АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол, описанные здесь позволяет исследователям специально изменить аденовирусной capsids на отдельных участках путем простой химии. Экранированный аденовирус векторные частиц и перенацелены гена передачи векторов может быть создан, и вектор хост взаимодействия могут быть изучены.

Аннотация

Аденовирусы векторы являются мощным инструментов для генетических вакцинации и онколитического Виротерапии. Однако они склонны к несколько нежелательных вектор хост взаимодействия, особенно после доставки в естественных условиях . Это консенсус, что ограничения, накладываемые взаимодействия нежелательных вектор хост может только быть преодолены, если выполняются определенные модификации поверхности вектор. Эти изменения включают в себя защитные частиц от нежелательных взаимодействий и путем введения новых лигандов. Цель Протокола, представленные здесь является возможность читателю сформировать экранированные и, при желании, перенацеленных векторов передачи гена человека аденовируса или онколитического вирусов. Протокол позволит исследователям для изменения поверхности аденовирус вектор capsids путем конкретных химических вложения синтетических полимеров, углеводы, липиды, или других биологических или химических постановление. Она описывает передовые технологии комбинированных капсид генетических и химических модификаций, которые показали, чтобы облегчить понимание и преодоление барьеров для доставки в vivo аденовирус векторов. Приводится подробное и прокомментировал описание важнейших шагов для выполнения конкретных химических реакций с биологически активные вирусы или вирус производных векторов. Технологии, описанные в протокол основан на генетическое введение (естественно отсутствуют) цистеина остатков в подвергшихся воздействию растворителей петли аденовирусной производных векторов. Этих видов остатков цистеина обеспечивают конкретные химической активности, которые могут после производства векторов на высокие титры, быть использованы для весьма конкретных и эффективных ковалентной химической сцепления молекул из самые разнообразные вещества классов в вектор частицы. Важно отметить, что этот протокол может быть легко адаптирована выполнять широкий спектр различных (не тиоловых основе) химических модификаций аденовирус вектора capsids. Наконец это скорее всего что-оболочечных вирусов на основе гена векторов передачи отличных аденовирусы могут быть изменены на основе этого протокола.

Введение

Аденовирусов (Ad), члены семьи аденовирусы, являются не охватило ДНК вирусов, из которых более 70 типов до настоящего времени были определены (http://hadvwg.gmu.edu). В зависимости от свойства hemaglutination, структура генома и результаты секвенирования типы 70 объявлений можно разделить на семь видов (человека аденовирусов A-G)1,2. Геном человека Ad-38 kb в размер и инкапсулируется икосаэдра нуклеокапсидом3. Из-за их изобилия капсида белка hexon, Пентон базы и волокна все называются основных капсульных белков. Самые обильные и капсульных белков hexon формирует 20 капсид грани, каждая из которых состоит из 12 hexon homotrimers4,5. Пентон, расположенных на каждой грани икосаэдра (вершина), состоит из pentamers Пентон базы и представляет базу для вершины пика, построенный гликозилированного волокна тримеры5,6. Родной Ad ячейку записи в основном состоит из двух основных шагов. Во-первых ручку волокна связывается с основным рецепторами. В типы объявлений от видов A, C, E и F это Коксаки и аденовирус рецептор (автомобиль). Это взаимодействие приносит вирионов в spatial близости поверхности клетки, способствуя тем самым взаимодействие между сотовой интегринов и РГД мотив в Пентон базы и следовательно заставить клеточных реакций. Во-вторых изменения цитоскелета привести к интернализации вириона и транспорта endosome7. После частичной разборки в endosome вириона выпущен в цитоплазму und в конечном итоге путешествия к ядру для репликации.

Хотя объявление может быть доставлено локально (например., генетических вакцинации), системные поставки через кровь, необходимые для онко Виротерапии стоят несколько препятствий. Во время циркулирует в крови, вводят вирионы сталкиваются системы обороны хозяина иммунной системы, приводит к быстрой нейтрализации вируса основе векторов и рендеринга Ad основе векторов крайне неэффективно в системных приложений. Кроме того естественный hepatotropism Ad вмешивается Системные поставки и должны быть решены для перенаправления объявления своих новых клеток-мишеней.

