Composición corporal y análisis jaulas metabólico en ratones de reserva grasa alta

Resumen

Este protocolo describe el uso de un analizador de composición corporal y el sistema metabólico de control animal para caracterizar la composición corporal y parámetros metabólicos en ratones. Un modelo de obesidad inducido por la alimentación alta en grasas se utiliza como un ejemplo para la aplicación de estas técnicas.

Resumen

Alteraciones en la composición corporal (masa grasa o magra), parámetros metabólicos tales como consumo de oxígeno corporal total, gasto de energía y utilización de sustrato y conductas tales como el consumo de alimentos y actividad física pueden proporcionar información importante con respecto a los mecanismos subyacentes de la enfermedad. Dada la importancia de la composición corporal y metabolismo para el desarrollo de la obesidad y sus secuelas posteriores, es necesario hacer medidas precisas de estos parámetros en el marco de la investigación preclínica. Avances en la tecnología en las últimas décadas han hecho posible obtener estas medidas en modelos de roedores de una manera no invasiva y longitudinal. En consecuencia, estas medidas metabólicas han demostrado ser útiles al evaluar la respuesta de manipulaciones genéticas (ratones por ejemplo transgénicos o knockout, viral de la precipitación o la sobreexpresión de los genes), compuesto de drogas experimentales proyección y dietéticos, intervenciones de actividad física o conductuales. Adjunto, describimos a los protocolos utilizados para medir la composición corporal y parámetros metabólicos usando un animal control en ratones alimentados con dieta grasa, alimentados con chow y alta.

Introducción

Metabolismo es la base de muchos aspectos de celular normal, el órgano y la fisiología de todo el cuerpo. En consecuencia, en el marco de diversas patologías, alteraciones del metabolismo pueden contribuir directamente a la condición subyacente o pueden ser afectados negativamente como un efecto secundario de la patología. Tradicionalmente, investigación metabólica y estudios de balance de energía se han concentrado en el campo de la obesidad y condiciones relacionadas tales como resistencia a la insulina, prediabetes, diabetes, intolerancia a la glucosa y enfermedad cardiovascular. Esta investigación se justifica dada la prevalencia creciente de tales condiciones en todo el mundo y el individuo, sociedad, y costos económicos causan estas condiciones. Como tal, el desarrollo de estrategias de prevención y terapéutica nueva obesidad objetivo es una meta constante en laboratorios de investigación alrededor del mundo y modelos preclínicos murinos son confiar pesadamente en estos estudios.

Ratones de peso proporciona una evaluación confiable de la pérdida o ganancia de peso, no proporciona un desglose de los diferentes componentes que conforman la composición de todo el cuerpo (masa grasa, masa magra, agua libre así como otros componentes tales como piel y garras). El pesaje de los cojines gordos en la terminación de los estudios una vez que el ratón ha fallecido proporciona una medida exacta de diferentes depósitos de grasa pero sólo puede proporcionar datos para un momento único. Como consecuencia, a menudo es necesario inscribirse varias cohortes para investigar el desarrollo de la obesidad en el tiempo, significativamente mayor número de animales, tiempo y costos. El uso de absorciometría de rayos x de energía dual (DEXA) proporciona un enfoque para evaluar el contenido de tejido magro y grasa del cuerpo y permite al investigador obtener datos de forma longitudinal. Sin embargo, el procedimiento requiere ratones anestesiados¹y repetidos episodios de anestesia pueden afectar la acumulación de tejido adiposo o afectar otros aspectos de la regulación metabólica. EchoMRI utiliza la relaxometría de resonancia magnética para medir la masa grasa y magra, agua libre y agua total contenido. Esto es factible debido a la creación de contraste entre los componentes de tejidos diferentes, con diferencias en la duración, amplitud y distribución espacial de radiofrecuencias generadas que permiten la delimitación y cuantificación de cada tipo de tejido. Esta técnica es ventajosa ya que es no invasivo, rápido, simple, no requiere anestesia ni radiación y, lo importante, ha sido validada positivamente contra análisis químico².

