JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Моноцитарных DC (MoDC) может смысле незначительных количествах опасности связанных молекул и поэтому легко загрунтовать. Мы предоставляем подробный протокол для изоляции MoDC от крови и опухоли и их активации с иммунных комплексов, подчеркнув основные меры предосторожности, которые следует рассмотреть, чтобы избежать их преждевременного активации.

Аннотация

Дендритные клетки (DC) являются гетерогенной клеточных популяций, которые отличаются в их маркеров клеточной мембраны, модели миграции и распределения и их презентации антигена и возможностей активации Т-клеток. Поскольку большинство прививок экспериментальной опухоли моделей требуют миллионы DC, они широко изолированы от костного мозга и селезенки. Однако эти DC значительно отличаются от крови и опухоли DC в их ответах иммунных комплексов (ИК) и, предположительно, другие Syk сочетании Лектин рецепторов. Важно, учитывая чувствительность DC опасность связанных молекул, присутствие эндотоксинов или антител, которые crosslink активацию рецепторов в одном из изоляции шагов может привести к грунтовки DC и таким образом влияют на параметры, или по крайней мере Дозировка, необходимых для их активации. Таким образом здесь мы опишем подробный протокол для изоляции MoDC из крови и опухоли, избегая их преждевременной активации. Кроме того протокол предусматривает MoDC активации с опухолью IC и их последующего анализа.

Введение

С момента их открытия дендритные клетки (DC) были в центре внимания обширных исследований из-за их уникальную способность наклонить Т клеточной дифференцировки1. За последние несколько десятилетий обширные исследования стремилась определить различные подмножества DC и их функции в ходе опухолевой прогрессии и иммунитет 2. РСУ состоят из гетерогенных клеточных популяций, которые отличаются друг от друга в их распознавания рецепторов, распределение ткани, и далеко мигрирующих и антиген презентация возможностей3,4,5. По сравнению с другими DC подмножеств, моноцитарных DC (MoDC) являются гораздо более обильные в опухоли и могут быть легко получены из циркулирующих или опухоль проникновение моноцитов6,7. Таким образом многие клинические испытания, стремящихся воспользоваться их относительную распространенность основаны на in vivo и ex vivo манипуляции аутологичной MoDC для того, чтобы выявить Т-клеток иммунитета 8,9.

Аналогичным образом, DC-основе вакцинации экспериментальной опухоли моделей требует 2-3 последовательных инъекции, 5-7 дней врозь, 1-2 х 106 активированные DC пульсирующий с опухолевых антигенов. Таким образом, для достижения этого большое количество DC, большинство исследований мыши главным образом использовали MoDC культивировали из костного мозга (БМ) прекурсоров в ГМ-КСФ для 7-9 дней (Ил-4 не требуется в параметре мыши)10,11. Тем не менее учитывая что нокаут ГМ-КСФ у мышей в целом нормальное DC отсек 12,13и смешанным населением, полученные от этой культуры,14 физиологической значимости этих DC была поставлена под вопрос.

Кроме того DC может быть регулярно изолированы от клеток селезенки. Однако, DC составляют лишь около 0,3-0,8% всего селезенка клеток (в результате приблизительно 7 x 105 DC/селезенки) и эти клетки, только CD103+ DC и MoDC можно перенести обратно в лимфоидных органов. Поскольку MoDCs составляют примерно 10-15% населения15,селезеночной DC16, большинство протоколы изоляции дают примерно 1 х 105 MoDC в селезенке. Расширение MoDC может достигаться путем инъекций transfected клеток В16, которые выделяют ГМ-КСФ, что приводит к 100-кратного увеличения селезенки MoDC17. Однако, использование MoDC для разработки вакцин DC ограничен, поскольку эта процедура не может быть сделано в организме человека и полученные MoDC уже высоко активируются.

