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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen mit quantitativen Phase Bildgebung und ein maschinelles lernen-Algorithmus. Messungen der 3D Brechungsindex Schichtbilder von Lymphozyten präsentieren 3D morphologische und biochemische Informationen für einzelne Zellen, die dann mit einem Computerlernen Algorithmus zur Identifizierung von Zelltypen analysiert wird.

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier ein Protokoll für die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen mit quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles lernen. Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen ist wichtig für das Studium der Immunologie sowie Diagnostik und Behandlung von verschiedenen Krankheiten. Standard-Methoden zur Klassifizierung von Lymphozyten Arten setzen derzeit, auf Kennzeichnung bestimmte Membranproteine über Antigen-Antikörper-Reaktionen. Diese Kennzeichnung Techniken tragen jedoch die möglichen Risiken der Zellfunktionen zu verändern. Das hier beschriebene Protokoll überwindet diese Herausforderungen durch die Ausnutzung der intrinsischen optische Kontraste durch 3D quantitativen Phase Bildgebung und eine Maschine Lernalgorithmus gemessen. Messung der 3D Brechungsindex (RI) Schichtbilder von Lymphozyten liefert quantitative Informationen über 3D Morphologie und Phänotypen der einzelnen Zellen. Die biophysikalischen Parameter aus der gemessenen 3D RI Schichtbilder extrahiert werden dann mit einem Algorithmus für maschinelles lernen, die markierungsfreie Identifizierung der Lymphozyten-Typen auf eine einzelne Zelle Ebene ermöglichen quantitativ analysiert. Wir messen die 3D RI Schichtbilder von B, T CD4 + und CD8 + T-Lymphozyten und identifiziert ihre Zelltypen mit über 80 % Genauigkeit. In diesem Protokoll beschreiben wir die einzelnen Schritte zum Lymphozyten isoliert, 3D quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles Lernen zur Ermittlung Lymphozyten Typen.

Einleitung

Lymphozyten lassen sich einteilen in verschiedene Subtypen einschließlich B, Helfer (CD4 +) T, zytotoxische (CD8 +) T und regulatorischen T Zellen. Jeder Lymphozyten-Typ hat eine andere Rolle in der adaptiven Immunsystems; zum Beispiel produzieren B-Lymphozyten Antikörper, wobei T-Lymphozyten spezifische Antigene erkennen, Beseitigung von abnormen Zellen und B-Lymphozyten zu regulieren. Lymphozyten Funktion und Regulation ist fest geregelt und im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs1, Autoimmunerkrankungen2und Virusinfektionen3. So ist die Identifizierung von Lymphozyten Arten wichtig zu verstehen, ihre pathophysiologischen Rollen in solchen Krankheiten und für die Immuntherapie in Kliniken.

Setzen derzeit, Methoden zur Klassifizierung von Lymphozyten Arten auf Antigen-Antikörper-Reaktionen durch gezielte, spezifische Oberfläche Membranproteine oder Oberflächenmarker4. Targeting Oberflächenmarker ist eine exakte und genaue Methode, Lymphozyten Arten zu bestimmen. Es erfordert jedoch teure Reagenzien und zeitaufwändigen Verfahren. Darüber hinaus trägt es Risiken für die Änderung der Membran-Protein-Strukturen und die Veränderung des zellulären Funktionen.

Um diese Herausforderungen zu bewältigen, stellt das hier beschriebene Protokoll die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten Typen mit 3D quantitativen Phase imaging (QPI) und Machine learning-5. Diese Methode ermöglicht die Klassifizierung der Lymphozyten-Typen auf eine einzellige Ebene basierend auf morphologische Informationen aus markierungsfreie 3D-Bildgebung einzelne Lymphozyten. Im Gegensatz zu herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken nutzt QPI Brechungsindex (RI) Verteilungen (intrinsische optischen Eigenschaften von lebenden Zellen und Geweben) als optischer Kontrast6,7. Der RI Schichtbilder der einzelnen Lymphozyten darstellen phänotypischen spezifische Informationen für Subtypen von Lymphozyten. In diesem Fall um 3D RI Schichtbilder der einzelnen Lymphozyten systemisch nutzen zu können, wurde ein Algorithmus für betreute maschinelles Lernen genutzt.

