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要約

ここでは、マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中に特定のタイプのニューロンを光遺伝学的に操作する方法を説明し、ストリア末端のベッド核に関する最近の研究を例に挙げる。

要約

近年、光遺伝学は神経科学研究の多くの分野で広く使用されている。多くの場合、チャネルロドプシン2(ChR2)のようなオプシンは、様々なCreドライバマウスにおける特定のタイプの神経細胞におけるウイルスベクターによって発現される。これらのオプシンの活性化は、光学ケーブルを介してレーザーまたはLEDによって送達される光パルスの適用によって引き起こされ、活性化の効果は非常に高い時間分解能で観察される。実験者は、マウスの行動や他の生理学的結果を監視しながら、ニューロンを急性刺激することができる。光遺伝学は、マウスの睡眠/覚醒状態の調節における神経回路の機能を評価するのに有用な戦略を可能にすることができる。ここでは、マウスの睡眠段階を評価するために、脳波計(EEG)および筋電図(EMG)モニタリング中に特定の化学的同一性を有するニューロンの光遺伝学的操作の効果を調べる技術について説明する。一例として、ストリア末端子(BNST)のベッド核におけるGABAergicニューロンの操作について説明する。これらのニューロンの急性光遺伝学的興奮は、NREM睡眠中に適用されたときに覚醒への急速な移行をトリガーします。EEG/EMG記録と共に光遺伝学的操作は、睡眠/覚醒状態を調節する神経回路を解読するために適用することができます。

概要

睡眠は最適な認知機能に不可欠です。最近の知見はまた、睡眠障害が1、2、3の広範な疾患に関連していることを示唆している。睡眠の機能はまだほとんど未解決ですが、睡眠/覚醒状態4を制御する神経回路とメカニズムを理解する上で、最近大きな進歩が見られます。哺乳類には、覚醒、非急速眼球運動(NREM)睡眠、急速眼球運動(レム)睡眠の3つの警戒状態があります。覚醒度は、目的と持続的な運動活動を有する低振幅の高速EEG振動(5-12 Hz)によって特徴付けられます。NREM睡眠は、意識と意図的な運動活動の欠如と高振幅(デルタ波)の遅い振動(1-4 Hz)によって定義されます。レム睡眠は、低振幅の比較的速い振動(6-12 Hz)とほぼ完全な両側筋アトニア5によって特徴付けられます。

Borbelyは、2つのプロセスモデル6、7として知られている睡眠覚醒調節の理論を提案した。恒静止プロセスは、プロセスSとも呼ばれ、覚醒中に蓄積し、睡眠中に消散する睡眠圧を表します。プロセス C と呼ばれる別のプロセスは概日プロセスであり、24 時間サイクルで警戒レベルが変動する理由を説明します。これら2つのプロセスに加えて、同種化因子は睡眠/覚醒8、9の調節にとっても重要である。同一性因子には栄養状態と感情が含まれる。恐怖と不安は、通常、自律神経および神経内分泌応答10、11、12と共に覚醒の増加を伴う。四肢系は恐怖と不安の調節に役割を果たすと考えられており、自律神経および神経内分泌応答の基礎となるメカニズムは広範囲に研究されているが、四肢系が睡眠/覚醒状態に影響を与える経路は、そうでない。まだ明らかにされていない。光と薬理遺伝学を用いた最近の研究の多くは、睡眠/覚醒状態を調節するニューロンおよびニューロン回路が、皮質、基底前脳、視床下部、視床下部を含む脳全体に分布していることを示唆している。そして脳幹。特に、光遺伝学の最近の進歩により、高い空間的および時間的分解能を持つ特定の神経回路in vivoを刺激または阻害することができました。この技術は、睡眠と覚醒の神経基板の理解の進歩を可能にし、睡眠/覚醒状態は概日プロセス、睡眠圧、感情を含む同種の要因によってどのように調節されるかを理解する。本論文は、NREM睡眠、レム睡眠の調節に役割を果たす脳内のコネクトームやメカニズムに対する理解を新しくする可能性のある、睡眠/覚醒記録と組み合わせた光遺伝学的操作の使用方法を紹介することを目的としています。そして覚醒。不眠症は通常、睡眠不足の不安や睡眠を取ることができない恐れ(ソムフォビア)に関連しているので、四肢系が睡眠/覚醒状態を調節するこのメカニズムの理解は、健康にとって最も重要です。