Помимо получения достаточного количества DC, еще один вызов для разработки эффективных DC вакцин против аутологичной раковых клеток предполагает отсутствие достаточных сигналы опасности в параметре опухоль полностью активировать DC. Индукции co-stimulatory сигналов обычно достигается путем активации распознавания рецепторов (ПРР), или тип c Лектин сигнальных путей18,19,20,21. Еще один подход для активации DC эксплуатирует их способности принимать антигены путем взаимодействия с поверхности Fcγ рецепторы (FcγR). Действительно, ряд важных рукописей показали, что инъекции MoDC от БМ прекурсоров, активированный с опухоль IgG IC может предотвратить рост опухоли в профилактической настройки и может привести к ликвидации установленных опухоли22,23 .

В двух последних документах Карми et al. обнаружил, что в отличие от BMDC и селезенке DC, MoDC из крови и опухоли не может реагировать IgG IC без дополнительных стимулов. Это было признано благодаря наличию внутриклеточного уровня тирозин фосфатаз, регулирующие FcγR сигнализации24,25. Определение критических контрольных точек в DC, эта работа представил важное понимание требований для успешной вакцинации на базе DC. Потребность в дополнительных стимулов для включения FcγR сигнализацию и предположительно сигнализации от других рецепторов Лектин, используя аналогичные фосфорилирование Каскад, таким образом подчеркивает необходимость избегать грунтование DC во время их изоляции.

Таким образом настоящий Протокол описывает изоляции MoDC от крови и опухоли, которые заметно отличаются от БМ и селезенке DC, и освещаются меры предосторожности стоит рассмотреть во время процесса.

протокол

Протоколы ниже относятся к изоляции мыши MoDC, однако общие принципы могут применяться к другим DC подмножеств клеток, а также. 12 - 16-week-old мышей C57Bl/6j поддерживались в американской ассоциации по аккредитации лабораторных животных уход – аккредитованных животных фонда. Все протоколы были одобрены Стэнфордского университета и Тель-Авивского университета институциональных животное уход и использование Комитетом.