Кодировке микрофлорой природных антитела IgM врожденной иммунной системы быстро узнают и связывают повторяющихся структур на поверхности вириона8,9. Эти иммунных комплексов затем активировать классических и неклассических пути системы комплемента, ведущих к быстро дополнение опосредованной нейтрализации большую часть вирионы8. Второй путь, что приводит к крупным удаления Ad вирионов опосредовано макрофаги10 и связанные с острой токсичных и гемодинамическими побочные эффекты11,12. В случае объявления в частности, Купфера клетки, проживающих в печени привязку и phagocytically занять Ad вирионы через рецепторы конкретных мусорщика, тем самым устраняя их от крови13,14,15 . Также были определены конкретные мусорщик рецепторов печени синусоидального эндотелиальных клеток (LSE)16, и LSE клетки, как представляется, также способствуют ликвидации вектор17, но в какой степени все еще нуждается в уточнении. Кроме того некоторые типы объявлений и их производных векторов эффективно изолированы в эритроцитах человека18 которой они связывают через автомобиль или дополнения рецепторов CR119. Следует отметить это секвестирующим механизм не могут быть изучены в системе модель мыши как контраст в эритроцитах человека, мыши эритроцитов не Экспресс автомобилей.

Специфические антитела анти объявлений, порожденных адаптивной иммунной системы после воздействия на ад, либо из-за предыдущей инфекции с Ad или после первых родов в системных приложений поднять еще препятствием для эффективного использования Ad векторов, и они должны быть уклонился в Системные эффективности.

Наконец сильный hepatotropism некоторые типы объявлений (включая Ad5) серьезно затрудняет применение Ad в системной терапии. Этот тропизма, что приводит к трансдукции гепатоцитов объясняется высоким сродством вириона Ad на фактор свертывания крови X (FX), опосредованного взаимодействия FX с21,20,Ad hexon белок22. FX мосты вириона для гепарина гликанов сульфат (HSPGs) на поверхности гепатоцитов20,23,24,25. Решающим фактором для этого взаимодействия, как представляется, быть конкретной степени N - и O-сульфатация HSPGs в клетки печени24, который отличается от HSPGs на других типах клеток. Помимо этого пути FX-опосредованной последние исследования показывают, дальнейшие пути пока не определены, в результате объявления трансдукции гепатоцитов26,27,28.

Недавно это было показано что FX участвует не только в гепатоцитов трансдукции Ad, но также путем привязки, вириона щиты частицы вируса против нейтрализации системы комплемента26. Сокращение трансдукции гепатоцитов, предотвращая FX привязки, таким образом, создаст нежелательный побочный эффект увеличения Ad нейтрализации через иммунной системы.

Глубокое знание сложных взаимодействий между векторами и принимающих организмов, поэтому необходимо разработать более эффективные векторов для системных приложений, которые обойти препятствия, введенные в организм хозяина.

Одна стратегия, которая первоначально использовалась для терапевтических белков был адаптирован для Ad векторов для по крайней мере частично преодолеть барьеры, описанных выше. Антигенностью и иммуногенности терапевтического белковых соединений может быть уменьшена Муфта полиэтилен гликоль (PEG)29,30. Следовательно ковалентных муфта полимеры, такие как привязка или поли [N-(2-гидроксипропил) methacrylamid] (pHPMA) к капсидному поверхности щиты вектор от нежелательных вектор хост взаимодействий. Обычно полимерные муфты цели ε-аминов группы остатков лизина стороне, которые распределяются случайным образом на поверхность капсида. Вектор частицы в растворе благодаря гидрофильной природы прилагаемый полимеров, окружены стабильного водной оболочки, что снижает риск признания иммунных клеток или энзимной деградации. Кроме того объявление Пегилированный векторов были продемонстрированы обойти нейтрализация анти hexon антител в пробирке и в предварительно иммунизированной мыши в vivo31. В отличие от изменения генетической капсида химические соединения полимеров выполняется после производства и очистки, что позволяет не только для использования обычных продюсер клеток и производство высокого титра вектор запасов, но и для синхронного модификация тысячи аминокислот на поверхность капсида. Однако Амин направленных экранирование происходит случайным образом на протяжении всего капсид поверхности, что приводит к высокой неоднородностей и не позволяя для изменения определенных capsomers. Кроме того постановление большой полимера, необходимых для благотворно влиять вирус отпорности32.

