Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes

Resumo

Este protocolo visa células específicas no tecido para a imagem latente em nanoescala resolução usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Um grande número de seções seriais de resina-incorporado material biológico é primeiro fotografado em um microscópio de luz para identificar o alvo e então em uma maneira hierárquica na SEM.

Resumo

Direcionamento de células específicas na resolução ultraestrutural dentro de uma população mista de célula ou um tecido pode ser conseguida de imagem hierárquica usando uma combinação de luz e microscopia eletrônica. Amostras embutidas resina são seccionadas em matrizes consiste em fitas de centenas de seções ultra-finas e depositadas em pedaços de bolacha de silicone ou lamelas feito revestidas. Matrizes são imagens em baixa resolução usando um consumidor digital como a câmera do smartphone ou microscópio de luz (LM) para uma visão geral rápida de grande área ou um microscópio de fluorescência de campo largo (luz a microscopia de fluorescência (FLM)) após a rotulagem com fluorophores. Depois da pós-coloração com metais pesados, matrizes são fotografadas em um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Seleção de alvos é possível partir de reconstruções 3D geradas por FLM ou reconstruções 3D feitas das pilhas SEM imagem em resolução intermediária se sem marcadores fluorescentes estão disponíveis. Para análise ultraestrutural, alvos selecionados são finalmente gravou no SEM em alta resolução (pixels de imagem de alguns nanômetros). Uma ferramenta de manipulação de fita que pode ser adaptada para qualquer ultramicrotome é demonstrada. Ajuda com produção de matriz e remoção de substrato do barco faca corte. Uma plataforma de software que permite a imagem automatizada de matrizes na SEM é discutida. Em comparação com outros métodos de geração de dados de grande volume EM, tais como SEM rosto-bloco serial (SBF-SEM) ou feixe de íon focalizado SEM (FIB-SEM), essa abordagem tem duas vantagens principais: (1) a amostra de resina-incorporado é conservada, embora em uma versão cortada. Pode ser manchado de maneiras diferentes e fotografada com diferentes resoluções. (2) uma vez que as seções podem ser manchadas de pós, não é necessário usar amostras fortemente manchada de bloco com metais pesados para introduzir o contraste para a imagem latente SEM ou processar blocos o tecido condutor. Isto torna o método aplicável a uma grande variedade de questões biológicas e materiais. Materiais particularmente prefixado por exemplo, de bancos de biópsia e laboratórios de patologia, pode diretamente ser incorporado e reconstruído em 3D.

Introdução

Para grandes volumes de tecido na resolução ultraestrutural de reconstruir um número de diferentes abordagens de imagens baseado em SEM ter sido usado¹: avaliações abrangentes são disponíveis por exemplo., SBF-SEM², FIB-SEM³e matriz Tomografia computadorizada (no)⁴. Enquanto para o último método material de amostra é preservado como uma matriz de seriais seções sobre um substrato, SBF-SEM e FIB-SEM são métodos destrutivos, trabalhando no bloco de amostra e consumi-la durante a imagem latente. Devido a carga da resina no SEM, eles também dependem fortemente metalizado amostra blocos⁵.

Por outro lado, identificar certas células ou estruturas de interesse dentro de uma amostra de tecido pode lucrar particularmente correlativo luz e microscopia eletrônica de varredura (CLEM)^6,7,8. Usar o FLM para direcionamento impede a aplicação de grandes quantidades de metais pesados desde que isto iria saciar a fluorescência sinal⁹. Para tais apenas amostras ligeiramente metalizadas, AT é o método de escolha como matrizes podem ser facilmente pós-manchadas com heavy metal depois da imagem latente de LM. Além disso, quase qualquer tipo de amostra pode ser usado para a AT, amostras de rotina nem do patologista tesouro peito¹⁰.

Outra grande vantagem da AT é o potencial para hierárquico¹¹ ou multi resolução de imagem¹²: não é necessário para tudo em alta resolução de imagem, como alvos podem ser selecionados em uma modalidade diferente (por exemplo, FLM) ou em imagens de baixa resolução SEM. Somente as regiões interessantes de uma população de tecido ou célula em alta resolução de imagem economiza espaço de armazenamento de dados digitais e produz pequenos conjuntos de dados de imagem, que são mais fáceis de lidar. Aqui, o fluxo de trabalho AT é demonstrado usando uma amostra bastante fracamente metalizada: alta pressão congelado as raízes das plantas (Arabidopsis thaliana) incorporado em resina hidrofílica.

Como as matrizes são preparadas, manchadas e fotografadas em FLM e SEM, e como as pilhas de imagem são registradas são explicados. Além disso, como a reconstrução 3D do volume FLM pode ser usada para selecionar células específicas para a imagem latente no SEM em nanoescala resolução é ilustrada.

Protocolo

Nota: Blocos da amostra devem ser polimerizados e contenham um pouco de heavy metal. Fixação e incorporação de protocolos para as duas amostras, mostradas na figura 1A-B foram descrevem em outra parte¹¹. Em suma, o exemplo mostrado na figura 1A quimicamente foi fixado, manchado, em bloco , primeiro com 1% OsO₄, em seguida, com 1% de acetato de uranilo e incorporado em resina do Spurr. O exemplo mostrado na figura 1B foi congelado a alta pressão, congelar substituídos com acetato de uranilo 0,4% em acetona e incorporado em resina Lowicryl HM20. Use luvas livre de pó para as próximas etapas de preparação.