1. изоляция опухоли связанные моноцитарных DC

  1. В Ламинарный шкаф удаление опухоли с CO2 умерщвлены мышей и опухоли в среду RPMI без плода бычьим сывороточным (ФБС).
    Примечание: Настоятельно рекомендуется для бритья мышей и распылить их с 70% этанол перед удалением опухоли, чтобы свести к минимуму потенциальных загрязнений из меха. Будьте уверены, что опухоль не превышает 25-40 мм2 , так как большие опухоли имеют меньше DC, которые клонат быть хрупким и склонной смерти клетки. Если необходимо большее количество DC, каждая мышь может быть введен с клетками опухоли на нескольких сайтах.
  2. В стерильные ламинарных капюшоном Чоп опухоли с помощью ножниц хирургии на мелкие кусочки (приблизительно 1 x 1 мм2).
    1. Добавьте все опухоли фрагменты из одной мыши в 30 мл стерильного плоскодонные трубку с магнитными перемешать баров, который содержит 5 мл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS), 2 мг/мл коллагеназы IV и 0,01 мг/мл DNase I.
      Предупреждение: Миелоидные клетки вырабатывают энергию через гликозилирования, даже при устойчивом состоянии. Таким образом только использование средств массовой информации, который содержит глюкозы (например HBSS, RPMI и DMEM), как глюкоза голода как мало, как 10-15 мин приведет к гибели клеток и апоптоз в течение 24 ч. использование только низкий эндотоксина коллагеназы IV, как коллагеназы производится грамположительных бактерии (Clostridium histolyticum).
  3. Размешайте в около 200-400 об/мин в инкубаторе 37 oC магнитной мешалкой для 20-30 мин.
  4. Добавьте 5 мл полной СМИ и вновь приостановить энергично.
  5. Фильтр клетки через стрейнер ячейки 70 мкм. Центрифуга на 4 oC 400 РРС для 5-10 мин до Пелле клетки.
    Предупреждение: Не пытайтесь изолировать клетки, непосредственно после ферментативного пищеварения, как некоторые опухоли некротические и содержат относительно большое количество мусора клеток или внеклеточного матрикса. Примените клетки на 15% плотность градиента среднего для получения только ячейки.
  6. Приостановите 9 мл с 1 мл раствора 10 x PBS Отрегулируйте осмотического давления и получить 100% Percoll раствор градиента плотности среды. Mix 1,5 мл плотность градиента среднего складе решение с 8,5 мл HBSS и энергично смешать его с клеток опухоли производные Пелле. Аккуратно слоя 2 мл DMEM верхней 15% плотность градиента среднего и центрифуги на 400 РПРС для 20 мин при комнатной температуре. Выбросите supernatants, как клетки будет форма гранул в нижней части трубки.
    1. Вымойте гранулированных клетки дважды путем повторного приостановления их в 10 мл HBSS, содержащий 2% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина и 10 мм ЭДТА (изоляция буфера) и центрифуги на 4 oC 400 РРС для 5-10 мин Пелле клетки.
    2. Подсчитать ячейки на Горяева, используя Трипановый синий под микроскопом света.
  7. Буфера и инкубировать их в 4 oC с 30 мкл CD11b вновь приостановить 1 x 108 клеток в 1 мл изоляции и+ конъюгированных магнитные шарики за 15 мин.
    Предостережение: Избегайте использования конъюгированных CD11c бусы, как это будет активировать DC и вызывать гибель клеток. Не пытаться блокировать FcγRII и FcγRIII с антителами anti-CD16/32. Блокирование антитела перевязать FcγR и вызывают сильное фосфорилирование киназы карты и премьер DC.
    1. Удалите избыток свободных бусы, добавив 9 мл буфера изоляции и центрифуги клеток на 400 РРС для 5-10 мин на 4oC.
  8. Аспирационная супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл изоляции буфера. Примените клетки на prewashed магнитные столбца. Промойте колонку дважды с 3 мл буфера изоляции.
    1. Удалите столбец из магнита. Пипетка 6 мл буфера изоляции на столбец и промыть магнитно меченых клетки в стерильных коллекции трубку, нажимая на поршень. Центрифуга клетки на 400 РРС для 5-10 мин на 4 oC.
    2. Вновь приостановить клетки на 100 мкл на 1 x 10-7 клеток и пятна с следующие Флюорофор конъюгированных антител: построчная оплата отрицательные (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI и Ly6G), MHCII, Ly - 6 C.
  9. Сортировать клетки стробирования небольшие клетки, с помощью стороны точечной (SSC) и вперед точечной (FSC) и культуры полного среднего, дополнена 5 нг/мл ГМ-КСФ. Инкубировать клетки на 1 час в 3 7 oC для того, чтобы позволить макрофаги присоединиться пластину. Затем перенесите слабо и non сторонник клетки к новой культуры блюдо.
    Примечание: Мышь MoDC определяются как CD11b+/CD11c+/MHCIIПривет/Ly6CЛо/int 7,,2627. Выражение Ly6C может резко меняться между моделями опухоли, а в некоторых моделях (например LMP) MoDCs полностью отсутствует выражение Ly6C. В целом, одна 100 мм3 B16F10 опухоли обычно содержит 5 х 104 DC, что приводит к примерно 4-5 х 106 клеток всего. Эти клетки 10-15% являются иммунные клетки и 8-10%-MoDC. Увеличение числа DC может достигаться путем инъекций мышей с опухоли на нескольких сайтах. Сортировка лишь небольшие клетки SSC/FCS, как другие миелоидных клеток можно выразить маркеры, такие как CD11c и Ly6C.
    Дополнительно: Сортировать Моноцит проникновения опухоли как небольшие клетки SSC/FSC, которые выражают Ly6CПривет и негативными для MHCII. Потом культура моноцитов в пробирке с 50 нг/мл ГМ-КСФ для получения постоянного тока.

2. изоляции моноцитарных DC из периферической крови

Примечание: Поскольку пожилые MoDCs относительно редки в крови мыши, протокол ниже относится к их вывода в пробирке из отсортированных моноцитов.

  1. Для повышения уровня моноцитов в крови, анестезировать мышей с 4% изофлюрановая и вставляют их подкожно (с.к.) с 1 мкг GM-CSF в 50 мкл PBS.
  2. После 1-2 ч Пожертвуйте мышей с использованием CO2.
    Предупреждение: Не пожертвовать мышей шейки матки дислокации, как это вызовет внутреннее кровотечение.
  3. Сразу же после euthanization спрей мышь с 70% этанола и снять кожу, которая покрывает сердца, используя Ножницы хирургические, под капотом стерильных ламинарного потока. Очистить ножницы с этанолом и вырезать правого предсердия сердца. Медленно очистите сердца через правый желудочек с ЭДТА HBSS с помощью 10-мл шприц и игла 25-G-20 мм.
    1. Сбор крови с стерильный шприц из плевральной полости в стерильную пробирку, содержащих сульфат heparan и ЭДТА. Продолжить для сброса сердце до печени и легких стать розовый или белый.
  4. Применить крови на центрифугу градиента средне плотность на 400 РПРС при комнатной температуре 15 мин с низкой тормозом.
    Предупреждение: Использование бесплатно эндотоксина плотность градиента среднего (обычно менее 0,12 ЕС / мл).
    1. Соберите мононуклеарных клеток в новой трубки. Вымойте клетки путем повторного приостановления в 10 мл HBSS, содержащий 2% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина и ЭДТА 10 мм (изоляция буфера) и затем центрифугирования в 4 oC 400 РРС для 5-10 мин до Пелле клетки.
      Внимание: Используйте только средства массовой информации, который содержит по крайней мере 1 г/Л глюкозы.
  5. Для CD11b позитивного выбора, вновь приостановить 1 x 108 клеток в 1 мл изоляции буфера и Инкубируйте 15 мин с 50 мкл конъюгированных CD11b магнитные бусы на 4 oC.
    1. Вымойте избыток бусы путем добавления 9 мл буфера изоляции и центрифугирование в 400 РРС для 5-10 мин на 4 oC. аспирата supernatants и вновь приостановить клеток в 1 мл изоляции буфера. Примените клетки на prewashed магнитные столбца согласно инструкциям производителя.
    2. Удалите столбец из магнита, Пипетка 6 мл буфера изоляции на столбец и промыть магнитно меченых клетки в стерильных коллекции трубку, нажимая на поршень. Центрифуга клетки на 400 РРС для 5-10 мин на 4 oC. мыть столбце дважды с 3 мл буфера изоляции.
    3. Вновь приостановить клеток в 1 x 107 клеток/100 мкл буфера изоляции и пятно с следующие Флюорофор конъюгированных антител: 0.1 мкг CD115, 0,25 мкг MHCII и 0,1 мкг Ly-6 C/1 x 106 клеток.
  6. Сортировать клетки стробирования на малых стороны точечной (SSC) и малых вперед точечной (FSC) клетки.
    Примечание: Воспалительные моноциты мыши обычно определяются как CD115+/MHCIIЛо/neg/Ly6CПривети патрулирование моноциты определяются как CD115+/MHCIIЛо/neg/Ly6Cneg 4,5. В тех случаях, когда требуется никакого разделения между двумя подмножествами, всего SSCЛо/FCSЛо/CD115+/MHCIIЛо клетки могут быть отсортированы. Наивно и опухоли подшипник мышей содержат приблизительно 5-8 х 104 MoDC на 1 мл крови и до 4-5 x 105 MoDC следующие впрыска GM-CSF. Из них около 70% являются воспалительные моноцитов и 30% патрулирование моноцитов.
  7. Пластина клетки в концентрации 1 х 106 клеток/мл в полной СМИ, дополнены 20 нг/мл ГМ-КСФ. После 1 дня передачи non сторонник и слабо адэрентных клеток к новой пластины и культуре еще 4-5 дней.
    Предупреждение: DC СМИ не должны дополняться с пируваткиназой.

3. Подготовка опухоли IgG иммунных комплексов

  1. Культуры опухолевых клеток в колбе культуры2 75 см до 70% слияния в полной DMEM СМИ.
    1. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина/ЭДТА для отсоединения клетки от культуры колбу и монитор морфологии клеток под микроскопом света, чтобы избежать чрезмерной trypsinization.
    2. Добавьте 8 мл полного культуры средств массовой информации (на 2 мл трипсин) тормозят Пищеварение трипсина и центрифуги на 4 oC, 400 РРС для 5-10 мин до Пелле клетки.
      Примечание: Не забудьте проверить опухолевых клеток на микоплазмы с использованием коммерческих комплект ПЦР. Тест на наличие грамотрицательных бактерий и грибковых эндотоксинов, используя Limulus амебоцит Lysate (Лал) пробирного28). Сыворотке должен быть фильтруется через 0,22 мкм и проверены на вирусы 9 Кодекса федеральных правил. Кроме того проверьте культуры средств массовой информации и сыворотки, сбрасывая 100-200 мкл на LB агар или бульон и культуры для 2 дней на 37 oC.
    3. Вымыть клетки снова от трипсина и сыворотке крови остается путем повторного приостановления их в 10 мл PBS и центрифуги на 400 РПРС для 5-10 мин аспирата супернатант и повторите мытье 2 раза.
  2. Исправьте клетки в 1,8% буферизуются параформальдегида 10 мин при комнатной температуре.
    1. Вымойте клетки путем повторного приостановления их в 10 мл PBS и центрифуги на 4 oC 400 РПРС для 5-10 мин.
    2. Аспирационная supernatants и повторить мыть еще два раза.
      Необязательно: Для поглощения анализов опухоль, клетки могут быть помечены по инкубации их за 5 мин на 37 oC на PBS, содержащие 1 мкм Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE). CFSE затем обслуживается с полным СМИ за 10 мин во льду. Клетки должны быть вымыты широко в PBS, содержащий 2% сыворотки для удаления остатков краски.
  3. Вновь приостановите ячейки в буфер СУИМ (PBS дополнены с FCS 2% + 5 мм ЭДТА) и 0,5 мкг/мл анти CD16/32 для того, чтобы заблокировать потенциальные неспецифической белок белковых взаимодействий. Плита в форме U 96 скважин/пластины в концентрации 1 х 105 клеток 100 мкл.
    1. Добавление различных разведениях опухоли связывания антител, начиная от 5 мкг - 5 нг/1 х 105 клеток. Инкубируйте пластину на льду для 15-20 мин.
      Примечание: IgG антитела были изолированы от сыворотки наивно 20-24 недель самок мышей на белок А столбцы, как описано24.
  4. Вымойте клетки путем добавления 150 мкл PBS и центрифугирование пластину на 4 oC 400 РРС для 5-10 мин.
    1. Отменить supernatants и повторите мыть дважды. Вновь приостановите клетки в 100 мкл СУИМ буфер, содержащий вторичное антитело проспряганное Флюорофор. Инкубируйте пластины на льду за 20 мин.
    2. Вымыть клетки путем добавления 200 мкл буфера СУИМ и центрифугирование пластину на 400 РРС для 5-10 мин отбросить supernatants и повторить мыть.
    3. Анализировать опухоли привязки проточной цитометрии и определить минимальную концентрацию, необходимые для покрытия клетки.
      Примечание: Антитела, которые не увеличивают среднее флуоресценции интенсивности (MFI) окрашенных опухолевых клеток, по крайней мере пять раз изотипа контроль над не должен использоваться в последующих функциональных анализов.

4. Активация MoDC с опухоль IgG IC

  1. Слой опухолевых клеток с минимальной концентрации IgG, как описано в разделах 3.1 через 3.4.3
    1. Один день перед активацией MoDC опухоли IC, замените MoDC культуры средств массовой информации, который содержит ГМ-КСФ. Чтобы сделать это, мягко аспирационная СМИ и вымыть клетки один раз с подогретым полный культуры средств массовой информации.
      Примечание: Изолированные Зрелые связанный тумором MoDC следует культивировали для по крайней мере 2-3 ч (или даже на ночь) после сортировки в полной СМИ без ГМ-КСФ и перед их активацией с IC.
    2. Для анализа поглощение опухоли добавить CFSE-меченых опухоли IC MoDC в соотношении 1:5 (IC:MoDC) и инкубировать на ночь для 12-16 h в 1 мл полной СМИ за 1 x 10-6 DC.
    3. Для анализа СУИМ MoDC активации экспериментов добавить опухоли IC в соотношении 1:1 (IC:MoDC) и инкубировать на ночь для 12-16 ч.
      Примечание: Настоятельно рекомендуется включить позитивный элемент, в котором MoDC стимулируются с ПЛАСТИНОК или другими агонистами TLR 1 мкг/мл.
    4. После ночи активации, аспирационная supernatants и вымыть клетки мягко три раза с изоляции буфер, или 10 мм ЭДТА HBSS.
    5. Чтобы отсоединить DC от плиты, инкубации клеток для 2-3 мин в 1 мл HBSS, содержащие 10 мм ЭДТА и отсоединить клетки путем энергичных закупорить.
    6. Центрифуга клетки на 400 РПРС и вновь приостановить 1 х 106 DC в 90 мкл PBS, дополненная 2% FCS, 5 мм ЭДТА (FACS буфера) и 0,5 мкг блокирующих антител. Инкубируйте на льду для 5-10 мин.
    7. Добавить 10 мкл окрашивания смесь антитела к клеткам и инкубировать на льду за 15 мин.
    8. Добавьте 2 мл СУИМ буфера в клетки и центрифуги на 4 oC 400 РПРС для 5-10 мин.
  2. Вновь приостановите клетки в 200 мкл буфера СУИМ.
    1. Добавить 0,5 - 1 мкг/мл DAPI 1-2 мин перед запуском образцов, чтобы исключить мертвые клетки из анализа. Не чрезмерно инкубировать DAPI, как MoDC будет принимать его в течение 10-15 мин.

Результаты

Первоначально мы сравнили антител от наивного сингенных и аллогенной мышей способность связывать опухолевых клеток. С этой целью B16F10 и LMP линии клетки опухоли фиксировали в параформальдегида и тщательно промывают. B16F10 — линия клеток меланомы, который был первоначаль...

Обсуждение

Учитывая большое количество DC, необходимых для вакцинации мышей (около 2-4 x 106 DC за одну мышь), большая часть стратегии в мышах основаны на изоляции DC от БМ и селезенки, следуют их активации ex vivo вакцинации. Однако попытки активировать опухоли DC в естественных условиях, испо...

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что они имеют никакого конфликта интересов и что они не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Нет

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PREMIUMGE-Healthcare17-5442-02
OptiPrepStemCell Technologies07820
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-052-301
EasySep Monocyte Isolation KitStemCell Technologies19861
Collagenase IVSigmaC9697-50MGTest each lot for endotoxin
DNase ISigmaDN25-10MG
HBSSThermoFisher14025092
FBSThermoFisher16140071Test each lot for endotoxin
PE-CD11cBiolegend117307
APC-CD11bBiolegend101211
Brilliant Violet 650 MHCIIBiolegend107641
AF48- CD86Biolegend105017
APC/Cy7-Ly-C6Biolegend108423
PE/Cy7-CD15Biolegend135523

Ссылки

  1. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  2. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
  4. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
  5. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
  6. Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  7. Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
  8. Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
  9. Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
  10. Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
  11. Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  12. Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
  13. Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
  14. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  15. Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
  16. Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
  17. Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
  18. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
  19. Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
  20. Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
  21. Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
  22. Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
  23. Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
  24. Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
  25. Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
  26. Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
  27. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
  28. Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
  29. Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
  30. Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
  31. Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
  32. Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
  33. Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
  34. Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
  35. Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
  36. Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135DCDCFc

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены