en el SEM con ZEISS Atlas 5 a Resumen de una matriz grabada con 1.000 píxeles nm usando el detector SE (A). Sección fija con el ROI colocó sobre el tejido en cada sección y registró con píxeles de 60 nm (B). Sitio se establece con un ROI serial colocó en las células diana y registró con píxeles de imagen de 5 nm (C). Cuando utilice el zoom en estas imágenes de alta resolución (D), compartimientos de la membrana intracelular como vacuolas (V), núcleo (N), mitocondrias (M) y el retículo endoplasmático (flechas) se hacen visibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: problemas típicos. 1. derivados del proceso de seccionamiento: cintas a cubreobjetos recubierto ITO son idealmente recta (A), pero irregular compresión durante el seccionamiento pueden causar doblado (B) o cintas curvadas (D) o incluso los pliegues (C). 2. causado por manejo de substrato y cintas en el agua, por ejemplo, durante el seccionamiento y la coloración: luz de dispersión de partículas en el substrato (D), borde de gotitas en sección (círculo en E), o la suciedad manchada hacia fuera sobre tejido debido a la inadecuada lavado después de la tinción (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario S1 de la película: pila de imagen FLM. 435 imágenes alineación en Fiji¹⁶ usando TrakEM¹⁷ y guardado como archivo de película (.avi). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Suplementario S2 película: pila de imagen SEM. 210 imágenes alinean en Fiji¹⁶ usando TrakEM¹⁷. La pila original (300 imágenes) de este conjunto de datos fue 15 GB. Para reducir el tamaño de la pila de 3,3 GB (después de la alineación y el cultivo a sólo las dos células de destino), fue escalado en x y y por un factor de 0.2 con Fiji y luego guardado como .avi película. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Suplemento S3 de película: zoom con niveles de resolución diferentes en el SEM. Película creada en y exportada desde el software de Atlas 5 en formato. MP4. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Se demostró un flujo de trabajo para apuntar las células específicas dentro de un tejido por multimodal en jerárquica: una muestra embebido en resina se rebana para arriba en arreglos de discos de secciones seriadas, que se colocan sobre un sustrato conductor de utilizar un sustrato diseñado. Después de etiquetar con un fluoróforo y la proyección de imagen en la FLM, el volumen reconstruido se utiliza para seleccionar las células diana. Después de la coloración adicional rondas con metales pesados para introducir el contraste, estos objetivos son reflejados en varias cientos secciones a nanoescala de resolución en un SEM utilizando una plataforma de software automatizado.

Para la producción de matrices densamente con varias cintas largas, un soporte de sustrato similar a la descrita aquí es necesario. Una persona calificada y paciente puede ser capaz de conectar varias cintas a un sustrato de silicio, semi sumergido en el barco de cuchillo y recuperar la matriz reduciendo gradualmente el nivel de agua hasta que las cintas están sentados sobre el sustrato. Sin embargo, en la nuestra experiencia, existe una tendencia a romper la formación cuando el sustrato está tocando cualquier parte del barco de cuchillo (cf. nota en 1.3.2 en protocolo). Además, este procedimiento es mucho más difícil con sustratos recubiertos de ITO: (1) debido a la transparencia del vidrio de ITO, es difícil ver la orilla del agua donde los extremos de las cintas deben ser Unido; y (2) porque la superficie revestida de ITO es mucho más áspera que la oblea de silicio altamente pulido, las cintas tienden a romperse durante la extracción y pequeños fragmentos de algunas secciones pueden flotar, así destruir el orden de las secciones.

El flujo de trabajo de todo también es factible sin correlación a los datos de la FLM. En este caso, toma de datos en el SEM tenga que realizarse en varias sesiones. Una reconstrucción 3D inicial o por lo menos evaluación de datos de baja o media resolución puede ser necesaria identificar los objetivos. Además, pueden aplicar manchas histológicas convencionales para brightfield LM (no requiriendo FLM). Por supuesto, otras opciones^6,7,8 son anticuerpo etiquetado en las matrices, como ya quedó demostrado en el libro inicial en¹⁸, genéticamente codificado proteínas fluorescentes (XFPs) o la inclusión de etiquetado con la preservación de la fluorescencia durante la preparación de la muestra.

Una limitación general del método discutido es el uso de secciones de un grosor determinado y el muestreo discreto resultante del volumen 3D: resolución en Z sólo puede ser tan bueno como el espesor de las secciones desde el SEM recoge sólo datos de la superficie de la sección (d según la energía primaria energía/aterrizaje seleccionado). Esto significa que el volumen 3D resultante tiene vóxeles anisotrópica, por ej., 5 x 5 x 100 nm³ si 100 secciones de nm y un tamaño de pixel de imagen de 5 nm se utilizan. Para las entidades muy pequeñas en un rango de tamaño por debajo de 1 μm, esto puede no ser suficiente para una verdadera Descripción ultraestructural. Una limitación más técnica es la precisión de la etapa que se utiliza en el SEM para automatizado la proyección de imagen. Debido a esto, es necesario elegir un ROI mayor que las especificaciones de la exactitud de la etapa para garantizar que el área de la blanco completo es reflejado.

En comparación con SBF-SEM y FIB-SEM como métodos de proyección de imagen de bloque cara, correlativos en tiene la desventaja definitiva de vóxeles anisotrópicos, como se describe anteriormente. Con FIB-SEM, vóxeles isótropos de 5 x 5 x 5 nm³ pueden ser obtenido cuando una corrección de deriva adecuado es en el lugar.