1. criação de matrizes

1. Aparamento do bloco de amostra
   Nota: Sempre aperte os parafusos bem ao inserir as partes.
   1. Insira o bloco de amostra no porta-amostras do ultramicrotome, coloque o suporte no bloco de corte e deslize-a para o nível inferior do ultramicrotome.
   2. Apare fora da resina ao redor do tecido incorporado com uma lâmina de barbear, deixando apenas uma pequena borda de resina ao redor da amostra. Guarnição da parte superior até que o alvo seja atingido.
      Nota: A forma do rosto-bloco pode ser trapezoidal ou retangular (com sucesso usamos ambas as formas). É importante usar os lados mais longos do retângulo como a borda direita e líderes para garantir que uma grande área é coberta com a mistura de cola, estabilizando as fitas.
   3. Encaixe o suporte de amostra no braço da ultramicrotome e substituir o bloco de corte na fase de baixa pelo titular da faca. Introduza uma faca de corte diamante (normalmente de 45°), no suporte de faca. Alinhe o bloco-rosto exactamente paralelo à borda guarnição faca.
      Nota: Para produzir exatamente paralelo principal (inferior) e à direita as bordas (superiores), girar ou mover apenas a faca para cortar os lados opostos. Para grandes volumes (mais de várias seções de cem), uma faca de corte de 90° é vantajosa.
   4. Alisa todos os quatro lados e, em seguida, girar o porta-amostras, de modo que a borda direita e líderes estão agora na posição horizontal.
   5. Casaco cuidadosamente os lados esquerdos e à direita do bloco com a mistura de adesivo. Use uma escova pequena formada a partir de alguns cabelos fixados a um palito de dente¹³. Execute esta etapa rapidamente porque o solvente desta mistura evapora em poucos segundos. Não contamine o bloco-rosto com essa mistura. Deixe o bloco revestido de amostra secar por 5-10 min.
      Nota: para um número maior de seções (> 200), talvez seja melhor revestir a vanguarda somente, porque com o tempo, uma protuberância de cola pode acumular-se na borda direita e potencialmente recuar seções sobre o fio da navalha.
2. Preparação do substrato
   1. Corte os pedaços de wafers de silício para um tamanho que se encaixa o barco de faca (aproximadamente 2 x 2.5 cm² para a faca Jumbo). Se necessário, marca os pedaços de bolacha (números ou letras) com um scriber diamante antes de limpar, ou com um marcador permanente após a limpeza. Limpe o wafer de silício manualmente com isopropanol e fiapos de tecido.
      Nota: Para a imagem latente correlativo usar óxido-índio-estanho (ITO)-revestido as lamelas de vidro. Devem ser manipulados com muito cuidado e limpeza extra não é necessário.
   2. Corrigi o substrato para uma extremidade da placa carregadora usando um adesivo removível.
      Nota: Como alternativa, as bordas do substrato podem ser neutralizadas paralelo ao fio do navalha, usando duas faixas de fita adesiva.
   3. Plasma ativar (brilho da descarga) o substrato com ar para obter uma superfície hidrofílica. Isso deve ser feito de tal forma que uma gota de água colocada os spreads de substrato para uma película muito fina (baixo ângulo de contato, Figura 2, D). Parâmetros hydrophilization dependem do dispositivo do plasma utilizado; para os parâmetros utilizados aqui, consulte Tabela de materiais.
      Nota: A ativação de Plasma é muito volátil, então executar este imediatamente antes do uso de substrato.
   4. Insira o grampo de um titular de substrato, com o substrato montado mais perto para o fio da navalha para atingir o ideal umectação do substrato no barco faca a transportadora.
      Nota: Uma descrição detalhada do titular do substrato, incluindo os desenhos de desenho assistido por computador (CAD), é dada em Wacker et al. ¹¹
3. Preparação de corte
   1. Introduza uma faca de diamante Jumbo no suporte de faca, definir o ângulo de incidência (0° para faca Jumbo) e encher o barco de faca com água destilada. Abordagem a faca a uma distância de 1 a 2 mm para a amostra.
   2. Baixe o substrato para a água com parafusos 1 – 3 (Figura 2A) do titular do substrato. Verifica que a linha de flutuação está localizada no terço superior do substrato.
      Nota: Verifique que a cola entre o substrato e transportadora prato é bem curada pela cutucando o substrato com pinça limpa. Não deve mover.
   3. Porque é difícil ver o afastamento à terra quando usando um wafer de silício, abaixar o substrato até sentir que toque o chão. Agora levante o uma pequena quantidade de substrato. Certifique-se que o substrato nem a transportadora toca o barco de faca durante o corte.
   4. Use uma seringa ou uma pipeta para ajustar o nível de água no barco. Enquanto assistia pelo binóculo, adicionar ou remover a água até que a área total da superfície da água mostra uma reflexão homogénea da luz iluminação superior da ultramicrotome.
   5. Acender a luz de fundo do ultramicrotome. Verifique se o braço está em posição intermédia e não em retração usando a roda de mão do ultramicrotome. Abordagem a faca com a amostra até o reflexo do fio do navalha é visível na face do bloco.
   6. Use as opções de ajuste do ultramicrotome para alinhar a amostra para a faca. Primeiro gire a faca, em seguida, girar e inclinar a amostra.
      Nota: Isso é alinhado se a faixa de luz, que pode ser vista a lacuna entre a amostra e a faca, mostra arestas paralelas (linhas paralelas em linha reta e não em forma de cunha).
   7. Verificar a inclinação da amostra: Certifique-se que a faixa de luz não se torne mais grossa ou mais fina, enquanto se move a amostra acima e para baixo. Se necessário, use o parafuso de ajuste do arco para corrigir isso. Mova a faca mais perto para a amostra até é apenas acima da face do bloco-(mas sem tocá-lo).
   8. Definir a espessura de corte (alimentos), cortando a velocidade e janela de corte da unidade de controle.
   9. Inicie o corte. Se necessário, espere até que a primeira seção completa está a ser cortada. Cortar algumas seções para ter certeza que eles ficam juntos para fitas de forma (caso contrário a cola deve ser aplicada novamente). Comece com um alto valor alimentar (máxima, 200 nm para a faca Ultra) até que a primeira seção completa está a ser cortada. Em seguida, defina o valor de alimentação desejado. Para a estabilidade adequada da fita, uma espessura de corte de 100 nm e uma velocidade de corte de 1 mm/s é um bom ponto de partida. Da menor espessura possível é cerca de 60 nm, dependendo da qualidade da amostra.
   10. Pare de seccionamento. Remova todas as seções (parcialmente cortadas) desnecessárias do fio do navalha e do barco usando do gato cílio /. Se há um monte de pequenos detritos flutuando, remover a água completamente com uma pipeta e encher o barco com água fresca. Agora o processo está pronto para a primeira faixa de opções produtiva.
4. De corte
   1. Inicie o corte. Uma vez que um número de seções (o número real depende do tamanho das seções e substrato) foi cortado, parar o processo de corte e liberar a fita do fio da navalha por acariciando suavemente sobre o fio da navalha com um cílio¹⁴ ou melhor ainda, com uma muito cabelos macios do pelo do gato.
   2. Manipular a faixa de opções com os cílios em direção ao substrato (envio/recepção) e anexar a primeira seção para o substrato.
      Nota: É necessário empurrar suavemente a fita até que ele adere à parte seca do substrato.
   3. Continue seccionamento e anexar as fitas para o substrato. Começar em um lado e mover-se gradualmente mais para o outro com cada nova faixa de opções.
      Nota: Evite movimentos de massa de água para evitar o afrouxamento as fitas já anexadas. O mesmo é verdadeiro para as correntes de ar. Use o escudo de respiração entregado com o ultramicrotome. Em condições ambientais desfavoráveis, um recinto para o ultramicrotome recomenda-se¹⁵.
   4. Quando o substrato é coberto com fitas (geralmente 4-5 fitas são viáveis), gentilmente elevador-para fora o substrato do barco faca usando os parafusos de micromanipulador do titular do substrato.
      Nota: Os movimentos adequados são: Levante verticalmente (parafuso 1) e de giro/inclinação para fora (parafuso 3), ou uma combinação de ambos.
   5. Deixe a matriz de fita secar antes de guardá-lo em um ambiente livre de poeira. Após a secagem, retire o substrato adesivo montado logo que possível o portador (no mesmo dia, caso contrário o substrato pode ser muito difícil de remover ou até mesmo pode quebrar durante a desmontagem).

