Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse

Resumo

Aqui nós apresentamos um método para isolar as glândulas adrenal de ratos, corrigir os tecidos, seção-los e executar a mancha da imunofluorescência.

Resumo

Imunofluorescência é uma técnica bem estabelecida para a detecção de antígenos nos tecidos com o emprego de anticorpos conjugados a fluorocromo e tem um amplo espectro de aplicações. Deteção de antígenos permite a caracterização e identificação de vários tipos de células. Situada acima dos rins e encapsulado por uma camada de células mesenquimais, a glândula adrenal é um órgão endócrino, composto por dois tecidos diferentes, com diferentes origens embriológicos, o córtex exterior derivados mesoderme intermediário mesonéfricos e o neural crista-derivado de medula interna. O córtex adrenal secreta esteroides (ou seja, mineralocorticoides, glicocorticoides, hormônios sexuais), enquanto a medula adrenal produz catecolaminas (i.e., adrenalina, noradrenalina). Durante a realização de pesquisa de adrenal, é importante ser capaz de distinguir células únicas com funções diferentes. Aqui nós fornecemos um protocolo desenvolvido em nosso laboratório que descreve uma série de etapas sequenciais, necessários para a obtenção de mancha da imunofluorescência para caracterizar os tipos de células da glândula adrenal. Nós focamos primeiro a dissecação das glândulas supra-renais do mouse, a remoção microscópica de gordura periadrenal, seguida da fixação, processamento e incorporação de parafina do tecido. Descrevemos em seguida com um micrótomo rotativo de corte dos blocos de tecido. Por último, detalhamos um protocolo para coloração imunofluorescente de glândulas supra-renais que temos desenvolvido para minimizar tanto a ligação de anticorpos inespecíficos e autofluorescência para alcançar uma óptima do sinal.

Introdução

Imuno-histoquímica é uma técnica para a detecção de componentes de tecido com o uso de anticorpos contra moléculas celulares específicas e técnicas de coloração subsequentes para detectar os anticorpos conjugados¹. Este procedimento de imuno-histoquímica requer fixação específica e processamento de tecidos que são frequentemente empiricamente determinados para o antígeno específico, tecido e anticorpo utilizaram². A fixação é crucial para preservar o estado "original" de tecido e, mantendo intacta celular e subcellular estruturas e padrões de expressão. Mais processamento e incorporação de procedimentos são necessários para preparar o tecido para corte em fatias finas que são usadas para estudos histológicos, envolvendo a imuno-histoquímica.

Immunostaining pode ser executada com deteção fluorescente ou cromogênica. A detecção cromogênica exige a utilização de uma enzima para converter um substrato solúvel em um produto colorido insolúvel. Enquanto esta enzima pode ser conjugada com o anticorpo reconhecer o antígeno (anticorpo primário), é mais frequentemente conjugado ao anticorpo reconhecendo o anticorpo primário (ou seja, o anticorpo secundário). Esta técnica é altamente sensível; o produto colorido resultante da reação enzimática é fotoestável e requer apenas um microscópio brightfield para a imagem latente. No entanto, cromogênico immunostaining pode não ser adequado ao tentar visualizar duas proteínas que co localizar, uma vez que a deposição de uma cor pode mascarar a deposição do outro. No caso de co coloração, imunofluorescência tem provado para ser mais vantajoso. O advento da imunofluorescência é atribuído a Albert Coons e colegas, que desenvolveram um sistema para identificar o tecido antígenos com anticorpos marcados com fluoresceína e visualizá-las nos tecidos sob luz ultravioleta³seccionados. Detecção de fluorescência é baseado em um anticorpo conjugado com um fluoróforo que emite luz após a excitação. Porque existem vários fluorophores com emissões em diferentes comprimentos de onda (com pouca ou nenhuma sobreposição), esse método de deteção é ideal para os estudos de várias proteínas.