Mit verschiedenen QPI-Techniken, die 3D RI Schichtbilder der Zellen aktiv werden seit der Studie der Zelle Pathophysiologie weil sie markierungsfreie, liefern quantitative imaging-Funktion8,9,10, 11,12,13. Darüber hinaus können die 3D RI Verteilungen der einzelnen Zellen morphologische, biochemische und biomechanische über Zellen informieren. 3D RI Schichtbilder wurden früher genutzt, in den Bereichen Hämatologie14,15,16,17, Infektionskrankheiten18,19, 20, Immunologie21, Zelle Biologie22,23, Entzündung24, Krebs25, Neurowissenschaften26,27, Entwicklungsbiologie28, Toxikologie 29und Mikrobiologie12,30,31,32.

Obwohl 3D RI Schichtbilder morphologische und biochemische Zellen ausführlich beschrieben, ist die Klassifizierung der Lymphozyten Subtypen schwer zu erreichen durch einfach bildgebende 3D RI Schichtbilder5. Um systematisch und quantitativ die gemessenen 3D RI Schichtbilder zur Zelle Art Klassifikation auszunutzen, haben wir einen Algorithmus für maschinelles Lernen verwendet. Vor kurzem wurden mehrere Werke beschrieben in welchem quantitativen, die Phase Aufnahmen von Zellen analysiert wurden mit verschiedenen Machine learning Algorithmen33, einschließlich den Nachweis von Mikroorganismen34, Klassifikation der bakteriellen Gattung35 , 36, schnellen und markierungsfreie Nachweis von Anthrax-Sporen-37, automatisierte Analyse von Samenzellen38, Analyse von Krebs Zellen39,40und Erkennung von Makrophagen Aktivierung41.

Dieses Protokoll enthält detaillierte Schritte zum markierungsfreie Identifizierung der Lymphozyten-Typen auf die einzelne Zellenebene mit 3D QPI und maschinelles Lernen führen. Dazu gehören: (1) Lymphozyten isoliert von Maus Blut, 2) Lymphozyten sortieren über Flow Cytometry, 3) 3D QPI 4) quantitative Merkmalsextraktion aus 3D RI Schnittbildern und (5) überwachten Lernen zur Ermittlung Lymphozyten Typen.

Protokoll

Tierbetreuung und experimentelle Verfahren wurden unter Zustimmung des institutionellen Tier Pflege und Nutzung Ausschuss KAIST (KA2010-21, KA2014-01 und KA2015-03) durchgeführt. Alle Versuche in dieser Studie wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt.

(1) Lymphozyten Isolation aus Maus Blut

  1. Sobald eine Maus C57BL/6J durch CO2 Einatmen eingeschläfert, 26 G Nadel ins Herz Maus und 0,3 mL Blut zu sammeln. Direkt ins Blut ein Rohr mit 100 U/mL Heparin-Lösung mit 1 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) verdünnt.
    Hinweis: Alternativ können Lymphozyten aus der Milz isoliert werden.
  2. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g für 5 min bei 4 ° C.
  3. Das Rohr 0,5 mL Ammonium-Chlorid-Kalium Lysiereinrichtung Puffer hinzu und invertieren Sie es sanft ein paar Mal um die Lösung zu mischen.
  4. Inkubieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
  5. Waschen Sie die Zellen durch Hinzufügen von 4,5 mL PBS und Zentrifugieren bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C, zweimal.
  6. Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 100 µL frisches RPMI-1640 Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS).
  7. Das Rohr für die Sperrung 0,1 µg des Antikörpers CD16/32 (2.4G2) hinzufügen.
  8. Halten Sie das Rohr auf dem Eis.

(2) flow Cytometry und Sortierung der Lymphozyten-Subtypen

Hinweis: Sortierung Lymphozyten je nach Zelltyp ist wesentlich für den Aufbau der Boden-Wahrheit (d. h. richtige) Zelle geben Sie Beschriftungen zu trainieren und testen Sie eine Zelle Art Klassifizierung im überwachten lernen. Durchflusszytometrie, eine Gold-Standard-Methode wird verwendet, um zu identifizieren und Lymphozyten42zu trennen.

  1. Machen Sie eine Mischung von Surface Marker Färbung Antikörper in 100 µL frisches RPMI-1640 Medium [mit 10 % FBS, 0,1 µg des CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D 3), CD45R (B220, RA3-6B2) und NK1.1 (PK136)] und 0,25 µg CD4 (GK1.5) Antikörper zu Ziel B, T CD4 + und CD8 + T Lymphozyten.
  2. Die Zellsuspension (erhältlich im Schritt 1,8) fügen Sie 100 µL der Antikörper-Mischung hinzu.
  3. Inkubieren Sie für 25 min auf Eis.
  4. Waschen Sie die Zellen durch Hinzufügen von 5 mL PBS und Zentrifugieren bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C, zweimal.
  5. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL frisches RPMI-1640 Medium mit 10 % FBS und 2,5 µg DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole).
  6. Sammeln Sie jede Art von Lymphozyten abgesondert mit Durchflusszytometrie mit der Fluoreszenz-Ebenen der oben beschriebenen Marker. Gleichzeitig ausschließen abgestorbene Zellen mit DAPI-Signale.
    Hinweis: Ausführliche Protokolle über Flow Cytometry-basierte Zellsortierung gewesen zuvor beschriebenen42.

3. 3D quantitativen Phase Imaging

  1. Halten Sie die sortierten Lymphozyten auf Eis in den bildgebenden Verfahren, die innerhalb von 5 h (seit Lymphozyten isoliert von der Maus) abgeschlossen sein soll, Zellschäden und biochemischen Veränderungen zu vermeiden.
  2. Wählen Sie einen sortierte Zelltyp (unter B, T CD4 + und CD8 + T-Lymphozyten) und verdünnen der Probe (in Schritt 2,6), 180 Zellen/µL mit RPMI Medium für optimale Bildgebung Zustand (d. h. eine Zelle pro Feld Einzelansicht).
  3. Laden Sie 120 μL der verdünnten Probe in einer bildgebenden Kammer durch langsame Injektion. Überprüfen Sie gründlich auf das Vorhandensein von Luftblasen in der bildgebenden Kammer mit der Probe. Treten Bläschen auf, entfernen Sie diese sorgfältig, wie sie die Qualität der Messungen beeinträchtigen werden.
  4. 3D RI Schichtbilder mit einem kommerziellen 3D quantitativen Phase Mikroskop, oder Holotomography und imaging-Software zu erwerben.
    Hinweis: Detaillierte Informationen über den Versuchsaufbau finden Sie in der ursprünglichen Manuskript-5.
    1. Geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf das Objektiv des Mikroskops.
    2. Legen Sie die bildgebende Kammer mit der Probe auf der Bühne der Übersetzung des Mikroskops und einstellen Sie seiner Lage so, dass die Probe mit der Objektivlinse richtet.
    3. Anpassen der axialen Positionen der Objektive und Kondensator Linsen, indem er Fokus und Oberfläche, bzw. im Register "Kalibrierung" der "Mikroskop" Perspektive der imaging-Software.
    4. Richten Sie die Ziel und Kondensator-Objektive durch Klicken auf Auto-Modus. Alternativ verwenden Sie den Scan-Modus und passen Sie die Objektive manuell an, damit die Beleuchtung Muster im zentralen Bereich des Sehfeldes lokalisiert sind.
    5. Zurück in den Normalmodus und passen Sie die Verschiebetisch um eine Zelle in das Blickfeld zu finden.
    6. Finden Sie die Brennebene durch die axiale Position des Objektivs einstellen. Perfekte Fokussierung macht die Probe-Grenze auf dem Bildschirm visualisiert fast unsichtbar.
    7. Passen Sie die Übersetzung-Bühne, um einen Standort ohne eine Zelle zu finden.
    8. Klicken Sie auf kalibrieren um mehrere 2D Hologramme mit unterschiedlicher Beleuchtung Winkel zu messen.
    9. Passen Sie die Verschiebetisch um eine Zelle in der Mitte des Sehfeldes zu finden.
    10. Bewegen Sie zur Registerkarte "Erwerb" und klicken Sie auf 3D Snapshot um die Hologramme der Zelle mit der identischen Beleuchtung Winkel zu messen, wie in Schritt 3.4.8 getan.
    11. Wenn die erfassten Daten im Feld "Data Management" präsentiert werden, mit der rechten Maustaste auf die erfassten Daten und klicken Sie auf Prozess um ein 3D RI-Tomogramm aus der Hologramme, gemessen in den Schritten 3.4.8 und 3.4.10, die Beugung Tomographie Algorithmus zu rekonstruieren 9 , 10 in der imaging-Software implementiert.
    12. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.5-3.4.11 zur Messung von mehr als 100 Zellen um statistische Aussagekraft für maschinelles Lernen zu gewährleisten.
    13. Alle Bilder, die durch den Schritt 3.4.11 verarbeitet werden. können visualisiert werden. Im Bereich "Data Management" mit der rechten Maustaste der das und klicken Sie auf öffnen, um die Daten zu visualisieren. Bereich "Datenmanager" RI-Tomogramm anklicken. Klicken Sie auf der Registerkarte "Voreinstellungen" auf Laden und doppelklicken Sie auf "lymphocyte.xml", die eine vordefinierte Übertragungsfunktion der imaging Software Tomogramm nach 3D RI Distributionen zu visualisieren ist.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.4, 3D RI Schichtbilder alle Lymphozyten Subtypen zu messen.

4. quantitative morphologische und biochemische Merkmalsextraktion aus 3D RI Schichtbilder

  1. Legen Sie die tomographischen Daten in einem einzigen Ordner oben gemessen. Die Zelltypen in die Unterordner dieses Ordners aufgeteilt. Bereiten Sie jedes Tomogramm eine einzelne .mat Datei sein.
  2. Ergänzende Datei 1 - Feature Extraction (geschrieben für ein Bildbearbeitungsprogramm) öffnen.
  3. Bearbeiten Sie die Zeile 14, vorbereitet im Schritt 4.1 Tomogramm-Ordner zu benennen.
  4. Bearbeiten Sie Zeile 15, einen Ordner zum Speichern der extrahierten Feature-Daten zu benennen.
  5. Optional, bearbeiten Sie Zeile 17 RI Schwelle für Merkmalsextraktion Anpassung. Die Standardoption ist 20 RI Schwellenwerte von 1.340-1.378, mit einem Inkrement von 0,002 wie zuvor beschrieben5.
  6. Führen Sie den Code. Der Code berechnet für jeden Tomogramm im Dataset, fünf Funktionen: Oberflächen-Bereich (SA), zelluläre Volumen (CV), Sphärizität (SI), Protein-Dichte (PD) und Trockenmasse (DM), pro RI Schwelle. Die detaillierte Algorithmen zur Merkmalsextraktion werden an anderer Stelle beschrieben5.
  7. Um die Merkmalsextraktion zu überwachen, während der Ausführung überprüfen Sie auf dem Bildschirm RI Schwelle-basierte Zelle Segmentierung zu visualisieren.
  8. Aktivieren Sie den extrahierten Objektdaten als .mat Datei pro Tomogramm, in dem in Schritt 4.4 benannten Ordner gespeichert.

(5) betreutes Lernen und Identifikation

  1. Nach dem Zufallsprinzip aufgeteilt die Objektdaten in Schritt 4.8 Training (70 %) und Prüfung (30 %)-Sets mit separaten Ordnern erhalten.
  2. Offenen ergänzende Datei 2 - Zug (geschrieben für ein Bildbearbeitungsprogramm).
  3. Bearbeiten Sie die Zeile 14, benennen, die die Ausbildung gesetzt, die im Schritt 5.1 vorbereitet.
  4. Bearbeiten Sie Zeile 16, einen Ordner zum Speichern der ausgebildeten Sichter zu benennen.
  5. Bearbeiten Sie Zeile 17, einen Dateinamen für die Klassifizierung festlegen.
  6. Optional, bearbeiten Sie Zeile 19, die Funktionen für die Ausbildung wählen. Die Standardoption wurde wie zuvor angegeben5, verwendet, um die nachstehenden repräsentative Ergebnisse zu erhalten.
  7. Führen Sie den Code. Mit Hilfe der ausgewählten Funktionen die Ausbildung gesetzt, der Code bildet eine Klassifizierung mit dem k-nächster Nachbar-Algorithmus (k -NN; k = 4) und speichert dann die Klassifizierung (wie in Schritt 5.5 genannt) in den Ordner in Schritt 5.4 bezeichnet.
  8. Überprüfen Sie auf dem Bildschirm visualisiert die Sichter-Leistung und die Genauigkeit der Kreuzvalidierung.
  9. Optional, Zug mehrere Klassifikatoren mit verschiedenen Merkmalskombinationen durch Wiederholen der Schritte 5.5-5.7. Wählen Sie dann die Klassifizierung mit der höchsten Genauigkeit der Kreuzvalidierung.
  10. Öffnen Sie ergänzende Datei 3 - Test (geschrieben für ein Bildbearbeitungsprogramm).
  11. Bearbeiten Sie die Zeilen 14-15, benennen die trainierten Klassifikator getestet werden.
  12. Bearbeiten Sie Zeile 17, benennen, die das Test-Set im Schritt 5.1 vorbereitet.
  13. Führen Sie den Code. Der Sichter, die oben beschriebenen identifiziert die Zelltypen der einzelnen Lymphozyten in den Test.
  14. Überprüfen Sie auf dem Bildschirm die Identifikation-Leistung und die Prüfgenauigkeit visualisieren.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt schematisch das gesamte Protokoll. Bei der hier vorgestellten Verfahren wir isolierte B (n = 149), CD4 + T (n = 95), und CD8 + T (n = 112) Lymphozyten. Um Phase und Amplitude Informationen in verschiedenen Winkeln der Beleuchtung zu erhalten, wurden mehrere 2D Hologramme von einzelnen Lymphozyten gemessen durch Veränderung des Winkels der Beleuchtung (von-60 ° bis 60 ° c). In der Regel 50 Hologramme können verwendet werden, um eine 3...

Diskussion

Wir präsentieren Ihnen eine Protokoll, die die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Typen, die Nutzung von 3D quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles Lernen ermöglicht. Wichtige Schritte dieses Protokolls sind quantitative Phase Bildgebung und Feature-Auswahl. Für die optimale holographische Bildgebung sollte die Dichte der Zellen kontrolliert werden, wie oben beschrieben. Mechanische Stabilität der Zellen ist auch wichtig, eine genaue 3D RI-Verteilung zu erhalten, weil frei verschiebbar ode...

Offenlegungen

Prof. Y. Park, Y.-Jo, Y. S. Kim und S. Lee haben finanzielle Interessen in Tomocube, Inc., ein Unternehmen, das vertreibt optische Beugung Tomographie und quantitativen Phase imaging Instrumente und ist einer der Sponsoren des Werkes.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der KAIST BK21 + Programm, Tomocube, Inc., und der National Research Foundation of Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396) unterstützt. Y. Jo erkennt Unterstützung seitens der KAIST Presidential Fellowship und Asan Stiftung biomedizinische Wissenschaft Stipendium.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
MouseDaehan BiolinkC57BL/6J mice gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tubeThermoFisher Scientific14-959-53A15 mL
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer ThermoFisher ScientificA1049201
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR8758
Fetal bovine serumThermoFisher Scientific10438018
AntibodyBD Biosciences553140 (RRID:AB_394655)CD16/32 (clone 2.4G2)
AntibodyBD Biosciences555275 (RRID:AB_395699)CD3ε (clone 17A2)
AntibodyBiolegnd100734 (RRID:AB_2075238)CD8α (clone 53-6.7)
AntibodyBD Biosciences557655 (RRID:AB_396770)CD19 (clone 1D3)
AntibodyBD Biosciences557683 (RRID:AB_396793)CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
AntibodyBD Biosciences552878 (RRID:AB_394507)NK1.1 (clone PK136)
AntibodyeBioscience11-0041-85 (RRID:AB_464893)CD4 (clone GK1.5)
DAPI Roche102362760014,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry BD BiosciencesAria II or III 
Imaging chamberTomocube, Inc.TomoDish
HolotomographyTomocube, Inc.HT-1H
Holotomography imaging softwareTomocube, Inc.TomoStudio
Image professing softwareMathWorksMatlab R2017b

Referenzen

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