Diferencias en el volumen reconstruido debido a la pérdida de las secciones durante la preparación de matrices pueden ser también una preocupación que no se encuentra con SBF-SEM o FIB-SEM. Con estabilización de buena cinta de pegamento, generalmente es sólo un tema para el último tramo de una cinta: pueden dañarse al lanzar desde el filo de la navaja con la pestaña. Sin embargo, en nuestra experiencia, la pérdida de una sección en cada tramos de 20-50 no influyen en registro de la imagen.

Por otro lado, la posibilidad de la mancha matrices confiere buena señal y contraste para la proyección de imagen de SEM, incluso en muestras débil metalizadas tales como la alta presión congelado ápices se muestra a continuación. Por lo tanto, no es necesario comprometer la conservación óptima ultraestructural por fijación química y numerosos pasos de metalización. Además, muestras de rutina del laboratorio de patología con grados intermedios de la metalización de entregan datos excelente¹⁰. Tal un realce de contraste la inclusión no es posible para SBF-SEM y FIB-SEM en general. Además, puesto que estos métodos son destructivos, es decir, consumir la muestra durante la proyección de imagen, jerárquico en sitios y diferentes resoluciones de imagen o proyección de imagen repetida en los puntos más adelante en el tiempo es imposible. En principio, volúmenes ilimitados, de gran campo de imagen (por ejemplo, hasta varios milímetros para cerebro de ratón todo en connectomics) crearon por mosaicos de costura, y un gran número de secciones puede ser adquirido por AT, mientras que en el FIB-SEM, campo de imagen más allá de 100 μm μm x 100 son difíciles de alcanzar con instrumentos de rutina.

Más automatización del AT-flujo de trabajo descrito sería una ventaja definitiva, ya que los métodos antes mencionados SBF-SEM y FIB-SEM realizan seccionamiento y la proyección de imagen en el mismo instrumento en una forma totalmente automatizada. Existe un tipo de automatización de la sección: ATUMtome la¹² puede generar y recolectar miles de secciones, pero el uso de la cinta del Kapton como un sustrato de tales matrices difíciles de imagen en un FLM. Sobre el cubreobjetos recubierto ITO usado aquí, proyección de imagen de resolución súper incluso debería ser posible. Un objetivo adicional, muy accesible para la automatización sería la grabación de las pilas de datos FLM. Por otro lado, automatización puede ser cara y excepto el soporte del sustrato, el flujo de trabajo presentado aquí (en cuanto a hardware) sólo cuenta con instrumentación generalmente disponible en una rutina EM laboratorio o base, que bajo nivel de acceso.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Ultramicrotome	RMC	PT-PC	Alternative: Leica UC7
Substrate holder	RMC	ASH-100	Alternative: home built
Plasma cleaner	Diener	Zepto 40kHz	Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance
Widefield fluorescence light microscope	Zeiss	Axio Observer.Z1	Alternatives: Leica, Nikon, Olympus
Fluorescence filter set	Zeiss	43 HE (Cy3/DsRed)
Objective lens	Zeiss	Zeiss Neofluar 40x	0.75 NA
Decent workstation able to handle GB-sized image data
FESEM	Zeiss	Ultra 55	Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sectioning
Razor blades	Plano	T585-V
Diamond knife for trimming 45°	Diatome	DTB45
Diamond knife for trimming 90°	Diatome	DTB90
Jumbo diamond knife for sectioning	Diatome	DUJ3530
Silicon wafer (pieces)	Si-Mat	Custom Made	Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html
ITO-coated coverslips	Balzers	Type Z	22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html
Aluminium carrier	Custom Made		76 × 26 mm
Wafer forceps	Ideal-tek	34A.SA
Stubs forceps	Dumont	0103-2E1/2-PO-1	Dumoxel-H 2E 1/2
Diamond scriber	Plano	T5448
Eyelash/very soft cat's hair	Selfmade		Alternative: Plano
Brush	Selfmade
Pattex contact adhesive	Pattex	PCL3C	Kraftkleber Classic (the yellowish one)
Fixogum	Marabu	290110001	for fixing substrate to carrier
Adhesive tape	3M	851	for fixing substrate to carrier
Isopropanol	Bernd Kraft	07029.4000
Xylene	Carl Roth	4436	thinner for glue mixture
Rotihistol	Carl Roth	6640	alternative, limonene based thinner
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image processing	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)
Image acquisition	Zeiss	Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM)	Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Propidiumiodide	Sigma-Aldrich	P4170	Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide
Uranylacetate	Science Services	E22400
Lead(II) Nitrate	Merck	107398
Tri Sodium Citrate Dihydrate	Merck	106448
NaOH pellets	Merck	106469
1M NaOH solution	Bernd Kraft	01030.3000
Glass petri dish	Duran	23 755 56
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mounting
Stubs	Plano	G301F
Carbon pads	Plano	G3347
Copper tape	Plano	G3397	double-sided adhesive, conductive
Silver paint	Plano	G3692	Acheson Elektrodag 1415M
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions/mixtures
Adhesive mixture for coating blocks			Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol)
Reynolds lead citrate			50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL.
Propidium iodide staining solution			Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing.
Aqueous uranyl acetate			Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).