Чтобы преодолеть эти ограничения, Kreppel и др. 33 представил концепцию geneti химические для векторных ре - и ненацеливание. Генетически, которым были введены в вирус капсид воздействию растворителей позиции как волокна HI-петля33, белок IX34и35,hexon36. Хотя не встречающиеся, хвоща подшипник Ad векторов может производиться на высокие титры в клетках нормального производителя. Главное вставки которым в некоторых capsomers и в разных позициях в пределах одного capsomer позволяет для весьма конкретных модификаций тиоловых групп реактивной постановление. Для преодоления многочисленных препятствий в дизайн вектор объявление было показано этот geneti химический подход. Сочетание на основе Амин ПЭГилирование ненацеливание и на основе тиоловых муфта трансферрина на ручку волокна, которую HI-цикла было доказано, чтобы успешно переориентировать изменение Ad векторов для автомобилей недостаточным клетки33. Поскольку hexon участвует в самых нежелательных взаимодействий (нейтрализующих антител, фактор свертывания крови FX), на основе тиоловых изменения стратегии были также применяется к hexon. Сцепка небольшой КОЛЫШЕК постановление HVR5 hexon предотвратить объявление вектор частицы передают SKOV-3 клетки присутствии FX, тогда как большие PEG постановление увеличились гепатоцитов трансдукции14,35. Объявление вектор частицы, перевозящих мутации в ручку волокна, ингибирующих автомобилей привязки и HVR7 ингибирования привязки FX (и которым подшипник вставлен в HVR1 для позиции конкретного ПЭГилирование) были продемонстрированы уклониться от опосредованной антителами и дополнения нейтрализации, а также мусорщик рецептор опосредованный поглощения без потери инфекционности. Интересно, что несмотря на отсутствие естественных щит FX, ПЭГилирование снова улучшены трансдукции гепатоцитов как функция PEG размер36. Однако было показано, что ковалентной экранирование повлиять на внутриклеточные процессы торговли людьми. Prill и др. по сравнению необратимым против щитов bioresponsive на основе pHPMA и продемонстрировали, что ни режим экранирования, ни Кополимер заряда сказались на ввод в ячейку, но влияет на частицы людьми к ядру. Используя bioresponsive щит с положительно заряженные pHPMA сополимеры допускается для частиц людьми в ядро, поддержание высоких трансдукции эффективность объявлений векторы37 in vitro и in vivo.

Таким образом эти данные свидетельствуют о том, даже при условии, что все вектора хост взаимодействия были известны и считается, чрезмерное капсид поверхностных модификаций необходимо преодолеть препятствия, связанные с доставкой системные вектора.

Здесь мы предоставляем протокол для выполнения конкретных химических модификаций аденовирус вектор capsids для экранирования или переназначение аденовирус вектор частиц и вирусов на базе аденовирусной онколитического. Концепция этой технологии приводится на рисунке 1. Это позволяет, экранирование некоторых регионах капсид от нежелательных взаимодействий ковалентных вложения синтетических полимеров. В то же самое он также предоставляет средства для присоединения лигандов и объединить экранирование и ориентации. С помощью простых химии, экспериментаторов смогут ковалентно изменить аденовирус вектор поверхности с широкий спектр молекул включая пептиды/белки, углеводы, липиды и других малых молекул. Кроме того протокол предусматривает общую концепцию химической модификации биологически активных вирус производных векторов при поддержании их биологической целостности и деятельности.

протокол

Примечание: В следующих, протокол для geneti химических ПЭГилирование объявления вектор описан подробно. Чтобы включить конкретные муфт остаток PEG, вектор Ad5 был заранее генетически изменены путем введения остатков цистеина в hexon белка в гипервариабельных цикла 5, как описано в предыдущей публикации36и maleimide активированный PEG соединение используется как муфта соединения.