2. mancha para a imagem de LM

Nota: Diferentes métodos de coloração/rotulagem são possíveis, incluindo protocolos de imunofluorescência. Aqui, uma mancha direta, bastante inespecíficas é escolhida para delinear as paredes celulares.

1. Iodeto de propidium coloração
   1. Cubra o fundo de um copo grande de Petri (30 cm de diâmetro) com parafilm e alinhe a borda do prato com tecido molhado para construir uma câmara úmida.
   2. Use aproximadamente 300-500 µ l de solução por lamela. Coloque uma gota para cada lamela sobre o parafilm e coloque o copo de cabeça para baixo a queda, para que as seções estão em contacto com o fluido de coloração. Cubra o prato e envolva-o com papel alumínio para proteger as amostras da luz. Incubar as amostras para 16 h a 4 ° C.
   3. Remover a lamínula com a pinça e lavá-lo movendo-cima e para baixo em um copo de 100 mL, preenchido com 80 mL de água destilada. Repita este passo em outro copo com água fresca. Seque a lamela cuidadosamente com ar comprimido.

3. gravação da pilha de imagem no FLM

1. Coloca a lamela no palco de um comum FLM de campo amplo.
2. Escolha o conjunto de filtro apropriado (Tabela de materiais) para a fluorescência deve ser observada.
3. Com uma lente objetiva adequado, ter uma imagem do objeto em cada seção: tentar preencher o campo de visão e manter a orientação constante. Para a ponta da raiz, utilizou-se um objectivo de ar X 40.
   Nota: Se as fitas não são perfeitamente retas, um palco giratório pode ajudar a reorientar as seções ao tomar imagens. Se possível, centralizar a imagem em uma característica específica ou manter um recurso como a borda da seção a uma distância igual à borda da imagem gravada.
4. Se possível, use 16-bit para limitar pixels saturados e manter o tempo de exposição constante.

4. registo da pilha imagem FLM

1. Importe a imagem da série para Fiji¹⁶ como uma pilha virtual.
2. Abra um novo TrakEM¹⁷ (em branco) no menu arquivo.
3. Clique com o botão direito no campo de imagem e importe a pilha para TrakEM como "Uma fatia por camada".
4. Alinhar camadas (clique direito no campo de imagem), defina o intervalo (primeira imagem a última) e escolha nenhum como referência. Para todas as configurações, use os valores padrão e escolha rígida como a transformação desejada.
5. Quando o registro está terminado e satisfatória, salvar o conjunto de dados alinhado por clique direito e escolha exportar. Fazer imagem plana, definir o intervalo da primeira à última imagem e deixe o software mostra a pilha resultante. Salve a pilha em formato tif.

5. coloração e montagem para a imagem SEM

Nota: Para a preparação de soluções de coloração, consulte Tabela de materiais. Soluções podem ser armazenadas a 4 ° C por até 12 meses, protegido da luz e do ar.

Cuidado: Acetato de chumbo citrato e uranilo contêm metais pesados tóxicos. Use luvas e elimine os resíduos de acordo com as instruções das autoridades locais.

1. Cubra o fundo de um copo grande de Petri (30 cm de diâmetro) com parafilm e alinhe a borda do prato com tecido molhado para construir uma câmara úmida.
   Nota: É importante que vários pelotas de NaOH são posicionadas dentro do prato de Petri perto as gotas de coloração para evitar precipitação excessiva de citrato de chumbo.
2. Coloração de acetato de uranilo
   1. Centrifugar a solução de acetato de uranilo a 2.680 x g durante alguns segundos para pequenas partículas de sedimentos.
   2. Use aproximadamente 300 – 500 µ l de solução por lamela. Coloque uma gota para cada lamela sobre o parafilm e coloque o copo de cabeça para baixo a queda, para que as seções estão em contacto com o fluido de coloração.
   3. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente e cubra o prato durante a coloração.
   4. Remover a lamínula com pinça e lavagem por movê-lo para cima e para baixo num copo cheio de água destilada (consulte a etapa 2.1.3).
3. Levar o citrato de coloração
   1. Durante a incubação de acetato de uranilo, prepare a solução de citrato de chumbo.
      Nota: Citrato de chumbo deve sempre ser filtrado imediatamente antes do uso para remover qualquer precipitados. Também centrifugar a solução de citrato de chumbo a 2.680 x g durante alguns segundos, como na etapa 5.2.1.
   2. Use aproximadamente 300 – 500 µ l de solução por lamela. Coloque uma gota para cada lamela sobre o parafilm imediatamente antes de lavar as lamelas após a coloração de acetato de uranilo e coloque o copo de cabeça para baixo a queda, para que as seções estão em contacto com o fluido de coloração. Coloque as gotas (300-500 µ l) sobre o parafilm imediatamente antes de lavar as lamelas após a coloração de acetato de uranilo.
      Nota: Para evitar a formação de precipitados, não respire para as gotas de citrato de chumbo.
   3. Colocar a lamela lavada de cabeça para baixo, para a entrega (não há nenhuma necessidade para secá-la).
   4. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e cubra o prato durante a coloração.
   5. Remover a lamínula com a pinça e lavá-lo como descrito acima em um copo com água fresca (etapa 5.2.4).
4. Seque a lamela cuidadosamente com ar comprimido.
5. Exemplos de montagem para a imagem SEM
   1. Monte os wafers de silício em stubs de alumínio com uma almofada pegajosa de carbono.
      Nota: ITO-revestido lamelas podem ser montadas usando tinta prateada e Cu-fita — Verifique se a superfície condutora está conectada para o esboço — ou com almofadas de carbono como acima. Nesse caso, uma conexão condutiva da superfície-ITO para o esboço pode ser feita com uma gota de tinta prateada.

6. hierárquica de imagem no SEM

Nota: Em uma campo de emissão SEM, escolher uma baixa energia primária (3 kV ou inferior), um feixe atual em uma faixa de 50 a 800 pA para evitar o carregamento e uma distância de trabalho adequada para coleta eficiente de elétrons secundários e/ou dispersão traseira. Seleção da corrente de feixe depende das propriedades de amostra (ex., a incorporação de resina); a dose de elétron também será um compromisso entre uma pequena corrente (menos prejudicial para a amostra) e uma alta corrente, que é benéfico para a imagem latente de velocidade e, portanto, reduz o tempo de aquisição de imagem total. Detectores de dedicado para elétrons espalhados por trás fornecem bom contraste, são menos sensíveis à carga da amostra e mostram menos artefatos de superfície da amostra (dobras, marcas de faca). Contraste e brilho devem ser ajustados de tal forma que o histograma está centrado.

1. Imagem SEM
   1. Primeiro, defina os quatro cantos da matriz, agarrando uma imagem de cada canto na ampliação baixa, sobre 100 x. Crie uma região de interesse (ROI), encerrando a matriz inteira. Atribuir um protocolo de imagens com os seguintes parâmetros: usar um detector de elétrons secundários (SE), que permite a geração de imagens de alta velocidade em um tamanho de pixel de imagem grande (por exemplo 1.000 nm) e um tempo curto (por exemplo, 0,2 µs).
      Nota: Para superar as limitações de óptica de elétron em uma grande varredura campos de visão (FOV), que pode resultar em distorções na periferia das imagens, usar modos de ampliação baixa dedicado (fornecidos pela maioria dos fabricantes SEM) ou usar meio, varredura de 1 a 2 k campos para imagens simples.
   2. Gere uma seção definida, criando um ROI apenas o tecido na primeira seção de estrutura de tópicos. Cloná-lo para todas as seções subsequentes usando a ferramenta Carimbo. Gire o ROIs quando necessária para acomodar fitas dobradas.
   3. Gravar a série de imagem usando um tamanho de pixel intermediária (cerca de 50 nm) e uma permanência de tempo longo o suficiente para identificar e reconhecer a estrutura de destino. Use um FOV para imagens individuais em um intervalo de 6-10 k pixels.
      Nota: O software Atlas 5 pode coletar automaticamente mosaicos compostos por imagens adjacentes para cobrir grandes áreas ROI/seção do outro lado as seções seriais.
   4. Crie um site definido dentro deste conjunto de seção, que contém a estrutura de destino para a imagem latente de resolução SEM maior. Fazer o ROI grande o suficiente para conta para precisão de palco. Verificar e ajustar as posições dos sites.
      Nota: É importante colocar o ROIs de tal forma que o centro, onde serão realizados o autofocus e autostigmation, não se senta no material "vazio" com nenhum detalhe estrutural, por exemplo., vacúolos.
   5. Definir as configurações de foco automático e verificar o desempenho ao longo de pelo menos o comprimento de uma fita (ou seja, a distância mais longa que o estágio tem de viajar) em um pequeno ROI perto do local que vai ser fotografado.
   6. Define um protocolo de imagem para a aquisição SEM alta resolução. Para ver a compartimentos da membrana, escolher o tamanho do pixel da imagem de 3 – 5 nm. Selecione um tempo de interrupção, dependendo o detector para que a imagem não é muito barulhenta.
   7. Antes de iniciar a aquisição, defina os valores de foco pelo menos a primeira seção de cada fita usando a opção de protocolo de verificação.
   8. A automatizada de imagem SEM recomeçar a série inteira de destino ROIs.
   9. Exporte os dados adquiridos como série de imagem, de preferência em formato tif.

7. registro da pilha SEM imagem

1. Importar imagem série para Fiji como uma pilha virtual.
   Nota: Estes serão grandes arquivos de dados na faixa de alguns GB dependendo do número de seções e o tamanho do ROI.
2. Cortar a imagem SEM pilha para processamento adicional para uma área mais perto da estrutura de interesse quanto possível e ajustar o brilho e o contraste.
3. Abra um novo TrakEM¹⁷ (em branco) no menu arquivo.
4. Clique com o botão direito no campo de imagem e importe a pilha para TrakEM como "Uma fatia por camada".
5. Alinhe as camadas (clique direito no campo de imagem), escolha de mínimos quadrados como modo, definir o intervalo (primeira imagem a última) e escolha nenhum como referência. Para as configurações, use os valores padrão e escolha rígida como a transformação desejada.
6. Quando o registro é completo e satisfatório, salvar o conjunto de dados alinhado por clique direito e escolha exportar. Fazer uma imagem simples, definir o intervalo da primeira à última imagem e deixe o software mostra a pilha resultante. Salve a pilha em formato tif.

Resultados

O fluxo de trabalho descrito aqui (Figura 1) começa com uma amostra incorporada em um bloco de resina. Durante a preparação da amostra, alguns metais pesados devem ser introduzidas no tecido, mas não é necessário usar protocolos otimizados para metalização bastante forte. A figura 1A mostra uma raiz de planta (agrião) bloco-manchado convencionalmente com 1% OsO₄ e 1% de acetato de uranilo, enquanto a raiz de Arabidopsis na figura 1B é apenas fracamente metalizado usando acetato de uranilo 0,5%. O tipo de amostra este último é mais adequado para abordagens correlativas como alguns metais pesados tendem a saciar a fluorescência. Com um suporte dedicado do substrato (Figura 2), matrizes de várias centenas de seções podem ser produzido (Figura 1). Depois etiquetando fluorescente, como matrizes é fotografado em um FLM de campo amplo padrão (Figura 1), em seguida, corado com soluções de heavy metal e fotografado em um SEM em resoluções diferentes (Figura 1E–G).

Ferramentas importantes para a geração reprodutível de matrizes, particularmente quando colocando várias fitas de barco de faca do micrótomo sobre um substrato, são o titular do substrato (Figura 2A, personalizados em laboratório dos autores) e um diamante de Jumbo faca com um barco suficientemente grande para acomodar corrediças do microscópio (Figura 2B). Um menisco plano, permitindo que a boa observação das fitas, é necessário e pode ser alcançado por plasma limpeza do substrato: uma pequena gota de água destilada não deve formar uma estrutura de lente sobre o substrato, como na Figura 2 (substrato não tratado), Mas uma película fina (Figura 2D, substrato de plasma ativado). Nestas condições, fitas anexadas à parte seca de uma lamela ITO-revestido são facilmente visualizados (Figura 2E) e podem ser observadas e controladas durante o elevador do substrato da água.

Por exemplo, matrizes manchados com iodeto de propidium para rotular a parede celular das plantas foram fotografadas com um padrão amplo campo FLM (Figura 3A). Uma vez que as seções são apenas 100 nm grossa, nem excessivamente manchando conforme mostrado aqui introduz pouco ofuscamento. Após o registo, selecionaram-se as duas células completamente fechadas no volume reconstruído da pilha de imagem (Figura 3B) para geração de imagens de alta resolução em 3D (Veja também Suplementar filme S1). Após coloração adicional com citrato de acetato e chumbo de uranilo, as matrizes foram fotografadas no SEM. Figura 3 C mostra uma visão geral, gravada com 60 pixels da imagem do nm; o quadrado escuro no centro da imagem indica a posição onde as funções de autofocus foram executadas, e a dose adicional levou à contaminação ligeira. Adequado de ROIs em secções seriais (fatias 51 para 248 de 435 fatias no total) que contém as células de dois alvo selecionadas na pilha de FLM então foram gravadas com um tamanho de pixel de imagem nm 5 (Figura 3D; ver também Suplementar filme S2).