BNSTは、不安と恐怖に不可欠な役割を果たすと考えられています。GAD 67-発現GABAergicニューロンは、BNST12,13の主要集団である。これらのニューロン(GABABNST)が睡眠/覚醒状態に及ぼす影響を調べた。近年の神経科学の最大の進歩の一つは、高い空間的および時間的分解能を持つ生体内で特定の化学的アイデンティティを持つニューロンの操作を可能にする方法である。光遺伝学は、神経活動と特定の行動応答14との因果関係を実証するために非常に有用である。睡眠/覚醒状態の調節における定義された神経回路の機能的接続性を調べる方法として光遺伝学を説明する。この技術を利用することで、睡眠/覚醒状態を調節する神経回路の理解に大きな進歩が見られた15,16,17,18,19.多くの場合、オプシンは、Cre-driverマウスとクレ誘導性AAV媒介遺伝子伝達遺伝子の組み合わせによって選択的脳領域の特定の化学的アイデンティティを有するニューロンに特異的に導入される。さらに、チャネロドプシン2(ChR2)20またはアルカエルホドプシン(ArchT)21などの光感受性オプシンの焦点発現は、Cre-loxPまたはFlp-FRT系と組み合わせることで、選択的ニューロン集団および特異的な運動を操作することを可能にする。神経経路22.

BNSTにおけるGABAergicニューロンに関する実験を例として説明する.指定されたニューロン集団でオプシンを発現させるには、適切なCreドライバマウスおよびCre依存性ウイルスベクターが最も頻繁に使用される。オプシンが特に神経集団で発現されるトランスジェニックまたはノックインラインも有用である。以下の実験では、GABAergicニューロンのみがC57BL/6J遺伝的背景を有するクレレコンビナーゼを発現するGAD67-Creノックインマウス23と、EFPまたはEYFPと融合したChR2(hChR2 H134R)を含むAAVベクターを対照として用いた。「FLEx(フリップ切除)スイッチ」24を使用します。手順は、具体的に睡眠/覚醒状態25のモニタリング中にBNSTにおけるGABAergicニューロンの光遺伝学的興奮を説明する。

プロトコル

全ての実験は筑波大学動物実験利用委員会の承認を受け、NIHガイドラインに準拠しています。

1. 動物外科、ウイルス注射、脳波/EMG用電極、光ファイバ注入

注意:適切な保護および取り扱い技術は、使用するウイルスのバイオセーフティレベルに基づいて選択されるべきである。AAVは、注射のための隔離されたP1Aグレードの部屋で使用されるべきであり、AAVを運ぶ管はすべての容積が使い果たされた後、オートクレーブで殺菌されなければならない。外科部位およびすべての埋め込まれた材料は使用の間にきれいで、無菌でなければならない。
注:図 1を参照してください。

  1. オートクレーブで外科機器を消毒する。
  2. マウスを麻酔気化器を用いてイソファランで麻酔する。マウスが麻酔の所望の深さに達するまで観察し、鉗子で尾をつまむ反応の喪失によって決定される。眼のオチントを目に塗布し、乾燥を防ぎます。
  3. ヨウ素溶液または70%EtOH(3x)で外科場を消毒し、十分に乾燥させる。手術中にウイルスが氷の上で解凍できるようにします。吸収性の実験室のベンチペーパーによって外科区域をカバーする。
  4. マウスの頭部を耳棒と鼻のピンチで立体装置に固定します。頭部が安定して保持されていることを確認した後、頭皮に中矢状切開を行い、ブレグマとラムダの位置が水平線上の同じレベルに位置していることを確認します。
  5. 位置のギャップを避けるため、鼻のピンチとイヤーバーの上下のレベルを適切に調整します。ブレグマとラムダは、それぞれ、スチュラ・サギタリスとスチュラ・コロナリスまたはスチュラ・ラムドイダルとの交点を指す(図2)。
  6. セラフィンクランプを使用して、頭蓋骨へのアクセスを維持するために皮膚を保持します。頭蓋骨の曝露後、ヨウ素または5%H2O2で頭蓋骨の表面を消毒し、ブレグマおよびラムダを含む頭蓋骨縫合糸をより明確に可視化できるようにする。
  7. AAV ベクトルインジェクションを準備する:
    1. 10mLシリンジの内側を70%EtOH、100%EtOH、殺菌水で順次洗浄し、それぞれ5回ずつ洗います。 マイクロインジェクションポンプアームのクランプでシリンジを固定し、シリンジ内のすべての溶液が排出されていることを確認します。
    2. 気泡なしで2μLのミネラルオイルを慎重に吸引し、ウイルス溶液の指定体積を吸引する。吸引後、プランジャーボタンを操作し、ウイルス溶液が針の先端に現れることを確認します。
      注:ウイルス溶液の注射量は、同じマウス株と同じウイルス産物を用いて試験実験で決定した。ウイルス溶液の体積と感染領域の程度との関係を事前に推定する必要があります。
  8. AAV ベクトルを挿入する:
    1. ブレグマのマイクロインジェクション針の先端を調整し、座標を元のポイントとしてメモします。先端を指定された注射部位(BNST:前背部+ 0.2 mm、平面±1.0mm、ドルソベンテラル- 4.2 mm)に移動し、針の先端を位置に置きます。0.7mmの炭化物カッターを使用した歯科ドリルを使用して、直径約2mmの頭蓋骨とドリル穴にマークを付けます。硬膜や脳組織を損傷しないように注意してください。
    2. 綿棒で穴の周りから血液を取り除き、ゆっくりとBNSTの位置に針を動かします。指定量のウイルス溶液(0.07 μl/min)を機械的マイクロインジェクターでゆっくりと注入します。注射を完了した後、溶液が十分にBNST組織に浸潤できるように5分間針を残します。慎重に針を取り出します。
    3. 二国間注入の場合は、反対側の手順 1.8.1-1.8.2 を繰り返します。手順を通して、生殖不能生理生理の適用と頭蓋骨を湿ったままに保つ。
      注:カスタムEEG/EMGインプラント(W:5mm、D:7mm、H:1 mm)、4つのEEG電極(4mm、ニッパーで4mm電極を2mmにカット)、6電極(図2A)を使用しました。
  9. 断熱材の1mmがEMG電極に両端から取り除かれる2本のステンレス鋼ワイヤー(材料の表を参照)はんだ付け。電極の中心をブレグマに調整し、各EEG電極の位置(前置詞±1.5mm、平面±1.0mm)をマークし、インプラントの位置を決定する(図2B)。
  10. インプラント光ファイバ:
    1. マニピュレータに光ファイバフェルールを取り付け、マニピュレータアームを回転させて水平線に対して±30°の角度を持たせます(このプロセスは、BNST刺激の場合など、電極と光ファイバ間の干渉を避けるためにのみ必要です)。繊維先端をブレグマに置き、座標を記録します。
    2. 先端をターゲットの挿入ラインに移動し、頭蓋骨の位置をマークします。また、アンカーねじの挿入部位付近に追加のマークを付します。各部位の頭蓋骨を歯科ドリルでドリルで掘削し、光ファイバを挿入し、ネジを固定します。頭蓋骨のネジを直して硬膜を壊したり、ねじでティッシュを傷つけたりしないように注意してください。
    3. マニピュレータでBNSTの上に到達するまで、光ファイバを穏やかに挿入します。フェルールは残りの頭蓋骨(図1B)に置くべきです。
    4. 繊維とネジを覆うために、光硬化性歯科用セメント(材料の表を参照)を適用します。接着剤を固める反応時間は、メーカーのマニュアルで指定する必要があります(当社の材料は、特定の波長光発生器で少なくとも10sの光への露出を必要とします。この後に接着剤を乾燥させる必要はありません)。
    5. この手順では、電極の取り付けスペースに材料(ネジまたは接着剤)が占有していないことを確認します。また、光ファイバとケーブルに接続するフェルール用のセメントの中断は避けてください。二国間刺激のために反対側の手順 1.10.1-1.10.4 を繰り返します。
  11. 脳波/EMG電極用ドリル穴。電極の先端を穴に挿入します。インプラントを保持し、頭蓋骨と電極の間のスペースにシアノクリレート接着剤を適用します。材料に干渉しないように注意して再度挿入します。
  12. 電極と光ファイバの周囲をシアノクリレート接着剤で覆い、続いて接着剤にシアノクリレートアクセラレータを塗布します。この手順により、フェルールから光ファイリングケーブルおよび電極間のワイヤ接続ゾーン (図 1C)で中断が発生するのを回避できます。
    注:シアノクリレート接着剤およびその加速度剤は、マウスの目に有害です。これらの化学物質の流出を引き起こさない場合は注意が必要です。また、接着固化直後に予期しないずれを避けるため、電極や繊維に強く触れないように注意してください。
  13. マウスの首の筋肉を露出し、筋肉の下にEMG電極のワイヤを挿入します。EMG電極の長さを調整して、ヌチャル筋のすぐ下に配置します。電極の先端と筋膜筋膜の間の光の関係は、EMG信号をキャッチするのに十分です。
  14. インプラントを満たし、加速度液体で接着剤を固化させるためにシアノクリレート接着剤を適用します。次に、姿勢反射が現れるまで回復のためにマウスをヒートパッドに置きます。ヒートパッドの温度を動物の安静体体温に調整します(C57BL6マウスの場合はZT 0-12で36.0 °C、38.0 °Cを超えることはありません)。
    注:無菌手術には抗生物質は必要ありません。
  15. 術後の鎮鎮薬のためのあなたの地元の機関のガイドラインに従ってください。少なくとも7日間の回復期間のために家のケージにマウスを保管してください。

2. 特定睡眠状態における標的ニューロンの光励起による脳波/EMGモニタリング

注意:このプロトコルには、クラス 3B レーザー装置または LED デバイスの使用が含まれます。実験者は安全情報を認識する必要があります。保護眼ゴーグルが必要です。

  1. レーザーケーブルを光ファイバに接続する前に、スケーラでレーザー強度を調整します。レーザーケーブルの先端をフェルール付きの未使用の光ファイバにつなぎ、ファイバとケーブルの接合部にスペースがないことを確認します。
  2. レーザーのメインスイッチをオンにし、ウォームアップまで20分待ちます。
  3. レーザーを強度チェッカーに出力し、レーザー強度を 10 mW/mm2に調整します。レーザーモードをトランジスタロジックに変更し、長時間10ms、残り40ms、サイクル20回、繰り返し20回(つまり、20秒の光パルスの20Hz)に設定されたパターンレギュレータによって制御される光パルスが光パルスから放出されていることを確認します。
  4. 回収期間後、マウスを実験室に移動し、EEG/EMGを記録する。食べ物と水が利用可能なアドリビタムと12時間の光/暗いサイクルで一定の23 °Cでマウスを収容します。
  5. 絡み合いを避けるために、スリップリングに連結された埋め込まれた電極とケーブルアダプタを接続します。レーザー漏れを防ぐために、アルミ箔などの光不透過性材料で接合部を覆うことをお勧めします。二国間の実験が必要な場合は、ケーブルの二股アタッチメント付きスリップリングを使用します。
  6. このプロトコルでは、NREMスリープまたはレム睡眠からの覚醒までの待ち時間を評価するので、記録時間は最適化されたツァイトゲーバー時間に制限されるべきである(ZT0はライトが点灯している時間として定義される)。このプロトコルはZT4-ZT10の間で行われた。マウスを順化として少なくとも1時間実験室に自由にとどめさせましょう。
  7. 実験期間中、同じモニターで脳波信号とEMG信号を監視し、マウスの状態を覚醒、NREM睡眠、レム睡眠として評価します。各ウェーブのゲイン コントロールを使用して、各状態を簡単に区別できます。
  8. 覚醒待ち時間に対するNREM睡眠の測定では、40秒または安定したレム睡眠を30秒で観察し、光刺激用パターンジェネレータのスイッチをオンにします(このプロトコルは20秒の20hzの10ミリ秒の光パルスを生成します)。埋め込まれた光ファイバへのレーザー放出を確認します。
  9. 睡眠状態が覚醒に変化するまで、EEG/EMG信号を記録します。2つ以上の実験的な試験が必要な場合、光刺激は睡眠/覚醒アーキテクチャに影響を与える可能性のある人工的な介入であるため、光遺伝学的操作を1日1回に制限する。
  10. 実験の後、免疫組織化学分析26のために脳全体をサンプリングするための無菌生理食生理食およびパラホルムアルデヒド(PFA)を深く麻酔し、浸透させる。

3. NREM睡眠から覚醒までの待ち時間の解析

  1. 脳波/EMG信号を記録した後、睡眠/覚醒状態をスコアリングするために信号データをコンピュータに転送します。このプロトコルは、記録ソフトウェアを用いる脳波解析の方法について説明します(材料の表を参照)。
  2. スリープサインアプリケーションを起動し、[ファイル]タブをクリックし、[開く]を選択して記録されたデータ(.kcdファイル)を選択します。[スリープ]タブをクリックして、各エポックのタイム ウィンドウを調整するためのエポック時間を選択します (1 エポック/4 秒を使用します)。
  3. 覚醒、高周波の低脳波電圧:覚醒度、高EMGおよび低脳波電圧に従って、脳波/EMG信号に基づいて手動で睡眠/覚醒状態をスコア付けします。NREM、低EMGトーンと高いδ(0.5-4 Hz)周波数の高EEG電圧。そしてREM、EMGは高いθ(6-9 Hz)周波数の筋肉アトニアおよび低いEEG電圧を示す。16 s (つまり 4 エポック) 連続して継続しない状態は、安定状態ではないため、状態変更として定義されません。
  4. 最初のエポックのマウスの左ボタンをクリックしたまま、16 s (4 エポック) を超える特定の傾向が終了するまでカーソルをドラッグします。次に、マウスの左ボタンを放し、ポップアップウィンドウで適切な状態(覚醒またはNREMスリープまたはレムスリープ)を選択します。この手順を繰り返して、ファイルに記録されたすべての EEG/EMG 信号をスコア付けします。
  5. EEGがNREMまたはレム睡眠を示すエポックで刺激の正確な時間を見つけ、刺激点に続く状態遷移を示すエポックを見つけます。刺激直後と状態遷移直前の期間の間のエポック数をカウントします。
  6. 次に、エポック数に 4 s (A) を掛け合います。刺激のエポックでは、スクリーンショットを撮り、刺激点とエポックの終わりの間の幅を測定します。次に、測定された長さをエポックの長さ全体で除算し、4s(B)で乗算します。同様に、状態変化のエポックにおけるNREMスリープの持続時間を計算し、これはエポックの開始から状態変化点(C)までの間の時間を意味します。
  7. 合計A、BおよびCは、覚醒にNREM睡眠から待ち時間を得る。レム睡眠から覚醒への状態遷移の分析に同じ手順が使用されます。

結果

本研究は、GABABNSTニューロンの光遺伝学的興奮が睡眠状態遷移に及ぼす影響を示した。ChR2-EYFPは、BNSTにおけるGABAニューロンにおいて焦点的に発現した。その中のハイブリダイゼーションヒストケミカル研究では、ChR2-EYFPがGAD 67 mRNAシグナルを発現するニューロンにコローカライズされ、これらはGABAergicニューロンであることを示した。免疫組織化学スライス?...

ディスカッション

ここでは、睡眠/覚醒の状態遷移に対する特定の化学的アイデンティティを有するニューロンの光遺伝学的刺激の効果を評価する方法を提示し、GABABNSTニューロンの操作の例を示した。我々のデータは、GABABNSTニューロンの光遺伝学的興奮は、NREM睡眠から覚醒への即時移行をもたらすことを示した。

数多くのタイプの光遺伝学的ツールの開発により、様々?...

開示事項

このプロジェクトは、メルク・アンド・カンパニーが財政的に支援した部分です。

謝辞

本研究は、メルク研究者研究プログラム(#54843)、革新的分野に関する科学的研究のためのKAKENHI助成金、ウィルダイナミクス(16H06401)(T.S.)、および革新的分野に関する探索的研究のためのKAKENHI助成金(T.S.)によって支援されました。(18H02595)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1x1 Fiber-optic Rotary JointsDoricFRJ 1x1 FC-FCfor optogenetics
6-pin headerKEL corporationDSP02-006-431G
6-pin socketHirose21602X3GSE
A/D converterNippon kodenN/AAnalog to digital converter
AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP3.70×1013(genomic copies/ml)
AAV10-EF1a-DIO-EYFP5.82×1013(genomic copies/ml)
AmpicillinFuji film014-23302
AmplifierNippon kodenN/Afor EEG/EMG recording
Anesthetic vaporizerMuromachiMK-AT-210D
Automatic injecterKD scientific780311
Carbide cutterMinitorB1055φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor 
Cyanoacrylate adhesion  (Aron alpha A) and accelerationKonishi#30533
Dental curing light3MElipar S10
Epoxy adhesiveKonishi#04888insulation around the solder of 6-pin and shielded cable
Fiber optic patch cord (branching)DoricBFP(#)_50/125/900-0.22
Gad67-Cre miceprovided by Dr. Kenji SakimuraCre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele
Hamilton syringeHamilton65461-01
High speed rotary micromotor kitFOREDOMK.1070Used with carbide cutter
Interconnecting sleeveThorlabADAF1φ2.5 mm Ceramic 
IsofluranePfizer871119
Laser  Rapp OptoElectronicN/A473nm wave length
Laser intesity checkerCOHERENT1098293
Laser stimulatorBio research centerSTO2reffered as pulse generator in text
Optic fiber with ferrule ThorlabFP200URT-CANNULA-SP-JP
pAAV2-rh10provided by PennVector Core
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpAAddgeneplasimid # 20296
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpAprovided by Dr. Karl Deisseroth
Patch cordDoricD202-9089-0.40.4m length, laser conductor between laser and rotary joint
pHelperStratagene
Photocurable dental cement3M56846
Serafin clampStoelting52120-43P
Shielded cablemogamiW2780Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording
Sleep recording chamberN/AN/ACustum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder
Sleep sign softwareKISSEI COMTECN/Afor EEG/EMG analysis
Slip ringneuroscience,incN/Afor EEG/EMG analysis
Stainless screwYamazakiN/Aφ1.0 x 2.0
Stainless wireCooner wireAS633 0.0130 inch diameter
Stereotaxic frame with digital consoleKophN/AModel 940
Syringe needleHamilton7803-05
Vital recorder softwareKISSEI COMTECN/Afor EEG/EMG recording

参考文献

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