1. Подготовка буферов для очистки вектор CsCL шаг градиенты

  1. Подготовка 400 мл аденовирус (Ad-буферу), добавляя 50 мм HEPES (4.76 g/400 мл) и 150 мм NaCl (3.504 g/400 мл) для двойных дистиллированной воды (ddH2O). 350 мл этого буфера необходимо подготовить следующие три варианта Ad буфера.
    1. Вариант A: Отрегулируйте 150 мл до pH 7,6 с NaOH Ad-буфера.
    2. Вариант B: добавить конечная концентрация 10 мм TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0,143 g] 50 мл и настроить его на рН 7,2 с HCl.
    3. Вариант C: добавить конечная концентрация 0,5 мм TCEP (0,022 g) до 150 мл и настроить его на рН 7,2 с HCl.
    4. Подготовьте буферов в ddH2O и аналитических классов химических веществ. Использовать 100 мл каждого варианта А и варианта C подготовить CsCl буферов (см. шаги 1.2 и 1.3; 50 мл каждого) необходимые для градиентов шаг CsCl (см. шаги 3.2.6. и 3.2.18).
  2. Подготовка CsCl шаг градиента буфера (ρCsCl = 1.41 г/см3) в Ad буфер
    Примечание: Этот буфер необходимо будет в двух различных вариантах:
    1. Взвесьте два аликвоты точно 27.42 g CsCl в 50 мл трубки.
    2. ΡCsCl = буфер 1.41/TCEP: разрешить CsCl в 40 мл вариант C Ad буфера.
    3. ΡCsCl = буфер 1.41: разрешить CsCl в 40 мл варианта А Ad буфера.
    4. Проверьте и при необходимости скорректируйте pH с HCl. заполнить до ровно 50 мл с соответствующим вариантом Ad буфера. Для достижения наилучших результатов разделения, важны точные CsCl концентрации и рН.
    5. Проверьте плотность (CsCl содержание), весом 1 мл (1.41 g) каждого градиента буфера.
  3. Подготовка CsCl шаг градиента буфера (ρCsCl = 1,27 г/см3) в Ad буфер
    Примечание: Этот буфер необходим в двух различных вариантах:
    1. Взвесьте два аликвоты точно 18,46 g CsCl в 50 мл трубки.
    2. ΡCsCl = буфер 1.27/TCEP: разрешить CsCl в 40 мл вариант C Ad буфера.
    3. ΡCsCl = 1,27 буфера: разрешить CsCl в 40 мл варианта А Ad буфера.
    4. Проверьте и при необходимости скорректировать рН с HCl. Наконец заполнить до ровно 50 мл с соответствующим вариантом Ad буфера. Для достижения наилучших результатов разделения, важны точные CsCl концентрации и рН.
    5. Проверьте плотность (CsCl содержание), весом 1 мл (1,27 г) каждого градиента буфера.
  4. Простерилизуйте все буферы (Ad буферов и CsCl шаг градиента буферы) путем фильтрации (используя размер пор сетки 0,45 мкм) в стерильные бутылки.
  5. После стерилизации, для предотвращения окисления TCEP, насытить и наложение буферы, содержащие TCEP с аргоном, барботирование буферы с аргоном для около 30 s. Позаботьтесь, чтобы использовать только стерильные устройства (например., стерильные Пипетка советы) при применении газ аргон и использования бутылки достаточно большой, чтобы позволить аргон жире.
    Примечание: Все буферы должны быть готовы свежие и защищенном от света и может храниться при температуре 4 ° C на несколько дней (особенно CsCl шаг градиента буферов, которые должны храниться только на несколько дней).

2. муфта постановление: Хранение и приготовление

Примечание: Moeities, используемый для соединения с которым нужно нести реагирующие тиоловых групп. Maleimide активированный соединений будет формируют стабильные тиоэфиры облигации с которым генетически введено. Кроме того, орто pyridyldisulfide (OPSS)-может использоваться активированных соединений, которые образуют bioresponsive дисульфидных мостов между вектор частицы и муфта группу. Лиофилизированные malPEG-750, а также большинство других реагентов сцепного устройства чувствительны к гидролизу и должны храниться в сухих в виде лиофилизированные порошки-80 ° c.

  1. Чтобы предотвратить накопление конденсата воды после оттаивания флаконов, хранить флаконов в больших труб (например., 50 мл трубки) заполнены с подушкой силикагель бусины. Храните эти трубы в адекватной больших контейнере также заполнены с подушка шарик силикагель.
  2. Прежде чем плотно закрыть каждой трубки и контейнера, Обмен воздуха с газом Аргон. Это может быть достигнуто путем размещения открытые трубы и контейнеров в эксикатор, следуют снятие и замена воздуха с газом Аргон. Так как газ аргон тяжелее воздуха, трубы и контейнеры заполняются с аргоном и теперь могут быть помещены в друг друга, с каждой плотно закрытой крышкой.
  3. Хранение контейнеров на-80 ° C.
  4. При оттаивании, место контейнеров на кремний бусины в эксикаторе и медленно согреть их до комнатной температуры, затем откройте контейнер.
  5. При выполнении муфта реакции, свежезаваренным решить количество муфты субстрата, необходимых в соответствующим растворителем. Старайтесь не добавлять больше чем 10% сцепления решение окончательное соединение реакции, особенно если ДМФ или ДМСО, используется в качестве растворителя для сцепления субстрата.

3. усиление, очистка и химической модификации Ad векторов:

  1. Усиление Ad векторов
    Примечание: Следующие шаги должны выполняться с помощью кабинет безопасности согласно правилам местные биологической безопасности.
    1. Transfect репликации несовершенным ∆E1 Ad вектор содержащие генетически введено хвоща residue(s) один (или несколько) в 293 ГЭС клетки, как описано в Kratzer и Kreppel-38.
    2. Согласно протокола38усиливают вектор путем последовательного реинфекций до окончательного препаративные инфекции 15-20 большой (15 см) клетки культуры пластин (примерно 1-2 x 107 клеток/плита).
      Примечание: Оптимально, последний реинфекции следует быть приурочен, так что клетки показывают полный цитопатического эффекта (CPE) в первой половине дня очистка и изменения производительности (см. Рисунок 2).
    3. После этапа окончательного амплификации высокомобильна в буфер Ad + 10 мм TCEP (вариант B) клетки могут быть заморожены при температуре-80 ° C; Однако для оптимальной урожайности векторных частиц, рекомендуется немедленно последующей деятельности клеток лизис и вектор очищения и модификации.
  2. Очистка и химической модификации Ad векторов
    Примечание: Очистки векторов выполняется согласно протоколу очистки аденовирус, описанные в38но в безокислительной условиях. Клетки для сбора урожая и lysis, а также очистки и химической модификации векторных может выполняться в течение одного дня. Урожай и лизировать инфицированных клеток согласно Протоколу описанные ранее38.
    1. Соберите клетки путем соскабливания пластины и передачи супернатант центрифугирования трубы 200-500 мл.
    2. Вращайте клетки решение для 10 мин на 400 x g.
    3. Ресуспензируйте Пелле клеток в 4 мл Ad-буфера + 10 мм TCEP (рН 7,2) (вариант B) и передачи в стерильных 50 мл трубки. Если ячейка урожай является низким или индуцированного только слабые CPE, Ресуспензируйте в 2 мл.
    4. Спасение вектор 3 циклов замораживания (в жидком азоте) и оттаивания (в ванну воды 37 ° C).
    5. Спина за 10 мин на 5000 x g при 4 ° C.
    6. Время центрифугирования, подготовьте два равных CsCl шаг градиента:
      1. Во-первых, как нижний участок добавьте 3 мл 1.41 г/см3 ρCsCl в Ad буфера + 0,5 мм TCEP (pH 7.2, вариант C) в ультрацентрифуга трубы. Марк уровень ниже фазы на трубе перед загрузкой Верхний этап.
      2. Тщательно стек Верхний этап 5 мл 1,27 г/см3 ρCsCl в Ad буфера + 0,5 мм TCEP (pH 7.2, вариант C), очень медленно закупорить 5 миллилитров вдоль стен трубу на нижней фазе.
        Примечание: Начиная с во время соединения высокая концентрация TCEP может реагировать с остатками maleimide malPEG-750 и привести к уменьшение сцепления эффективности, очистки, CsCl шаг градиента необходимо уже выполнить под снижение концентрации TCEP.
    7. Загрузить супернатант на градиент CsCl [либо одинаково разделить супернатант на обоих градиенты или, в случае низкой вектор доходность (см. выше), загрузить супернатант на только один столбец,] и заполнить оба градиенты одинаково к вершине с Ad буфера + 10 мм TCEP (рН 7 .2, вариант B).
    8. Отрегулируйте вес противоположной труб до 0.0 g вес разница.
    9. Ультрацентрифуги втечение 2 ч при 176 000 x g при 4 ° C.
    10. С зажимом исправьте ultracentrifugation трубки на стенд, оставляя район вокруг нижнего уровня Марк фазы доступны. Место изогнутая лампа над трубки. Вокруг знака, на границе между нижней и верхней фазами различные группы (вектор вирионы) должно быть видимым (Рисунок 3А-3 C).
    11. Собирайте векторы, проколов трубки с иглой и стремящихся полосе вектор в шприц. Передавать собранные вектор вирионов 15 мл.
      Примечание: Слабее полосы выше Ad вектор группы содержат неполные вектор частицы и следует избегать для аспирации. Клетки мусора и Зеленый флуоресцентный белок (EGFP) выражая EGFP Ad-векторов будет собирать в верхней части ультрацентрифуга трубки (см. рис. 3а и 3Б). Этот и следующие шаги до муфты (шаг 3.2.16) должны выполняться быстро, как векторы в настоящее время целесообразно дисульфидных связей из-за низкой концентрации TCEP.
    12. Чтобы вычислить количество субстрата сцепного устройства, необходимые для эффективного завершения привязки субстрата для всех остатков цистеина в подготовке вектор, измерьте ОД260:
      1. Согласно протоколу, характеризуется Kratzer и Kreppel38, вихревой смесь 10 мкл вирионов собранных вектор, 89 мкл буфера Ad и 1 мкл 10% SDS. Как пустой зонд, вихревой 99 мкл Ad-буфера и 1 мкл 10% SDS.
      2. Чтобы денатурировать вирионы, Инкубируйте на 56 ° C в течение 10 мин.
      3. Определите ОД260.
      4. Рассчитать физического векторного титр за мкл, используя следующее уравнение: OD260 x коэффициент разбавления x коэффициент определяется эмпирически вымирания Ad (1,1 х 109 вектор частицы = 1260 OD блока/мкл). Таким образом, измеренной ОД260 1,36 вектора разводят 1:10, будет вычислить: 1.36 x 10 x 1.1 x 109 = 1,5 x 1010 вектор частицы/мкл.
        Примечание: Этот титр является только грубой оценки; Однако это достаточно точной для стехиометрических расчетов, изложенные ниже.
    13. В зависимости от белка, изменения путем введения цистеина, определить количество субстрата муфта (в граммах) для эффективного сцепления реакции, с помощью следующего общего уравнения: титр вируса x размер x количество которым x превышение остаток x Молекулярный вес остаток / 6,022 x 1023 = граммов муфты субстрата.
      Примечание: В этом уравнении: титр 1) вирус титр/мкл, определяется ОД260 , как описано выше, счета 2) тома для тома в мкл стремились вектора, используемых в реакции соединения, 3 количество которым является количество белков, в которую хвоща остаток был введен в вектор частицы, 4) избыток остаток является фактором остаток избыток необходимых для эффективного сцепления реакции (50 x) и 5) молекулярный вес части молекулы должны быть введены как Da (не кДа).
    14. Свеже решить количество соединения (или возможно сумма) необходимы соответствующие растворителя.
      Примечание: Как количество муфта субстрата необходимых низкий и трудно весить но дорого, весят минимальное количество составных возможно и растворить его в соответствующей концентрации для сцепления реакции приложения.
    15. Вектор решения передать трубку подходящего размера (например, 2-мл пробирку) и добавьте вычисляемый объем муфты составные Стоковый раствор в вектор.
    16. Аккуратно перемешать решение вращением накладных за 1 ч при комнатной температуре.
    17. Заполните вверх вектор решения общий объем 6 мл с Ad буфера (pH 7,6, вариант A).
      Примечание: Этот шаг должны быть выполнены, прежде чем решение применяется к градиенту шаг для обеспечения что вектор решения, которое по-прежнему содержит CsCl от первого шага градиента, имеет плотность ниже 1,27 г/мл.
    18. В качестве второго шага чередования CsCl очищают вектор от непрореагировавшего муфта остаток:
      1. Подготовить два равных CsCl шаг градиенты, выполнив следующие шаги для каждого: 1) Нижняя фаза: 3 мл 1.41 г/см3 ρCsCl в Ad буфере (рН 7,6, вариант A), 2) Марк уровня нижней фазы на трубе перед загрузкой Верхний этап и 3) Верхний этап : 5 мл 1,27 г/см3 ρCsCl в Ad буфере (рН 7,6, вариант A).
        Примечание: После того, как соединение имело место, без TCEP используются буферы, как не бесплатно тиоловых групп теперь должны присутствовать на вектор capsids.
      2. Загрузить супернатант на CsCl градиента и заполнить оба градиенты одинаково к вершине с Ad буфера (pH 7,6, вариант A).
      3. Отрегулируйте вес противоположной труб к 0.0 g вес разница.
    19. Ультрацентрифуги втечение 2 ч при 176 000 x g при 4 ° C.
    20. Незадолго до конца ultracentrifugation сбалансировать адаптер PD-10 колонка 5 раз с 5 мл Ad-буфера (pH 7,6, вариант A).
    21. Как это сделано в шаге 3.2.10, исправьте ultracentrifugation трубки стоять, оставляя район вокруг нижнего уровня Марк фазы доступны. Место изогнутая лампа над трубки. Опять же вокруг границы между фазами нижней и верхней, различные группы (вектор вирионы) должно быть видно (рис. 3 c).
    22. Собирать векторы, проколов трубки с иглой и стремящихся полосе вектор в шприц и передачи вектор 15 мл. Позаботьтесь, чтобы собирать вирионы обеих градиента трубы вместе как суммарный объем 2,5 мл или меньше. Если меньший объем собранных, заполните для получения суммарный объем 2,5 мл с Ad буфера (вариант A).
    23. Загрузите по 2,5 мл на уравновешенной PD-столбец. Отказаться от потока через.
    24. Добавить 3 мл буфера (вариант A) Ad на столбец и собирать потока через (содержащие вирионы очищенный вектор).
    25. Добавьте глицерин (333 мкл) для получения окончательного 10% концентрации и разделить на аликвоты подходящим (например, 400 мкл каждого) и включают Алиготе 20 мкл для определения титра ОД260 измерения.
    26. Хранят раствор вектор-80 ° c.
    27. Определите титр вектора путем измерения ОД260 20 мкл вектор решения, 79 мкл Ad буфера (вариант А), и 1 мкл 10% SDS, как описано в шаге 3.2.12. Как пустое значение используйте 79 мкл Ad буфера (вариант А), 10 мкл 10% глицерина и 1 мкл 10% SDS.
    28. Вычисление вектора титр как: OD260 x коэффициент разбавления x 1.1 x 109 вектор частицы/мкл.
      Как подготовлены на шаге 3.2.27, рассчитать: OD260 x 5 x 1.1 x 109 вектор частицы/мкл