Imagem hierárquica automatizada das matrizes no SEM descrito aqui foi feita com a solução de plataforma de software e de hardware ZEISS Atlas 5. Primeiro, uma visão geral de todo o conjunto foi criada usando o detector SE, com muito grandes (1.000 nm) imagem pixels e tempo de permanência muito baixa (Figura 4A). Um ROI descrevendo apenas o tecido foi colocado na primeira seção e propagado para todas as outras seções da matriz. Este conjunto de seção foi então gravado com 60 pixels de imagem nm usando um longo tempo de interrupção (Figura 4B). Finalmente, um conjunto de site, que contém as células dois alvo mais um "camada" de em torno de células para contabilizar a imprecisão do palco, foi criado com os seguintes parâmetros: detector de ESB (Backscatter seletiva de energia), imagem de nm 5 pixels, muito longos (40 µs) habitam o tempo ( Figura 4). Aumentar o zoom em uma imagem tão mostra detalhes subcellular (Figura 4), tais como vacúolos (V), mitocôndria (M), núcleo (N) e retículo endoplasmático (setas). Veja também o S3 suplementar do filme para aumentar o zoom em de uma visão geral da matriz de todo o detalhe subcellular de uma célula-alvo.

A matriz mostrada aqui (200 seções) e mais um adicional de 250 seções levou cerca de 8 h para produzir, uma noite a mancha para LM e um dia para gravar (manualmente) para o FLM. Pós-coloração leva cerca de 1-2h, no total, dependendo do número de matrizes individuais. Para a gravação de SEM, algumas horas são necessárias para configurar a execução do Atlas, e gravação automatizada foi 3 – 4 h para o conjunto de seção intermediária da resolução (tamanho de pixel de 60 nm) (200 seções, 450 x 200 µm²) e a cerca de 5 dias para o de alta resolução (5 nm pixel tamanho) ROI contendo as células dois alvo (200 seções, 55 x 30 µm²). Note que devido ao baixo teor de metal da amostra mostrado aqui, tinha uma velocidade de digitalização muito lenta ser usado para alcançar uma boa detecção de sinal-ruído, que implicou (para o detector atualmente disponível) um tempo de interrupção de 40 µs para o ROI de alta resolução.

Existem várias etapas do fluxo de trabalho inteiro propenso a armadilhas: idealmente fitas devem ser mais ou menos em linha reta e colocados na ordem correta (Figura 5A). No entanto, dobrada (Figura 5B), curvas (Figura 5) ou fitas mesmo quebradas muitas vezes são produzidas. Isso pode resultar devido a remoção incorreta (líder e extremidade posterior não é exatamente paralela) ou adesivo não uniformemente aplicado, mas também de uma amostra desigualmente infiltrada ou assimétrica. São particularmente problemáticas amostras contendo componentes macios e muito difícil. Estes componentes podem ser difíceis de se infiltrar como a parede de pilha das raizes da planta mostrada aqui (Figura 5). Nesse caso, dobras (setas) facilmente podem ser causadas por compressão variável e relaxamento durante o corte. Para automatizada de imagem no SEM, fitas curvas não são um grande problema, desde o ROIs podem ser girado para acomodar a curvatura da faixa de opções.

Outro passo crítico no protocolo é de coloração: lavagem inadequada pode levar a resíduos na seção (Figura 5E, F) e na pior das hipóteses, cobrir a área mais interessante (círculo em uma das células dois alvo na Figura 5F). Além disso, a poeira (Figura 5, as partículas de espalhamento de luz fortemente) introduzida no barco de faca, por exemplo, com um portador de substrato sujo, pode causar sérios problemas: no FLM, a poeira pode ser altamente fluorescente (cf. algumas fatias em filme suplementar S1) a tal ponto que alguns algoritmos de registro não funcionam. A função de "Alinhar" em TrakEM¹⁷ , no entanto, pode manipular tais pilhas conforme demonstrado no Supplemental filme S1.

Figura 1: fluxo de trabalho para a imagem hierárquica correlativa. A partir de uma amostra incorporado em um bloco de resina (A, amostra fortemente metalizada), a amostra é primeira aparada (B, amostra fracamente metalizada) e em seguida matrizes aqui consistindo de várias fitas de seriais seções (C), colocado em um ITO-revestido lamela, são produzidos usando um ultramicrotome. Após coloração com um corante fluorescente, pilhas de imagens são gravadas em um campo amplo FLM (D). Depois sais de coloração mais rodadas com heavy metal, pilhas são fotografadas em um SEM (E–G) em diferentes resoluções (tamanho do pixel de imagem). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: ferramentas para a preparação de matrizes. Titular de substrato montado de Micromanipuladores com sete eixos de movimento ligado a um padrão ultramicrotome (A): os parafusos, destacados com círculos, são para (2) movimento horizontal e vertical (1) e inclinação (3) da transportadora substrato . A faca enorme diamante com um tamanho grande barco para acomodar grandes substratos (seta), aqui com um pedaço de bolacha de silício ativado plasma montado sobre um portador de alumínio tamanho slide (B). 20 gotas de µ l de água destilada colocada em uma carcaça de bolacha de silício não tratada (C) ou em um substrato de plasma está ativado (D). Quatro fitas flutuando no barco a faca, anexado a uma lamela ITO-revestido por suas extremidades inferiores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: correlação dos dados com dados SEM LM. Súmulas (A, C) e nas células-alvo (B, D), gravado com o FLM (A, B) e SEM (C, D). (B) é um software de zoom, e os dados originais foram gravados com uma lente de objetiva X 40 em um chip de 1.388 x 1.040 pixel câmera, enquanto (C) é gravado com 60 nm tamanho de pixel da imagem e (D) com 5 nm pixel tamanho da imagem, ilustrando o verdadeiro aumento da resolução no SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: hierárquica de imagem no SEM usando ZEISS Atlas 5 em Visão geral de uma matriz gravada com 1.000 pixels de imagem nm usando o detector SE (A). Seção define com o ROI colocados no tecido em cada seção e gravou com 60 pixels de imagem nm (B). Local define com um ROI serial colocado sobre células-alvo e gravou com pixels de imagem 5 nm (C). Ao aumentar o zoom em tais imagens de alta resolução (D), compartimentos de membrana intracelular como vacúolos (V), núcleo (N), mitocôndria (M) e retículo endoplasmático (setas) tornam-se visíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: problemas típicos. 1. decorrentes do processo de corte: fitas colocadas no ITO-revestido lamelas são idealmente reta (A), mas irregular compressão durante o corte podem causar dobrados (B) ou fitas curvas (D) ou até mesmo dobras (C). 2. causada pelo tratamento de substrato e fitas na água, por exemplo, durante o corte e coloração: luz espalhamento de partículas em substrato (D), borda de gotículas na seção (círculo em mi), ou sujeira esfregaste fora tecido devido à inadequada lavagem após coloração (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar filme S1: pilha de imagem FLM. 435 imagens alinhadas em Fiji¹⁶ usando TrakEM¹⁷ e salvo como arquivo de filme (. avi). Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementar filme S2: pilha de imagem SEM. 210 imagens alinhadas em Fiji¹⁶ usando TrakEM¹⁷. A pilha original (300 imagens) deste conjunto de dados foi de 15 GB. Para reduzir o tamanho da pilha de 3.3 GB (após o alinhamento e o corte de apenas as duas células-alvo), foi reduzida em x e y por um fator de 0.2 usando Fiji e salvo como. avi filme. Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementar filme S3: zoom com níveis diferentes de resolução na SEM. Filme criado em e exportados a partir do software Atlas 5 no formato. mp4. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Demonstrou-se um fluxo de trabalho para o direcionamento de células específicas dentro de um tecido por AT hierárquica multimodal: uma amostra de resina-incorporado é rasgada em matrizes de seriais seções, que são colocadas em um substrato condutor usando um suporte de substrato personalizados. Depois de rotulagem com um fluoróforo e imagem no FLM, o volume reconstruído é usado para selecionar as células alvo. Após coloração adicionais rodadas com metais pesados para introduzir o contraste, esses destinos são imaginados durante várias cem seções em nanoescala resolução em um SEM usar uma plataforma de software automatizado.

Para a produção de matrizes densamente com várias fitas longas, um titular de substrato semelhante à descrita aqui é necessário. Uma pessoa hábil e paciente pode ser capaz de anexar várias fitas para um substrato de silício, semi imerso no barco a faca e recuperar a matriz, reduzindo gradualmente o nível da água até as fitas estão sentados sobre o substrato. No entanto, na nossa experiência, há uma tendência para quebrar a formação quando o substrato está tocando em qualquer parte do barco faca (cf. nota no 1.3.2 no protocolo). Além disso, este procedimento é muito mais difícil com substratos revestidos ITO: (1) devido a transparência do vidro-ITO, é difícil ver a borda da água onde as extremidades das fitas tem que ser anexado; e (2) porque a superfície ITO-revestido é muito mais difícil do que a bolacha de silício altamente polido, as fitas tendem a quebrar durante o elevador e fragmentos menores, consistindo de algumas seções podem flutuar, destruindo assim a ordem das seções.

O fluxo de trabalho inteiro também é viável sem correlação com dados FLM. Neste caso, coleta de dados no SEM pode ter que ser executadas em várias sessões. Uma reconstrução 3D inicial ou pelo menos a avaliação de dados de baixa ou média resolução pode ser necessária para identificar alvos. Além disso, manchas histológicas convencionais para brightfield LM (não exigindo FLM) podem ser aplicadas. Claro que outras opções^6,7,8 são anticorpos rotulagem nos arrays, como já demonstrado no livro inicial sobre a¹⁸, ou geneticamente codificado proteínas fluorescentes (XFPs) ou pré-incorporação de rotulagem com preservação da fluorescência durante a preparação da amostra.

Uma limitação geral do método discutido é o uso de seções de uma certa espessura e a amostragem discreta resultante do volume 3D: resolução em Z só pode ser tão bom quanto a espessura das seções, desde que o SEM recolhe apenas os dados da superfície de seção (d epending sobre a energia de energia primária/aterragem selecionada). Isto significa que o volume 3D resultante tem voxels anisotrópicos, por exemplo., 5 x 5 x 100 nm³ se 100 nm seções e um tamanho de pixel de imagem de 5 nm são usados. Para entidades muito pequenas em uma escala de tamanho abaixo de 1 µm, isto pode não ser suficiente para uma verdadeira descrição ultraestrutural. Uma limitação mais técnica é a precisão do palco usado no SEM para automatizada de imagem. Devido a isto, é necessário escolher um ROI maior do que as especificações de precisão do palco para garantir que a área de destino completo é fotografada.

Comparado a SBF-SEM e FIB-SEM como métodos de imagem de cara-de-bloco, o correlativo AT tem a desvantagem definitiva de voxels anisotrópicos, conforme descrito acima. Com FIB-SEM, voxels isotrópicos de 5 x 5 x 5 nm³ podem ser obtidos quando uma correção adequada deriva está no local.

Lacunas no volume reconstruído devido à perda de seções durante a preparação de matrizes podem também ser uma preocupação que não é encontrada com a SBF-SEM ou FIB-SEM. Com a estabilização de bom da fita pela colagem, geralmente é apenas um problema para a última seção de uma fita: pode ser danificado quando liberá-lo do fio do navalha, usando o cílio. No entanto, em nossa experiência, a perda de uma seção em todas as seções de 20 – 50 não influi registro de imagem.

Por outro lado, a possibilidade de pós-manchar matrizes confere bom sinal e contraste para a imagem latente SEM, mesmo em amostras fracamente metalizadas, tais como a alta pressão congelados dicas de raiz, mostradas aqui. Portanto, não é necessário comprometer óptima preservação ultraestrutural por numerosos fixação química e passos de metalização. Além disso, amostras de rotina do laboratório de patologia com graus intermédios de metalização entregam dados excelente¹⁰. Tal um realce de contraste pós-incorporação não é possível para SBF-SEM e FIB-SEM em geral. Além disso, desde que estes métodos são destrutivos, ou seja, consumindo a amostra durante a geração de imagens, hierárquica em sites e diferentes resoluções de imagem ou imagens repetidas em pontos mais tarde no tempo é impossível. Em princípio, volumes ilimitados, consistindo de grandes FOVs (por exemplo, até vários milímetros para cérebro de rato inteiro em connectomics) criado por mosaicos de costura, e um número enorme de seções pode ser adquirido por AT, enquanto na FIB-SEM, FOVs além de 100 µm x 100 µm são difíceis de alcançar com instrumentos de rotina.

Mais automação de fluxo de trabalho-AT descrito seria uma vantagem definitiva, desde que os métodos acima mencionados SBF-SEM e FIB-SEM realizar tanto de seccionamento e de imagem dentro o mesmo instrumento de forma totalmente automatizada. Existe um tipo de automação de corte: ATUMtome The¹² pode gerar e coletar milhares de seções, mas o uso de fita Kapton como um substrato faz com que tais matrizes difíceis de imagem em um FLM. Sobre as lamelas ITO-revestido usadas aqui, imagem de super-resolução até deve ser possível. Um alvo mais longe, muito desejável para automação seria a gravação de pilhas de dados FLM. Por outro lado, automação pode ser cara e exceto o titular do substrato, o fluxo de trabalho aqui apresentado baseia-se (em termos de hardware) apenas na instrumentação geralmente disponível em uma rotina EM laboratório ou núcleo facilidade, tornando-o baixo nível de acesso.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Ultramicrotome	RMC	PT-PC	Alternative: Leica UC7
Substrate holder	RMC	ASH-100	Alternative: home built
Plasma cleaner	Diener	Zepto 40kHz	Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance
Widefield fluorescence light microscope	Zeiss	Axio Observer.Z1	Alternatives: Leica, Nikon, Olympus
Fluorescence filter set	Zeiss	43 HE (Cy3/DsRed)
Objective lens	Zeiss	Zeiss Neofluar 40x	0.75 NA
Decent workstation able to handle GB-sized image data
FESEM	Zeiss	Ultra 55	Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sectioning
Razor blades	Plano	T585-V
Diamond knife for trimming 45°	Diatome	DTB45
Diamond knife for trimming 90°	Diatome	DTB90
Jumbo diamond knife for sectioning	Diatome	DUJ3530
Silicon wafer (pieces)	Si-Mat	Custom Made	Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html
ITO-coated coverslips	Balzers	Type Z	22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html
Aluminium carrier	Custom Made		76 × 26 mm
Wafer forceps	Ideal-tek	34A.SA
Stubs forceps	Dumont	0103-2E1/2-PO-1	Dumoxel-H 2E 1/2
Diamond scriber	Plano	T5448
Eyelash/very soft cat's hair	Selfmade		Alternative: Plano
Brush	Selfmade
Pattex contact adhesive	Pattex	PCL3C	Kraftkleber Classic (the yellowish one)
Fixogum	Marabu	290110001	for fixing substrate to carrier
Adhesive tape	3M	851	for fixing substrate to carrier
Isopropanol	Bernd Kraft	07029.4000
Xylene	Carl Roth	4436	thinner for glue mixture
Rotihistol	Carl Roth	6640	alternative, limonene based thinner
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image processing	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)
Image acquisition	Zeiss	Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM)	Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Propidiumiodide	Sigma-Aldrich	P4170	Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide
Uranylacetate	Science Services	E22400
Lead(II) Nitrate	Merck	107398
Tri Sodium Citrate Dihydrate	Merck	106448
NaOH pellets	Merck	106469
1M NaOH solution	Bernd Kraft	01030.3000
Glass petri dish	Duran	23 755 56
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mounting
Stubs	Plano	G301F
Carbon pads	Plano	G3347
Copper tape	Plano	G3397	double-sided adhesive, conductive
Silver paint	Plano	G3692	Acheson Elektrodag 1415M
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions/mixtures
Adhesive mixture for coating blocks			Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol)
Reynolds lead citrate			50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL.
Propidium iodide staining solution			Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing.
Aqueous uranyl acetate			Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).