A glândula adrenal é um órgão emparelhado localizada acima do rim e caracterizado por dois componentes distintos embryologically rodeadas por uma cápsula mesenquimal. O córtex adrenal exterior, derivado da mesoderma intermediária mesonéfricos, segrega hormonas esteroides, enquanto a medula interna, derivada da crista neural, produz catecolaminas, incluindo adrenalina, noradrenalina e dopamina. O córtex adrenal é histologicamente e funcionalmente dividido em três zonas concêntricas, com cada zona secretoras de classes diferentes de hormônios esteroides: o exterior zona glomerulosa (zG) produz mineralocorticoides que regulam a homeostase do eletrólito e volume intravascular; a médio zona fasciculada (zF), diretamente abaixo do zG, segrega glicocorticoides que medeiam a resposta ao estresse através da mobilização das lojas da energia para aumentar a glicose do plasma; e o interior zona reticular (zR), que sintetiza sexo precursores esteroides (ou seja, Dehidroepiandrosterona (DHEAS))⁴.

Alguma variação no zoneamento adrenocortical está presente entre as espécies: por exemplo, Mus musculus carece da zR. A única zona X pós-natal de M. musculus é um remanescente do córtex fetal, caracterizado por pequenas células de lipídios-pobres com acidofílicas cytoplasms⁵. A X-zone desaparece na puberdade em ratos do sexo masculinos e após a primeira gravidez em ratos fêmeas, ou gradualmente degenera em fêmeas de raça não^6,7. Além disso, a tortuosidade e a espessura das exposições zG marcada variação entre espécies como organização de células tronco e progenitoras periféricas em e adjacente para o zG. O rato, ao contrário de outros roedores, tem uma zona de indiferenciadas visível (zU) entre o zG e zF que funciona como uma zona de células-tronco e/ou uma zona de transiente amplificando progenitores. Se o zU é exclusivo para ratos, ou simplesmente uma forma mais organizada com destaque aglomerado de células é desconhecido^8,9.

Células do córtex adrenal contêm gotículas lipídicas que armazenam os ésteres de colesterol que servem como o precursor de todos os hormônios esteroides^10,11.  O termo "esteroidogênese" define o processo de produção de hormônios esteroides de colesterol através de uma série de reações enzimáticas que envolvem a atividade esteroidogênica fator 1 (SF1), cuja expressão é um marcador de potencial esteroidogênica. Na glândula adrenal, Sf1 expressão está presente apenas em células do córtex¹². Um interessante estudo encontrou a expressão de biotina endógena adrenocortical células com potencial esteroidogênica¹³. Enquanto esta pode ser a causa da maior experiência em biotina/estreptavidina-com base em métodos de coloração, devido a detecção de biotina endógena pelo anticorpo conjugado com estreptavidina, esta característica pode ser também empregada para distinguir o esteroidogênica células de outras populações dentro da glândula adrenal, ou seja, endoteliais, capsular e células da medula.

Inervados pelo simpáticos neurônios preganglionic, a medula adrenal é caracterizada por basophilic células com uma citoplasma granular contendo epinefrina e norepinefrina. Células da medula são denominadas "cromafim" devido ao alto teor de catecolaminas que formam um pigmento marrom após oxidação¹⁴. Tirosina Hidroxilase (TH) é a enzima que catalisa a etapa limitante na síntese de catecolaminas e, na glândula adrenal, é expressa apenas na medula¹⁵.

Aqui nós apresentamos um protocolo para a isolação do rato as glândulas supra-renais, seu processamento para incorporação em parafina e corte e um método para realizar a mancha na adrenais seções a fim de identificar os tipos celulares que constituem o córtex adrenal e medula. Este protocolo é um padrão em nosso laboratório de imunocoloração com múltiplos anticorpos usados rotineiramente em nossa pesquisa.

Protocolo

Todos os métodos foram realizados em conformidade com protocolos institucionalmente aprovados sob o auspício da Comissão Universidade do uso e cuidar dos animais da Universidade de Michigan.

1. preparação para a cirurgia

1. No dia antes da cirurgia, preparar paraformaldeído 4% (PFA) / tampão fosfato salino (PBS). No caso de alíquotas congeladas, prossiga para descongelar um e armazenar a 4 ° C.
   Nota: 4% PFA não é estável por mais de 48 h.
   Cuidado: PFA é tóxico, evitar contato com pele e olhos e descarte em um recipiente apropriado.
2. No dia da cirurgia, preparar os instrumentos cirúrgicos por esterilizar a tesoura e pinça com 70% de etanol (EtOH) e deixe-os secar sobre uma toalha de papel.
3. Lugar cheio de uma placa de 24 com PBS 1x (1 mL/poço é suficiente) em um balde de gelo.
   Nota: As glândulas supra-renais serão mantidas neste prato de cultura multi bem após a cirurgia.

2. adrenal dissecação

1. Eutanásia o mouse seguindo protocolos padrão aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC). Um método secundário de eutanásia para garantir a morte (por exemplo, decapitação) é necessário.
   1. Para eutanásia por overdose de isoflurano, coloque o mouse em uma câmara cheia de isoflurano vapores até que cesse a respiração e, em seguida, remover o mouse da câmara, coloque-o sobre uma superfície e realizar deslocamento cervical.
      Nota: a maioria dos métodos de eutanásia causar desconforto ao animal e não são adequados para estudos de stress, porque eles podem adicionar a variável de confundimento da ativação do eixo hipófise-adrenal e liberação de catecolaminas medulares. Nesta instância, decapitação é a técnica sugerida para adotar.
2. Coloque o mouse em decúbito dorsal, esterilizar a área de incisão no abdômen e flancos com 70% EtOH.
   Nota: Enquanto raspar o pelo irá aumentar a esterilidade, para esta aplicação específica não é necessário.
3. Cortar a pele no meio do abdômen, usando uma tesoura, separar a pele do peritônio, mesa o mouse por beliscar a pele em volta do corte e puxando-o em duas direções opostas (caudal e rostral). Em seguida, corte o peritônio até atingir os flancos direito e esquerdos posteriores.
4. Remover o corte de murino glândula adrenal em torno do tecido adiposo circundante e colocá-lo na placa 24-multiwell repleto de 1X PBS e mantidos no gelo.

3. remoção de gordura Peri-adrenal

1. Sob um microscópio de dissecação, coloque a adrenal em um vidro base ou um prato de Petri na placa de palco, posicione a fonte de luz, selecione a ampliação e ajustar o foco para obter uma visão clara da adrenal todo.
   Nota: A ampliação usada pode variar dependendo das preferências pessoais. Uma ampliação total de 30 X com uma lente plano 1 X, zoom 3x, e ocular 10x permite para visualizar a glândula inteira com um bom campo de visão.
2. Remova rapidamente o adiposo adjacente com duas agulhas de 25 G, evitando a desidratação da adrenal. Se isso acontecer, antes de toda a gordura é removida, mover a adrenal volta dentro do poço contendo 1X PBS por 1 – 2 min e depois continuar com o processo de remoção de gordura.
3. Lave 2x por 2 min cada em 1X PBS.

4. tecido processamento e incorporação

1. Corrigir os tecidos em 4% PFA/PBS a 4 ° C em uma plataforma oscilante para 2h.
2. Remova os 4% PFA e lave os tecidos com PBS 1x, 3x por 15 min a 4 ° C.
   Cuidado: PFA é tóxico e é um resíduos perigosos; deve ser manuseado com cuidado, sob uma capa de química e descartado em um recipiente de resíduos perigosos.
3. Incubar as supra-renais em 50% EtOH a 4 ° C em uma plataforma oscilante para 2h.
4. Incubar as supra-renais em 70% EtOH a 4 ° C em uma plataforma oscilante para um mínimo de 2 h.
   Nota: Se não prosseguir com o tecido para a incorporação de processamento, as glândulas supra-renais podem ser armazenadas em 70% EtOH a 4 ° C. Evitando o armazenamento a longo prazo em 70% EtOH e prosseguir para tecido logo que possível processamento produz amostras de melhor qualidade.
5. Prepare a adrenal para processamento por envolvê-lo em gaze e delimitador-lo em um tecido incorporação fita de tecido. Coloque a fita em um frasco enchido com 70% EtOH e loja a 4 ° C até que esteja pronto para passar para o processador de tecido. Insira a fita para o processador de tecido programado conforme relatado na tabela 1 e executar o programa.
6. Transferir a fita em uma estação de encastre cheia de parafina derretida a 65 ° C. Se não houver uma estação de resfriamento, coloque uma bandeja de refrigeração fria ao lado dele.
7. Rotular um molde de encastre e abra o tecido incorporação de gaveta. Usando um par de pinças, Desembrulhe a gaze e coloque as supra-renais suavemente na posição desejada no centro da base no molde incorporação. Despeje a parafina derretida sobre as supra-renais. Se necessário, segure a adrenal com fórceps para assegurar sua posição no molde caso contrário ele pode se mover dentro do molde.
8. Suavemente move o molde de encastre a bandeja de arrefecimento e esperar até o endurecimento da parafina. Depois disso, para facilitar o corte, armazene encastre moldes em lugar fresco.

5. corte com um micrótomo rotativo

1. Verifique se o micrótomo está limpo antes de começar, afastar todos os resíduos descartados parafina, certifique-se de que a faca (ou lâmina) é afiada, o mecanismo interno de óleo e retrai completamente o titular do bloco, se necessário.
2. Rotular uma série de corrediças do microscópio (positivamente carregada ou revestidas para evitar a perda de tecido (ver Tabela de materiais)), coloque-os em um conjunto de slides aquecedor a 37 ° C e distribuir água ultrapura autoclavado tipo 1 no topo de cada slide.
3. Definir a espessura de corte em 5 µm.
4. Insira a lâmina de micrótomo em porta-lâmina, controlar o ângulo da lâmina, certifique-se de que a lâmina está firmemente preso no suporte e verific o afastamento do bloco de parafina e titular do bloco.
5. Trazer o titular do bloco até sua posição mais alta e, se possível, tranque o manípulo operacional, remover o bloco de parafina do molde e coloque-o no suporte do bloco, prendendo-o firmemente com o grampo. O ângulo da linha de centro da lâmina com a superfície de revestimento do bloco deve ser cerca de 20°. Se necessário, reajuste o bloco de parafina.
   Atenção: A lâmina é afiada.
6. Se anteriormente bloqueado, destravar a roda de mão e baixe o bloco de parafina até que seu rosto está nivelado com a borda da lâmina do micrótomo. Gire a roda de mão com um ritmo constante. Execute o corte inicial para remover a parafina e expor as supra-renais.
7. Continue girando a roda de mão e a seção até o fim das supra-renais. Use um microscópio brightfield ou dissecação para verificar a presença de tecido nas seções. Retire a fita da lâmina e com a ajuda de outro par de pinças, coloque-o sobre a água, colocada sobre a lâmina de vidro. Pode ser útil colocar a fita sobre uma superfície, esticá-lo cuidadosamente e então montá-lo no slide.
8. Seque os slides sobre a chapa. Em seguida, coloque-as sobre uma bandeja de slide e asse a 37 ° C durante a noite ou mais se a água ainda está presente. Depois de seco, armazene os slides em uma caixa de slides à temperatura ambiente.
9. Guarde todos os equipamentos usados e limpar o micrótomo.

6. imunofluorescência

1. Selecione os slides para imunocoloração e colocá-los em um suporte de slide.
2. Em uma chapa quente, traga um copo cheio de 0,01 M citrato em pH 2,0 para ferver. O volume da reserva depende do tamanho do copo e deve ser suficiente para cobrir as seções sobre os slides durante a ebulição (alguns evaporação precisa ser levado em conta). Cubra o copo com folha de alumínio.
   Nota: Outros métodos para recuperação do antígeno estão disponíveis (ver discussão).
3. Deparaffinize os slides em xilol 100% 2 x por 5 min cada. Hidratar os slides usando a seguinte série: 100% EtOH 2 x por 5 min, 70% EtOH 2 x por 5 min, digite 1 água ultrapura por 5 min.
   Nota: Após a deparaffinization, é importante não deixar as seções secar: cortes histologicos sempre devem ser cobertos com buffers ou soluções até ao final do procedimento ou a estrutura do tecido pode ser danificada.
4. Para recuperação do antígeno, coloque slides em um suporte de metal slide e inseri-lo no copo com citrato sem a folha de alumínio a ferver. Deixe ferver por 10 min.
5. Retirar o copo do prato quente e deixe esfriar por 20 min. Certifique-se de que as seções adrenais ainda são cobertas com o buffer.
6. Prepare a solução de bloqueio. Se usando a coloração comercialmente disponível kit de empregados para o Representante resultados (ver a Tabela de materiais), em um tubo, adicione 1,25 mL de 1X PBS, 1 gota (o equivalente a cerca de 45 µ l) de reagente de bloqueio de Ig de Mouse e 5% de soro de cabra normal. Armazene a solução bloqueio a 4 ° C ou em gelo durante o trabalho.
   Nota: O soro usado depende de espécies de hospedeiros do anticorpo secundário. Aqui foram usados anticorpos secundários erguidos em cabra. Para outros anticorpos, concentrações séricas diferentes podem ser necessárias. Empiricamente, determine a concentração correta de soro testando várias concentrações.
7. Transferi os slides em uma jarra de Coplin contendo PBS 1x e lavagem 3 x 10 min cada um basculante com balanço suave.
8. Prepare uma câmara umidificada para a coloração.
9. Agite suavemente, fora a PBS de um slide; Limpe a parte inferior do slide com uma limpeza de fiapos para remover a excesso PBS.
10. Usando um marcador especial para slides com propriedades hidrofóbicas, desenhe um círculo ao redor de cada seção adrenal, certificando-se que a superfície de vidro é seca para evitar a propagação da solução de tinta para a seção. Se necessário, limpe cuidadosamente seca a superfície. Coloque o slide na câmara umidificada.
11. Rapidamente, pipete 50 µ l (ou o suficiente para cobrir as seções) de bloqueio solução sobre cada seção. Encube por 1h à temperatura ambiente.
    Nota: Bloqueio de volume de solução necessário pode variar; é importante que as seções são bem cobertas com a solução.
12. Preparar a solução diluente do kit comercialmente disponível com 7,5 mL de 1X PBS, 600 µ l de proteína concentrar ações solução e 5% de soro de cabra normal (ou qualquer outro soro e concentração utilizada na solução de bloqueio). Armazene a solução diluente a 4 ° C ou em gelo durante o trabalho.
13. Prepare as soluções de anticorpo primário, diluindo os anticorpos primários nas concentrações adequadas na solução diluente. Para coloração de co, adicionar uma alíquota de cada anticorpo em um novo tubo e misture suavemente. Anticorpos de lugar e soluções de anticorpo no gelo até estar pronto para usar.
    Nota: Aqui usamos anticorpo anti-SF1 no coelho e um anticorpo anti-TH no mouse. Para preparar o anticorpo soluções de trabalho sigam as instruções.
    1. Para a solução de trabalho de SF1, em um tubo, adicione 1 µ l de anticorpo anti-SF1 a 999 µ l de solução diluente (concentração final de 1,5 µ g/mL). Para a solução de trabalho de TH, em um tubo, adicione 1 anticorpo anti-TH µ l 499 µ l de solução diluente (estima-se a concentração final de 2-6 µ g/mL).
    2. Para SF1 + TH mix de trabalho de anticorpo, em um tubo fresco, pipetar 250 µ l de solução de trabalho de SF1 e 250 µ l de solução de trabalho de TH. Misture suavemente pipetando. Armazenar no gelo.
14. Transferir os slides em uma jarra de Coplin contendo 1X PBS e lavar 3 x por 5 min cada um basculante com balanço suave.
15. As lâminas de volta para a câmara umidificada depois limpando o excesso de PBS, pipeta o SF1 + TH anticorpo trabalho mix (ou outra solução de anticorpo primário) em cada seção, feche a câmara umidificada e deixá-lo durante a noite a 4 ° C.
16. No dia seguinte, mova os slides em um Coplin jar contendo 1X PBS e lavagem 3x por 15 min em uma cadeira de balanço com balanço suave.
17. Enquanto lavava os slides, prepare a solução de anticorpo secundário na solução diluente usando a concentração adequada. Se realizando co coloração, adicione uma quantidade igual de cada solução de anticorpo secundário em um tubo de novo. Misture suavemente pipetando. Armazenar no gelo. Proteger os tubos de luz e armazenar no gelo até estar pronto para usar.
    Nota: Aqui, os anticorpos secundários utilizados são 488 nm fluorescente tingir-etiquetados anti-rato gerado na cabra e 549 fluorescente tingir-etiquetados anticoelho erguido em cabra. A solução de anticorpo secundário foi preparada pela adição de 0,5 µ l de cada anticorpo secundário em 799 µ l de solução diluente (concentrações finais de 1,2 µ g/mL).
18. Coloque os slides volta na câmara umidificada depois de retirar o excesso de PBS, rapidamente adicionar a solução de anticorpo secundário nas secções adrenais, feche a câmara umidificada e proteger da luz. Encube por 1h à temperatura ambiente.
19. Lavar as lâminas em uma jarra de Coplin com 1X PBS e lavar 3x por 15 min em uma cadeira de balanço com balanço suave, certificando-se de protegê-los de luz.
20. Preparar a 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solução para coloração nuclear: 1 µ l de DAPI (20 mg/mL) em 1 mL de 1X PBS.
    Nota: Corante de contraste nuclear azul fluorescente pode também ser conseguido usando corante Hoechst.
21. Adicionar solução de DAPI para as seções de adrenais, cobrir de luz e incubar a temperatura ambiente por 7 min.
22. Lavar as lâminas em uma jarra de Coplin com 1X PBS e lavar 3 x por 5 min em uma cadeira de balanço com balanço suave, protegendo os slides da luz.
23. Em uma área protegida da luz directa, deite-se um vidro de tampa, e pipetar 60 µ l ou cerca de 3 gotas de agente de montagem apropriado para imunofluorescência ao longo da superfície do vidro tampa.
24. Limpe cuidadosamente a parte de trás de um slide com uma limpeza de fiapos, posição do slide viradas para baixo em direção o tampa de vidro e paralelo a ele, então os cortes histologicos enfrentam o vidro de cobertura com o agente de montagem nele. Levemente pressione o slide sobre o vidro de cobertura e certifique-se de que nenhuma bolha de ar está preso entre o slide e o vidro de tampa.
    1. Se necessário, aplica mais pressão para remover as bolhas de ar e o excesso de agente de montagem.
25. Estabelecer o slide em um recipiente escuro e cura à temperatura ambiente durante um período mínimo de 24 h (ou o tempo indicado na folha de informações do agente de montagem usado) e vá para a imagem.

7. imagem latente

Nota: Um microscópio de fluorescência, conectado a uma câmera é necessário para detectar e capturar a fluorescência emitida por tecidos após a excitação em determinados comprimentos de onda. Embora óbvio, é importante lembrar-se de escolher o secundário anticorpo conjugado com fluorochromes cuja excitação e espectros de emissão são compatíveis com os equipamentos disponíveis. Configurações de imagem variam de acordo com o microscópio e o software usado para captura de imagens. Existem algumas regras básicas que se aplicam para seções adrenais de imagem, tais como ter certeza de que o tempo de exposição, câmera obter configurações e intensidade da fonte de luz são mantidos constantes.

1. Ligue a fonte de luz e a câmera, lançar o software de imagem seguindo as instruções do fabricante.
   Nota: A ordem dessas ações pode diferir dependendo do equipamento utilizado.
2. Fixe o slide no palco, abrir o obturador e olhando pelas oculares do microscópio usar coloração nuclear (DAPI) canal e ampliação baixa (4x) para identificar o tecido no slide: seções adrenais são pequenas, e sua visualização pode exigir algum tempo.
3. Mude para uma maior ampliação (10x), foco e fechar o obturador.
   Nota: É importante evitar desnecessariamente longa exposição à luz que podem causar o fotobranqueamento, resultando em perda de sinal.
4. Usando os comandos do software, selecione o objetivo (10 X) e o canal em uso (DAPI), ajustar o tempo de exposição (1 s, pode ser ajustado se o sinal for muito forte ou fraco). Se disponível, defina binning para geração de imagens ao vivo (não aquisição) '2 X 2' conversão ganhar a 'médio', velocidade de leitura de 20 MHz'. Se o software utilizado não exibe a barra de escala no final da imagem, selecione a opção barra de escala do menu e posicionar o bar onde desejar.
5. Abrir o obturador, re-ajustar o foco, se necessário e mudar de canal (FITC, TRITC, DAPI). Se o microscópio não é automatizado, tirar uma foto da adrenal em cada canal sem mover o palco e certifique-se de ajustar a seleção do canal em uso. Feche o botão do obturador uma vez terminado.
   Nota: Anote as definições empregadas no caso o software não automaticamente salva-los.
6. Salve as fotos.
   Nota: Fotos mescladas podem ser muitas vezes criadas usando software do microscópio ou outros pacotes de software de editor de gráficos.
7. Repita a imagem para outras áreas da seção e/ou com uma maior ampliação.
   Nota: Uma ampliação de 20 X muitas vezes requer um menor tempo de exposição (ou seja, 800 ms).
8. No final da imagem, desligue todos os equipamentos na ordem correta.

Resultados

A Figura 1 representa um diagrama esquemático do todo protocolo descrito acima. As glândulas adrenais são colhidas de ratos, tecido adiposo adjacente é removido sob um microscópio de dissecação e a adrenal são então fixado em 4% PFA. Após esta etapa, supra-renais são processadas incorporadas em parafina e seccionadas com um micrótomo para corte o órgão em fatias finas depositadas em corrediças do microscópio. Após a secagem das seções, imun...

Discussão

Este protocolo descreve um método para o isolamento de rato glândulas supra-renais juntamente com a preparação e coloração de glândulas supra-renais secionado rato de parafina.

Em comparação com outros protocolos que testamos, este protocolo de imunofluorescência revelou-se adequado para a maioria dos anticorpos utilizados em nosso laboratório. No entanto, em certos casos pode exigir alguns ajustes para melhorar os resultados da coloração. Uma variável que pode ser facilmente mod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture plate	Nest Biotechnology Co.	0412B
Disposable needles 25 G x 5/8"	Exel International	26403
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Paraplast plus	McCormik scientific	39502004	Paraffin for tissue embedding
Shandon biopsy cassettes II with attached lid	Thermo scientific	1001097	Cassettes for tissue processing
High Profile Microtome Blades	Accu-Edge	4685	Disposable stainless steel blades
Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds	Polysciences Inc.	18986	Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15	75 mm x 25 mm x 1 mm
Xylene	Fisher Chemical	X5P1GAL
200 Proof Ethanol	Decon Labs, Inc.
Certi-Pad Gauze pads	Certified Safety Mfg, Inc	231-210	3" x 3. Sterile latex free gauze pads
M.O.M kit	Vector laboratories	BMK-2202	For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue
KimWipes	Kimtech	34155	Wipes 4.4 inch x 8.4 inch
Super PAP PEN	Invitrogen	00-8899	Pen to draw on slides
Microscope cover glass	Fisherbrand	12-544-D	Size: 22 x 50 x 1.5
DAPI	Sigma	D9542	(Prepared in 20 mg/mL stock)
ProLong Gold antifade reagent	Molecular Probes	P36930	Mounting agent for immunofluorescence
X-cite series 120Q	Lumen Dynamics		Light source
Coolsnap Myo	Photometrics		Camera
Optiphot-2	Nikon		Microscope
microtome	American Optical
Tissue embedder	Leica	EG1150 H
Tissue processor	Leica	ASP300S
Normal goat serum	Sigma	G9023
Mouse anti-TH	Millipore	MAB318	Primary antibody
Rabbit anti-SF1	Ab proteintech group (PTGlabs)	custom made	Primary antibody
Alexa-488 Mouse IgG  raised goat	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Secondary antibody
Dylight-549 Rabbit IgG raised goat	Jackson ImmunoResearch	111-505-003	Secondary antibody
Citrate acid anhydrous	Fisher Chemical	A940-500
NIS-Elements Basic Research	Nikon		Software for imaging