4. Проверка сцепления на SDS-страницы:

Примечание: Если соединений с достаточно высокой молекулярной массой, используются для сцепления для Ad вирионы, муфта может быть проверен электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE). Успешное соединение затем должно привести к переход группы белков, соответствующее изменение Ad вириона белка, по сравнению с белка в неизмененном вириона Ad (см. Рисунок 4).

  1. По словам вычисляемый титр вектора (шаг 3.2.28) отдельные 1-2 x 1010 вектор частицы, SDS-PAGE (8%).
  2. Разработка гель путем пятнать Серебряного гель39 обнаружить даже слабые белковых групп:
    1. Подготовьте буферов для Серебряный пятнать (в скобках указаны суммы, необходимые для 100 мл буфера):
      1. Подготовка буфера 1 путем смешивания 38 мл ddH2O, 50% метанола (50 мл метанола 100), 12% AcOH (12 мл 100% AcOH) и 0.0185% HCHO (50 мкл 37% HCHO).
      2. Подготовка буфера 2, добавляя 50% EtOH (50 мл на 100% EtOH) до 50 мл ddH2O.
      3. Подготовить буфер 3, добавив 0,127 г/Л Na2S2O3 (12.744 мг) до 100 мл ddH2O.
      4. Подготовка буфера 4, добавив 2 г/Л AgNO3 (0,2 г) и 0.0185% HCHO (50 мкл 37% HCHO) 100 мл ddH2O.
      5. Подготовка буфера 5, добавляя 60 г/Л Na2CO3 (6 г), 0.0185% HCHO (50 мкл 37% HCHO) и 2,5 мг/Л Na2S2O3 (0.256 мг) до ddH2O получить окончательный объем 100 мл.
      6. Подготовка буфера 6 путем смешивания 38 мл ddH2O, 50% метанола (50 мл на 100% метанола) и 12% AcOH (12 мл 100% AcOH).
      7. Подготовка буфера 7 путем смешивания 60 мл ddH2O, 30% метанола (30 мл 100% метанола) и 10% глицерина (10 мл 100% глицерина).
      8. Подготовка буфера 8 путем смешивания 10% глицерина (10 мл 100% глицерина) с 90 мл ddH2O.
  3. Выполнение Серебряный пятнать
    1. Исправьте гель в буфере 1 за 30 минут.
    2. Промойте гель в буфере 2 за 15 мин.
    3. Предварительной обработки гель в буфере 3 за 1 мин.
    4. Промойте гель 3 раза в ddH2O 20 s.
    5. Пропитать гель в буфере 4 по 20 мин.
    6. Промойте гель 2 раза в ddH2O 20 s.
    7. Разработка гель в буфере 5 пока не видны полосы (10 s до 10 минут).
    8. Промойте гель 2 раза ddH2O 2 мин.
    9. Остановите развитие в буфере 6 на 5 мин.
    10. Сохранению гель в буфере 7 за 20 мин.
    11. Храните гель в буфере 8.
      Примечание: Муфты эффективность может определяться денситометрических количественной оценки модифицированных и unmodified полос целевой capsomere.

Результаты

Рисунок 2 показывает примеры цитопатического эффекта (CPE) на 293 (ГЭС 293) клетки, которые указывает успешное вектор производства. Клетки должны показать морфологии (рис. 2 c) 40-48 часов после прививки с вектором вирус. Правый timepoint для уборки им...

Обсуждение

Эффективность, в которой генетически введено которым можно изменять химически обычно составляет 80-99%, и определенные переменные влияют на эту эффективность. Во-первых важно, что генетически введено которым не проходят преждевременной окисления. Будучи хорошо защищен в условиях снижен...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Vector purification and chemical modification
Argon gasAir liquidelocal gas dealer
Liquid NitrogenAir liquidelocal gas dealer
500 mL centrifuge tubesCorning431123
Stericup Express Plus 0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)Sigma-AldrichC4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes)Henke Sass Wolf4020.000V0
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm)Henke Sass Wolf4710009040
Caesium chloride 99.999% Ultra QualityRoth8627.1
Silica gel beadsApplichemA4569.2500
Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750)Iris Biotechstore in silica gel beads at -80 °C
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge TubesBeckman Coulter344059only open in hood
PD-10 size exclusion chromatography columnGE Healthcare17-0851-01store at 4 °C
HepesAppliChemA1069.1000
SDS UltrapureAppliChemA1112,0500
GlycerolAppliChemA1123.1000
NameCompanyCatalog NumberComments
Material for cell-culture
DPBSPAN BiotechP04-36500
DMEMPAN BiotechP04-03590
Trypsin/EDTAPAN BiotechP10-0231SP
FBS GoodPAN BiotechP40-37500
Penicillin/StreptomycinPAN BiotechP06-07100
Biosphere Filter Tips (various sizes)Sarstedt
Serological Pipettes (various sizes)Sarstedt
reaction tubes (various sizes)Sarstedt
TC plates 15cmSarstedt83.3903
NameCompanyCatalog NumberComments
Material for silver staining protocol
MethanolJ.T.Baker8045
Ethanol absoluteAppliChem1613,2500PE
Acetic AcidAppliChemA0820,2500PE
Formaldehyde 37%AppliChemA0877,0250
Ethanol absoluteAppliChemA1613,2500PE
Sodium thiosulfateAppliChem1,418,791,210
Silver nitrateAppliChemA3944.0025
Sodium carbonateAppliChemA3900,0500
NameCompanyCatalog NumberComments
Special Lab Equipment
DesiccatorNalgene5311-0250
Megafuge 40Heraeus
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubesHeraeus
Water bathConventional
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80Beckman Coulter
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41Beckman Coulter
pH -MeterConventional
Stand with clampsConventional
Goose neck lampConventional
Over-head rotorConventional
Thermal BlockConventional
Photometer (OD 260)Conventional

Ссылки

  1. Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
  2. Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
  3. Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, 570-573 (1953).
  4. van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
  5. Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
  6. Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
  7. Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
  8. Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
  9. Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
  10. Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
  11. Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
  12. Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
  13. Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
  14. Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
  15. Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
  16. Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
  17. Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
  18. Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
  19. Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
  20. Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
  21. Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
  22. Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
  23. Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
  24. Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
  25. Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
  26. Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
  27. Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
  28. Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
  29. Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
  30. Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
  31. O'Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
  32. Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
  33. Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
  34. Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).
  35. Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
  36. Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
  37. Prill, J. -. M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
  38. Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. , 377-388 (2017).
  39. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140oncolysisgeneti

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены