Markierungsfreie Identifikation von Lymphozyten-Subtypen mit dreidimensionale Quantitative Phase Bildgebung und maschinelles lernen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen mit quantitativen Phase Bildgebung und ein maschinelles lernen-Algorithmus. Messungen der 3D Brechungsindex Schichtbilder von Lymphozyten präsentieren 3D morphologische und biochemische Informationen für einzelne Zellen, die dann mit einem Computerlernen Algorithmus zur Identifizierung von Zelltypen analysiert wird.

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier ein Protokoll für die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen mit quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles lernen. Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen ist wichtig für das Studium der Immunologie sowie Diagnostik und Behandlung von verschiedenen Krankheiten. Standard-Methoden zur Klassifizierung von Lymphozyten Arten setzen derzeit, auf Kennzeichnung bestimmte Membranproteine über Antigen-Antikörper-Reaktionen. Diese Kennzeichnung Techniken tragen jedoch die möglichen Risiken der Zellfunktionen zu verändern. Das hier beschriebene Protokoll überwindet diese Herausforderungen durch die Ausnutzung der intrinsischen optische Kontraste durch 3D quantitativen Phase Bildgebung und eine Maschine Lernalgorithmus gemessen. Messung der 3D Brechungsindex (RI) Schichtbilder von Lymphozyten liefert quantitative Informationen über 3D Morphologie und Phänotypen der einzelnen Zellen. Die biophysikalischen Parameter aus der gemessenen 3D RI Schichtbilder extrahiert werden dann mit einem Algorithmus für maschinelles lernen, die markierungsfreie Identifizierung der Lymphozyten-Typen auf eine einzelne Zelle Ebene ermöglichen quantitativ analysiert. Wir messen die 3D RI Schichtbilder von B, T CD4 + und CD8 + T-Lymphozyten und identifiziert ihre Zelltypen mit über 80 % Genauigkeit. In diesem Protokoll beschreiben wir die einzelnen Schritte zum Lymphozyten isoliert, 3D quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles Lernen zur Ermittlung Lymphozyten Typen.

Einleitung

Lymphozyten lassen sich einteilen in verschiedene Subtypen einschließlich B, Helfer (CD4 +) T, zytotoxische (CD8 +) T und regulatorischen T Zellen. Jeder Lymphozyten-Typ hat eine andere Rolle in der adaptiven Immunsystems; zum Beispiel produzieren B-Lymphozyten Antikörper, wobei T-Lymphozyten spezifische Antigene erkennen, Beseitigung von abnormen Zellen und B-Lymphozyten zu regulieren. Lymphozyten Funktion und Regulation ist fest geregelt und im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs¹, Autoimmunerkrankungen²und Virusinfektionen³. So ist die Identifizierung von Lymphozyten....

Protokoll

Tierbetreuung und experimentelle Verfahren wurden unter Zustimmung des institutionellen Tier Pflege und Nutzung Ausschuss KAIST (KA2010-21, KA2014-01 und KA2015-03) durchgeführt. Alle Versuche in dieser Studie wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt.

(1) Lymphozyten Isolation aus Maus Blut

1. Sobald eine Maus C57BL/6J durch CO₂ Einatmen eingeschläfert, 26 G Nadel ins Herz Maus und 0,3 mL Blut zu sammeln. Direkt ins Blut ein Rohr mit 100 U/mL Heparin-Lösung mit 1 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) verdünnt.
   Hinweis: Alternativ können Lymphozyten aus der Milz isoliert werden.
2. Zentrifug....

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt schematisch das gesamte Protokoll. Bei der hier vorgestellten Verfahren wir isolierte B (n = 149), CD4 + T (n = 95), und CD8 + T (n = 112) Lymphozyten. Um Phase und Amplitude Informationen in verschiedenen Winkeln der Beleuchtung zu erhalten, wurden mehrere 2D Hologramme von einzelnen Lymphozyten gemessen durch Veränderung des Winkels der Beleuchtung (von-60 ° bis 60 ° c). In der Regel 50 Hologramme können verwendet werden, um eine 3.......

Diskussion

Wir präsentieren Ihnen eine Protokoll, die die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Typen, die Nutzung von 3D quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles Lernen ermöglicht. Wichtige Schritte dieses Protokolls sind quantitative Phase Bildgebung und Feature-Auswahl. Für die optimale holographische Bildgebung sollte die Dichte der Zellen kontrolliert werden, wie oben beschrieben. Mechanische Stabilität der Zellen ist auch wichtig, eine genaue 3D RI-Verteilung zu erhalten, weil frei verschiebbar ode.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse	Daehan Biolink	C57BL/6J mice	gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube	ThermoFisher Scientific	14-959-53A	15 mL
Phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer	ThermoFisher Scientific	A1049201
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10438018
Antibody	BD Biosciences	553140 (RRID:AB_394655)	CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody	BD Biosciences	555275 (RRID:AB_395699)	CD3ε (clone 17A2)
Antibody	Biolegnd	100734 (RRID:AB_2075238)	CD8α (clone 53-6.7)
Antibody	BD Biosciences	557655 (RRID:AB_396770)	CD19 (clone 1D3)
Antibody	BD Biosciences	557683 (RRID:AB_396793)	CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody	BD Biosciences	552878 (RRID:AB_394507)	NK1.1 (clone PK136)
Antibody	eBioscience	11-0041-85 (RRID:AB_464893)	CD4 (clone GK1.5)
DAPI	Roche	10236276001	4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry	BD Biosciences	Aria II or III
Imaging chamber	Tomocube, Inc.	TomoDish
Holotomography	Tomocube, Inc.	HT-1H
Holotomography imaging software	Tomocube, Inc.	TomoStudio
Image professing software	MathWorks	Matlab R2017b