Una consideración clave de la obesidad y la investigación relacionada es la ecuación de balance de energía. Mientras que la acumulación de grasa es más complicada que puramente energía (alimentación) versus energía hacia fuera (gasto de energía), son factores vitales para poder medir. Gasto energético diario es la suma de cuatro componentes: (1) gasto de energía basal (tarifa metabólica de reclinación); (2) el gasto de energía debido al efecto térmico de consumo de alimentos; (3) la energía requerida para la termorregulación; y (4) la energía se gasta en la actividad física. Como gasto de energía genera calor, midiendo la producción de calor por un animal (conocido como calorimetría directa) puede utilizarse para evaluar el gasto de energía. Alternativamente, la medición de inspirado y expirado las concentraciones de O₂ y CO₂, lo que para la determinación de consumo de todo el cuerpo O₂ y CO₂ producción, puede ser utilizada como una forma de medir indirectamente (indirecta Calorimetría) producción de calor y, en consecuencia, calcular el gasto de energía. Un incremento en la ingestión de alimentos o una disminución en el gasto de energía se predispone a ratones a aumento de peso y observaciones de los cambios en estos parámetros pueden proporcionar información útil de probables mecanismos de acción en modelos particulares de la obesidad. Un parámetro metabólico relacionado de interés es la relación de intercambio respiratorio (RER), un indicador de la proporción de sustrato/combustible (es decir, carbohidratos o grasa) que sufre metabolismo y se utiliza para producir energía. En consecuencia, medición del consumo de alimentos (energía consumida) combinado con niveles de actividad física, el consumo de₂ O, RER y gasto de energía puede proporcionar una comprensión amplia del perfil metabólico de un organismo. Un método para reunir estos datos es utilizar un animal de laboratorio control (almejas), que se basa en el método de calorimetría indirecta para medir el gasto energético y tiene la capacidad añadida de determinación de los niveles de actividad física (viga se rompe) y la ingestión de alimentos mediante escalas incorporado en la cámara de medición.

En este protocolo nos proporcionan una descripción directa de la utilización de un analizador de composición corporal para evaluar composición corporal en ratones y un sistema de control animal metabólico para medir aspectos del metabolismo. Consideraciones y limitaciones de estas técnicas se discutirán y sugeridos métodos de análisis, interpretación y representación de datos.

Protocolo

Todos los experimentos descritos fueron aprobados por el Alfred médico investigación educación recinto Animal Comité de ética (AMREP AEC) y ratones recibieron atención humana en línea con la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) de Australia directrices sobre Experimentación con animales. Los animales fueron administrados su prescripción de dieta y agua ad libitum y ubicado en un entorno de temperatura controlada (~ 21-22 ° C) con una luz de 12 h y 12 h oscuridad ciclo. Semana siete ratones machos viejos (en un fondo de C57Bl/6J) fueron alimentados con cualquier dieta chow normal regular (14.3 MJ/kg de contenido de energía, compuesto por 76% de kJ de hidratos de carbono, grasa 5%, 19% de proteína; véase tabla de materiales) o para el grupo de alimentación grasa alto, un alto grado en grasas de la dieta () (HFD) energía contenido de 19 MJ/kg, que consta de 36% de kJ de hidratos de carbono, 43% de grasa, 21% de proteína, especialidad alimenta) durante 3 semanas. Peso corporal y las medidas de composición corporal utilizando una máquina de EchoMRI se realizaron semanalmente mientras que el análisis de control metabólico ocurrió en una almejas después de 3 semanas de la dieta.

1. procedimiento de analizador de composición corporal

Nota: Para funcionar de forma óptima, el EchoMRI 4-en-1 utilizado en este protocolo se debe contener dentro de una habitación donde la temperatura del aire es estable y no varía. Idealmente esto debe ser constantemente monitoreado. Movimiento de la máquina y las interrupciones para poder también debe ser evitado si es posible. Si se ha interrumpido el suministro de energía y el sistema debe ser reiniciado, permiten al menos 2-3 h para la máquina se caliente antes de usarlo otra vez. Antes de comenzar, asegúrese de que usted está usando equipo de protección personal correcto.

1. Antes de la exploración de ratones, realizar una prueba del sistema en el equipo de analizador de composición corporal. Esto implica el uso de un estándar de calibración (que se refiere como una muestra de prueba de sistema de aceite canola (costes)) para probar la precisión del instrumento y asegurar que no ha habido deriva en su exactitud.
   1. Abra el software de sistema, luego haga clic en el botón de barra de herramientas de prueba del sistema o pulsando "Alt + Y" al mismo tiempo.
   2. Antes de la prueba del sistema se lleva a cabo por el equipo, espere un recordatorio verificar que los gastos correctos (en este caso los costos específicos de ratón) se ha colocado en el pórtico del sistema ( figura 1). Una vez confirmado que este es el caso, aceptar para proceder con la prueba, que tendrá unos minutos para completar.
2. Una vez que ha pasado la prueba del sistema, seguir con la exploración.
   1. Si la prueba del sistema falla, repita la prueba de sistema.
   2. Si la máquina continúa fuera de rango (lo que indica que se ha producido una desviación), la calibración puede ser necesaria para rectificar la situación. Esto completa siguiendo las instrucciones o como se describe en el manual de usuario suministrado en el momento de la compra. Si el problema persiste, compruebe el manual³ o informar el problema al equipo de soporte del fabricante y buscar más instrucción.
3. Coloque los ratones en un porta espécimen animal pequeño (cilindro largo) para evitar que mientras que en la máquina. Para ello, coloque el soporte horizontal, coger el ratón e introduzca en la abertura de la cabeza del cilindro primero. Lentamente y con cuidado llevar el soporte a la posición vertical para que el ratón está en la parte inferior del cilindro y listo para el análisis.
4. Una vez dentro del sujetador, inserte un delimitador para limitar el movimiento del ratón durante el período de medición. En algunas circunstancias, con los ratones extremadamente activos, puede ser necesario sujetar el delimitador en el lugar con la punta del dedo.
   Nota: Familiarizar a los ratones con la colocación de los soportes de la muestra antes de su análisis inicial para reducir el estrés. El uso de un soporte de espécimen de animal color rojo también puede reducir la respuesta de estrés potencial, como los ratones sienten que están en la oscuridad.
5. Dentro del software, seleccionar una carpeta (barra de herramientas de carpeta) para guardar los datos y crear un nombre de archivo.
6. Si es necesario, reducir la cantidad de ruido en las mediciones de grasa y magras incrementando el número de acumulaciones primarios de la exploración. Una vez que se inicia el software, las acumulaciones de primarias se establece en un valor predeterminado recomendado para uso diario general; a menos que haya una razón específica para cambiar estos parámetros, la configuración predeterminada le dará el nivel necesario de precisión a los usuarios.
7. Si no está interesado en la obtención de datos de agua libre y agua total, apague la etapa agua seleccionando la ficha para decir que no. Esto reducir significativamente la duración de la exploración y mejorar el rendimiento.
8. Iniciar la exploración seleccionando "start scan" o pulsando F5 en el teclado. Ingrese todos los datos relevantes sobre el animal (por ejemplo, animal ID, masa del cuerpo, etcetera.) y pulse 'Aceptar' o F5 para iniciar la exploración, que tendrá aproximadamente 1 minuto.
9. Después de que los datos han sido obtenidos, desmonte la sujeción del animal con el ratón de la máquina y colocar la espalda del animal en su jaula. Una vez que todos los animales han sido explorados, exportar los datos para su análisis posterior y la colación.
10. Antes y después del uso, limpie bien los titulares de los animales según las instrucciones del fabricante. Como estos soportes están construidos de plástico acrílico, alcohol isopropílico y alcohol etílico deben evitarse ya que pueden causar agrietamiento de los titulares o rápido deterioro del soporte, lo que aumenta la probabilidad de rotura. En su lugar, use una solución de agua tibia para lavar platos o, si más desinfectante es necesario, utilizar F10 (en una dilución de 1:125) u otros aerosoles desinfectantes o de limpieza (véase Tabla de materiales) y luego limpie.

2. metabólico Animal procedimiento del sistema de monitoreo

Nota: El sistema requiere ~ 2 h para calentar y estabilizar. Si la máquina se ha apagado, se debe encender para permitir que la célula de Zirconia para calentarse a 725 º C. También ponemos generalmente ratones en el analizador de composición corporal un día antes de entrar en el animal, sistema de vigilancia para evitar problemas con la tensión de retención.

1. Asegúrese de que el ordenador conectado al sistema de vigilancia animal esté encendido y abra el programa de control. Seleccione la opción "Oxymax utilidad" en el menú herramientas para iniciar las bombas.
2. Botellas de agua se llenan de agua apropiado, pesar inspeccionar la salud de los ratones y organizar la comida. Si en el sistema de medición de la ingestión de alimentos, considere pulverización la comida. Llenar las tolvas de alimentación presionando el alimento de plataforma y punta con resorte en la tolva. Asegúrese de que la tolva de alimentos y la botella de agua son completamente llenos para asegurar que hay suficiente comida y agua para durar el tiempo experimental.
3. Comprobar el estado del drierite/secante; Si se utiliza un indicador de color, debe ser azul y por lo tanto seco, pero si es rosa, tiene absorción de humedad importante y debe ser reemplazado o recargar.
4. Comprobar el estado de la trampa de amoniaco y soda cal y cámbielo si es necesario. Si se conecta la trampa de amoniaco dos a la vez, cuando la segunda trampa muestra signos de un cambio de color, vuelva a colocar el primero de ellos. Un aumento en el desplazamiento de CO₂ también puede significar la necesidad de reemplazar la cal de soda.
   Nota: Desecante se puede secar en un horno y reutilizado, sin embargo seguimos las recomendaciones del fabricante del sistema para utilizar fresco cada vez.
5. Montar las cámaras. Para hacer esto, coloque la tolva de alimento en el equilibrio, luego coloque la cámara en la parte superior con la plataforma perforada que se convierte en el piso de la cámara que se inserta. Cuidadosamente colocar el ratón en la cámara y conecte la tapa del sistema con la parte delantera y clips de nuevo y asegure antes de sujeción y posicionamiento de la botella de agua. Como medida de precaución, vuelva a verificar todas las tapas de cámara, ratones y agua (figura 2A-D).
   Nota: Dependiendo del tamaño de los ratones siendo examinado, puede ser necesario ajustar la altura de los espacios por encima de la tolva de alimentos para que los ratones tienen acceso a los alimentos pero no hay suficiente espacio en el que puede dormir directamente sobre el comedero.
6. Pues es recomendable calibrar los sensores de gas antes de cada experimento, calibrar el sistema.
   1. Utilice un gas de composición conocida (0,5% de CO₂, 20,5% O₂, balance de nitrógeno). Conecte el tanque de gas de calibración para el sistema a través de un regulador y manguera. Activar y asegurar la presión de salida del tanque es lectura 5-10 psi.
      Nota: Algunos sistemas tendrán un segundo tanque, manguera y regulador para el uso de nitrógeno puro como gas "offset". El sistema que opera en lugar de otro utiliza cal sodada para generar aire libre de CO₂ .
   2. Siga los procedimientos para calibrar el O₂ y CO₂ sensores. Seleccione "calibración" en el menú herramientas y calibrar secuencialmente el O₂ y CO₂. Antes de calibrar Asegúrese que 1) de la muestra y los flujos de referencia son LPM 0,400, 2) la temperatura del sensor₂ O Zirconia es 725 ° C (± 1 ° C), 3) la muestra y referencia secador y bombas de aire están en, y 4) el gas de calibración está conectado y encendido.
   3. Si es necesario, durante la calibración del sensor de O₂ , ligeramente ajusta el offset en el frente del sensor de oxígeno de zirconia para alcanzar un valor O₂ cociente de 1.0000 (± 0.0002). Esto es para asegurar que está dentro de límites aceptables (resaltados en verde font en la pantalla de software en la pantalla del ordenador).
   4. Después de éxito O₂ y CO₂ calibración del sensor, desconecte el cilindro de gas de calibración y desconecte la manguera del regulador. Después de la calibración, O₂ para el aire de referencia (atmosférico) debe leer 20.92 (± 00.02). Si la calibración está fuera de tolerancia, repita y se refieren a la solución de problemas guia del fabricante. En caso contrario, póngase en contacto con el fabricante para obtener más instrucciones.
7. Proceda con el montaje experimental. Seleccione "Abrir archivo experimental" el experimento. Seleccione la plantilla adecuada (por ejemplo, ratón). Bajo "configuración" en el menú de experimento definir los parámetros del experimento que debe ser registrado (por ejemplo, ratón ID, peso, grupo, etc.) deseleccionar cualquier cámaras no esté en uso y seleccione la ubicación para el experimento para salvarse.
8. Asegúrese de que las escalas han sido taradas si medir la ingestión de alimentos y comenzar la captura de datos seleccionando "ejecutar" en el menú de experimento. Datos se capturan durante diferentes periodos de tiempo dependiendo del fenotipo, las pautas de aislamiento de animales y uso del sistema.
   Nota: En nuestras manos, el experimento es habitualmente ejecute durante 48 h, con las primeras 24 h utilizada como aclimatación al nuevo entorno y la segunda 24 h utilizado para análisis de datos. El periodo de recolección de datos se basa en cuánto el investigador desea mantener sus ratones solo vivienda y depende de la aprobación de la ética animal. Por otra parte, si existen disposiciones, ratones pueden aclimatados en las cámaras antes de ser colocado en el sistema y conectados. Cada cámara mide aproximadamente una vez cada 13 minutos cuando se utiliza un sistema de 12 cámaras.
9. Controlar regularmente y controlar los resultados que se obtienen mientras que los ratones están en el sistema para asegurar el bienestar de los animales y que se está recogiendo los datos pertinentes. Cualquier tema puede ser identificado en esta etapa y rectificado. Verificación de cada ratón cada mañana y tarde cuando están en el sistema.
10. Compruebe la ficha metabólica en la parte superior de la página de archivo de datos para los datos recogidos en tiempo real para cada ratón en lo que respecta a los gastos de consumo, el RER y la energía del oxígeno. Mientras tanto, haz pausas y datos de consumo de alimentos pueden ser localizados en las fichas de actividad y alimentación, respectivamente. Compruebe que está leyendo "O₂ en" alrededor de 20.90-20.94, "CO₂ en" es de alrededor de 0.040 - 0.050, el RER está entre 0,7 y 1, y el caudal es constante en el 0.5 - 0.6 L/min.
11. Periódicamente, comprobar que los ratones tengan acceso a alimentos y agua y que está consumiendo cada uno. Asegúrese de que no manifiestan signos de dificultad tales como cavar en el suelo perforado. Asimismo, supervisar los resultados que se muestran.
12. Al finalizar el tiempo experimental asignado, seleccione "stop" en el menú de experimento y exportar los resultados (como archivos CSV, archivo > Exportar > generar tema CSV) para el análisis.
13. Inspeccionar la salud de los ratones, pesarlos y luego regresar a sus jaulas hogar.
    1. Ratones pueden ser hostiles hacia los demás después de la separación, así monitorear una vez que se encuentran juntos otra vez.
    2. Desmontar las jaulas, quitar el exceso de comida de tolvas y punta cualquier heces, orina y alimento de las jaulas. Sumergir las botellas y sippers en solución diluida de T-bac, remojar y limpiar los otros componentes en solución de lejía diluida. Enjuague con agua limpia y déjelo al aire seco.
14. Calcular parámetros metabólicos con el software. El software utiliza una serie de ecuaciones para proporcionar los datos finales de salida⁴.
    Para el cálculo de consumo y dióxido de carbono la producción de oxígeno: consumo de oxígeno: VO₂ (LPM)_{= V}O_2i - V_oO_2o; Producción de dióxido de carbono: VCO₂ (LPM)_{= Vo}CO_2o-VCO_2i
    Donde: V = la tasa de entrada de ventilación (LPM), V_o = la tasa de ventilación de salida (LPM), O_2i = la concentración de O₂ en la entrada, O_2o = la concentración de O₂ en salida, CO_2i = CO₂ concentración en entrada, CO_2o = la concentración de CO₂ en la salida.
    Para el cálculo de RER: RER = VCO₂ / VO₂. Tenga en cuenta que no se midió la oxidación de proteínas y por lo tanto el RER no fue ajustado para esto.
    Para el cálculo de gasto energético: gasto de energía: CV = 3.815 + 1.232* RER
    Calor (Kcal/h)) = CV * VO_2. Donde: CV es el poder calorífico (la relación entre el calor y el volumen de consumo de oxígeno). Esto se deriva de "Los elementos de la ciencia de nutrición" conocido como la tabla de Lusk, conformado por Graham Lusk.

Resultados

Los resultados observados en la figura 3 muestran un cambio típico en parámetros de composición corporal en alta alimentación grasa, medido a través de EchoMRI. Al inicio del estudio no hubo diferencias en cualquier parámetro medido (Figura 3A-F). Sin embargo, después de sólo una semana de alimentación alta en grasas, hubo un aumento significativo en el peso corporal, masa grasa y el porcentaje de masa g...

Discusión

Pasos críticos

Los protocolos descritos proporcionan un ejemplo de formas de composición del cuerpo medida y diferentes parámetros metabólicos en ratones usando un analizador de composición corporal y un metabolismo animal sistema de monitoreo. Para ambas técnicas, es críticamente importante asegurar que las máquinas están trabajando de forma óptima, y para ello, es imprescindible que el investigador realiza una prueba del sistema para el analizador de composición c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 in 1 system	EchoMRI	4 in 1 system	Whole body composition analyser
Canola oil test sample (COSTS)	EchoMRI	Mouse-specific (contact company for cat number)
Animal specimen holder	EchoMRI	103-E56100R
Delimiter	EchoMRI	600-E56100D
12 chamber system	Columbus Instruments	Custom built	Metabolic Caging System; includes control program
Drierite	Fisher Scientific	238988	CLAMS consumable
Calibration gas tank	Air Liquide	Mixed to order	Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen).
Normal chow diet	Specialty Feeds	Irradiated mouse and rat diet
High fat diet	Specialty Feeds	SF04-001
Balance	Mettler Toledo	PL202-S	Balance for weighing mice
TexQ Disinfectant spray	TexWipe
Hydrogen Peroxide cleaning solution	TexWipe	TX684