組み合わせてモノクロまたは Sugen 肺高血圧ラットのモデルとして左肺全摘

要約

齧歯動物左肺全摘術は、肺高血圧症研究の貴重な手法です。ここでは、ラット肺全摘術の手順と最小限の罹患率と死亡率を確保するため術後のケアについて説明するためのプロトコルを提案する.

要約

このプロトコルでは、詳細に説明して正しい手順と必要な予防措置を正常に左肺全摘を行いモノクロ (MCT) の追加投与によるラットの PAH を誘発するまたは SU5416 (Sugen)。我々 はまた他の PAH のモデル研究でよく使用されるこれら 2 つのモデルを比較します。ここ数年で PAH の動物モデルのフォーカスに肺血流増加の役割は考慮した重度の開発の重要なトリガーとして肺の網状病変の angioproliferation のメカニズムを勉強へ移動します。血管リモデリング。肺血流の増加の最も有望な齧歯動物モデルの 1 つは、MCT の Sugen「2 番目のヒット」と組み合わせて片側左肺全摘術です。左の肺の除去は、増加および乱流の肺血流と血管リモデリングに します。現在、ラットの肺全摘手術の詳細な手順はありません。ここでは、肺全摘手術と雄 Sprague-dawley ラットの術後ケアの手順プロトコルについて詳しく説明します。簡単に言えば、動物の麻酔し、胸を開きます。左肺動脈、肺静脈、気管支を視覚化でき、それらが組み合わされて、左の肺が削除されます。胸が閉じられます、動物が回復しました。血液は右肺のみで循環させるとしています。この血管内圧の亢進は、進歩的な改造と肺小動脈の閉塞に します。MCT の Sugen 2 番目のヒットは、内皮機能不全を誘発する使用 1 週間後の手術です。肺と内皮機能不全の増加血流の組み合わせは、重症 PAH を生成します。この手順の主な制限は、一般的な手術技能が必要なことです。

概要

肺動脈高血圧症 (PAH) は肺血流量、血管抵抗の増加、炎症および肺の小さな血管¹の改造の増加によって特徴付けられる進行と致命的な病気です。この改造は通常血管病変を妨害し、肺小動脈、血管収縮を引き起こし、右心室の後負荷²の増加を消し去ることで起因します。PAH のほとんどの成功した薬理学的治療法が存在しません。その結果、PAH 関連死亡のまま高.最近では、肺高血圧症の病態に関する研究のフォーカスに肺血流増加の役割は考慮した肺の開発の重要なトリガーとして血管血管増殖のメカニズムへ移動します。^3,4を改造します。

肺高血圧症の動物モデルは、疾患の病態生理を説明し、薬、細胞、遺伝子、タンパク質配信のためのプラットフォームとして提供している、重要な洞察力を提供しています。従来、慢性低酸素血症による肺高血圧モデルと MCT 肺傷害モデルは、PAH の病態⁵を研究するために使用する主なモデルをされています。しかし、彼らは人間の患者に説明した差異と比較して改造の増加肺血流と新生内膜パターンを生成するのに十分ではありません。齧歯動物の慢性低酸素モデルは、小さな肺血管⁶の血管閉塞せず低酸素性血管収縮と血管壁の肥厚の結果します。さらに、低酸素状態は可逆的です。このように、低酸素血症モデルはまた重症 PAH を生成するのに十分ではありません。MCT 肺傷害モデルはいくつかの内皮機能不全を引き出すが、重度のプライマリ PAH を持つ人間で見つけられる複雑な血管のフェノタイプ病変ラット²では発症しません。また、MCT 投与ラットは PAH²からではなく、MCT による肺毒性、静脈閉塞性肝疾患、心筋炎から死ぬ傾向があります。最後に、肺全摘術だけでは時間の短い期間で新生内膜病変肺血管を生成するのに十分ではありません。全摘、術後後肺動脈圧⁷で最小限の標高があります。健康⁷対側の肺は、人間の肺全摘も容認されます。

ただし、それは肺血流増加を模倣し、結果肺血管リモデリング厳しい臨床 PAH に匹敵するので、MCT と Sugen 併用左肺全摘手順は有利。4 つ葉は、右ではなく、のみ 1 葉、左肺、肺の全摘術が実行されます。右の肺を削除した場合は、動物は呼吸不全を補正することになります。肺全摘術 MCT モデル改造の新生内膜パターンは扱われる運営動物⁷の 90% 以上で成長します。同様に、Sugen と肺全摘術の組み合わせによって重症 PAH、アンギオ フェノタイプの血管病変、増殖、アポトーシスおよび右心室機能不全の⁸によって特徴付けられます。左肺全摘手順は、PAH を誘発する他の外科手術と比較しても有利であります。以前大動脈, 下大静脈シャントまたは鎖骨下肺動脈吻合、肺への肺血流を増加するラットの説明モデルが含まれます。これらのモデルは、非常に複雑な^7,9,10,11です。大動脈, 下大静脈シャントを行う動物の腹部が開かれます。シャント、肺だけではなくすべての腹部臓器への血流を増加腹部の大動脈に配置されます、PAH したがって、開発に長い時間がかかります。さらに、それは、全摘例の血流残存肺ダブルスに対し、シャントの血流を判断することは困難。鎖骨下肺動脈吻合では、多くの合併症もあります。静脈に動脈の血液の流れは、吻合部出血・血栓症につながることができます。大動脈下大静脈シャントのような吻合部の血流を判断することは困難です。さらに、血管外科のスキルを必要とする高価で難しい技術です。一方的な左肺全摘は血流と左肺内のせん断応力を 2 倍し、MCT や Sugen と組み合わせて、原因内皮細胞損傷^8,である PAH の典型的な血行動態と病理組織学的所見¹²。

この原稿の目新しさは、左肺全摘ラットおよびこれらのモデルの技術と生理学的課題の議論の非常に詳細かつ包括的な外科手術で提示されます。このプロトコルが現在使用できないために、多くの研究者はモデルがあまりにも困難な使用と考えています。左肺全摘を行った者は、高い死亡率および動物、科学的評価を損なうことの不必要な損失に関連付けられている別の罹患率に直面しています。代わりに、多くは PAH を作成するのに MCT 注射、慢性的な低酸素症、またはちょうど肺全摘術などの古典的なモデルを使用します。ただし、これらのモデルは左肺全摘と MCT または Sugen の組み合わせよりもはるかに少ない効果的です。この記事の主な目的は、ラットの左一側肺全摘の最初詳細と再現性のある外科手術を提供し、PAH の最高の手術モデルを提供することです。この致命的な病気の病因を研究する重症 PAH のはるかに効果的な臨床的に関連するモデルを作成する研究者、MCT や SU5416 と左片側肺全摘のこのプロトコルを組み合わせることができます。

プロトコル

次の手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) シナイ山で、Icahn 医学部によって承認されています。すべてのラットは、シナイ山は、「ケアと実験動物使用ためのガイド」に準拠して人道的なケアを受けてください。

1. 手術のための準備

1. オートクレーブ クーリー-メイヨー曲線はさみ (大ばさみ) ストレート アイリスはさみ (ハサミ)、マクファーソン Vannas アイリスはさみ (バックはさみ)、Wangensteen 組織鉗子 (非外科的鉗子)、ジェラルド組織鉗子、プレーン ワイヤ鏡 (自己保持リトラクター) 小型船舶師、ガーゼ、ダブル エンド ・ プローブ、細い血管針ホルダー、マイクロ ジェイコブソン モスキート止血鉗子 (蚊)。

2. 準備中とラットの気管挿管

1. 6-8 週齢、雄 Sprague-dawley ラット、手術前に 30 分でブプレノルフィン鎮痛 (0.1 mg/kg の皮下注射を管理します。
2. 麻酔をかけられ正常ラットまでイソフルラン 4% および 3-4 分間酸素 (1 L/分) にさらされる商工会議所のラットを個別に配置 (すなわち、ゆっくり、呼吸、意識不明、タッチや音に応答しない)。
3. ラットの気管挿管
   1. 商工会議所からラットを削除し、ボードの端に口と、その裏にネズミがきっかりようにテープで板にラット。首のままストレート フラット/2 つの前歯でラットを保持するための文字列を使用します。
   2. 喉頭の上首の上ファイバー光ガチョウ光源を配置、リフト指で舌を押し声帯を視覚化する喉頭蓋を移動します。気管の声帯の後ろに明るく点灯します。気管が鮮やかになるまでは、ライトの位置を調整します。
   3. 60 内喉頭に 16 G のカテーテルを挿入することで、ラットを挿管の彼らはすぐに目を覚ますように、商工会議所からラットを削除します。ラットは成功した挿管前に目を覚ます、ラットを戻すし、繰り返します。
   4. すぐにラットをイソフルランと酸素配達を再開する人工呼吸器に接続します。挿管カテーテルから呼気の湿気の凝縮を観察するコールド ミラーを使用してを確認します。動物はまだ胸の拡大によって呼吸を確認します。
4. ラットを人工呼吸器に接続します。セット酸素 1 L/分の流量が設定換気量 0.35-0.45 の一回換気量と呼吸/分 70 mL。呼気終末陽圧 (PEEP) を 2-4 cm H₂o. 削減イソフルラン 2-3% に設定します。
5. 37 ° C で加熱パッドで右側臥位で顕微鏡下でラットの場所下には、フロントの足をテープします。肋骨の終わりまでフロント脚の後ろに左胸部をバリカンで剃る。ガーゼと 10% ポビドン ヨード液、続いて 70% エタノール (3 回) と外科の領域をクリーンアップします。
6. ラットの足にパルスオキシメータを置き、手術中の酸素飽和度と心拍数を監視します。心拍数は 200-500 bpm と酸素の飽和状態にする必要がある必要があります > 95%。

3. 無菌環境の準備

1. 顕微鏡下での外科領域を視覚化します。これは、顕微鏡は滅菌に環境が調整できませんのでで最初に行う必要があります。
2. 滅菌、手術用手袋を入れてください。滅菌機器、手術用ドレープ、ラットの体の外科領域以外は何も触れないでください。
3. ラットの体の上と無菌環境を作成する計測器のトレイには、滅菌ドレープを配置します。
4. 滅菌手袋と滅菌器のトレイに滅菌器具を配置します。

4. 左肺全摘術

1. 手術用覆布に小さな穴をカットするのにクーリー マヨはさみとジェラルド組織鉗子を使用します。穴は約 2-3 cm 切開を完全に可視化するのにする必要がありますが、大きすぎるので皮膚を殺菌のみが公開されること。
2. 左胸部外科ブレードを使用してで 2 cm くらい横切開を行います。止血の出血/維持を管理するのにガーゼや電気焼灼ペンを使用します。クーリー マヨはさみを使用して、肋骨と肋間筋を露出するまで組織の各層をカットします。
3. 肋間スペースを入力
   1. 第 3 肋筋を通して穴を作るためには、蚊を使用します。
   2. ダブル エンド ・ プローブを使用すると、肺動脈を視覚化する方法のうち肺を移動します。調査官は、肺動脈にアクセスできない場合、別の肋間スペースを入力可能性があります。
   3. 使用アイリスはさみと開く肋間筋に約 1-2 cm. マクファーソン Vannas アイリスはさみ (バックはさみ) は、任意の出血を止めるため電気焼灼ペンを使用します。
   4. 小さな、肋骨を保持するリトラクターを自己保持し、筋肉を開きます。
4. 左胸膜のみを開き、肺動脈と気管支へのアクセスを許可するように腹部の下下左肺に移動します。ライゲーティング クリップ アプリケータに媒体 hemoclip をロードします。
5. 左主気管支と左主肺動脈の結紮
   1. 肺動脈を公開する Wangensteen 非外科的鉗子で左肺の上の部分を慎重に持ち上げます。
   2. クリップと動脈周囲のアプリケータを閉じることによって肺動脈をクリップします。左奇静脈の破裂を閉じたりしないように注意します。固定しないでも強制的にそれ以外の場合、容器が破裂することができます。
   3. さらに筋線維を分離する扁桃を使用して切開を開きます。
   4. それは準備ができているのでライゲーティング クリップ アプリケータに別媒体 hemoclip をロードします。
   5. 非外科的鉗子を使用して、左主気管支と左肺静脈を視覚化するまで切開から肺の下の部分を持ち上げます。非外科的鉗子をする必要がありますプル、切開から肺を移動するために使用します。肺が大きすぎる組織を引き裂くことがなく 1 つの動きで引き出されるので問題鉗子はし非外科的鉗子が慎重に使用されてより多くの肺を引き出す場所で肺を保持する必要があります。
   6. 周りにアプリケータを閉じることによって一緒に左主気管支と左主肺静脈を結紮します。静脈、気管支も強制的にそれ以外の場合は固定しないで、容器が破裂することができます。
6. ハサミで肺を削除します。カットまたはクリップを引き裂くように注意してください。滅菌ガーゼの小片を使用して、任意の血液を吸収し、出血がないことを確認します。
7. 肋骨と肋間筋の閉鎖
   1. 肋間筋を閉じる前に第 7 肋と外科的切開から胸腔内に 16 G のカテーテルを挿入します。捜査官は、重要な臓器や血管を穿刺しないように針を可視化できることを確認します。
   2. 場所にカテーテルを残して針をすぐに削除します。これは、胸管として使用されます。
   3. 肋骨と肋間筋 4-0 プロレン縫合糸で閉じます。
   4. 皮膚と実行して (材料表) の 5-0 縫合糸で皮下の領域を閉じます。
   5. 肌と胸の周りの 5-0 縫合 (材料表) の場所管胸管が削除されると、穴が縛られるのでシャット ダウンします。
8. 胸部の負圧を取り戻すためにカテーテルを 3 mL 注射器で、胸腔内から空気を避難させます。すぐに空気が胸腔内に戻るを防ぐために針ホルダー付きカテーテルをクランプします。すぐにカテーテルを外し、穴を閉じるに縫合糸を結ぶ。

5. 術後の回復

1. 胸骨の位置に動物を配置します。イソフルランをオフに、気管内チューブを介してラット酸素を与え続けます。放置しないでください動物はいつまでそれは歩き回るために十分な意識を取り戻したが、動物は、そのケージに安全に。
2. 滅菌リンゲル液の 2-3 mL を皮下管理します。
3. モニター (≈200-500 bpm) の心拍数、酸素飽和度 (≥95%)、および動物を確認するための動物の色はよく呼吸します。
4. 動物自発呼吸の動きと首の動きを作り始めると、カテーテルを抜いて extubate 動物 (目拡大、移動、鼻耳音への対応など)、物理的な刺激に応答して人工呼吸器を外します。
5. 動物を他の動物の会社からの空ケージに戻ります。動物は、少なくとも 3 日間だけでする必要があります。
6. 疼痛コントロールのためには、3 日間のブプレノルフィンの 0.1 mg/kg、12 h に皮下を管理します。

6. 管理」2 番目のヒット"の MCT または Sugen

1. 皮下注射は、手術後 1 週間で 1 mL MCT (60 mg/kg) または 1 mL Sugen (25 mg/kg) を管理します。

7. ターミナル収穫

1. MCT または Sugen 投与後 7 週間は、流れる酸素 (1 L/分) および 4% イソフルランの商工会議所に動物を配置します。
2. 動物を鼻の円錐形によって人工呼吸器に接続します。酸素の流れを維持し、2.5-3% にイソフルランを下げます。彼の背中とすべての手足をテープに動物を置きます。
3. 腹部全体に沿って動物を剃る。
4. 胸を開く
   1. Xyphoid に鎖骨下の切欠きからメスで胸下切開を行います。
   2. 組織鉗子を使用して、xyphoid を保持します。心臓や肺動脈が完全にアクセス可能になるまで、クーリー マヨはさみで胸骨を切ってください。出血を止めるため、電気メスを使用します。収縮筋で肋骨を開くを保持します。
5. 肺動脈を特定します。必要に応じて、下にガーゼを追加することによって、心の向きを調整します。20 G IV カテーテルを肺動脈弁と肺動脈の分岐部と肺動脈を穿刺するのに使用します。のみ 20 G のカテーテルを動脈に進出し、針を削除します。1.2 Fr 遷音速圧カテーテルを肺動脈には IV カテーテルに進出します。PA 曲線が安定したは右心室の圧力を記録する手順の少なくとも 10 s. 繰り返しの圧力を記録します。
6. 心臓や肺を削除します。ホルマリン固定後パラフィン包埋してヘマトキシリンとエオシンで染色で肺の作品を配置します。

結果

受け入れられている分類体系では、肺高血圧症は、正常肺動脈圧 (すなわち、25 mm Hg) の上限を超える平均肺動脈圧 (mPAP) によって特徴付けられます。肺全摘術 + MCT グループでは、重症 PAH は日 21 増加 mPAP (図 1) によって開発されました。MPAP の式で計算されます。

ディスカッション

PAH の影響を受けた肺で新生内膜形成、肺動脈の閉塞血管の増殖結果重度の血行動態、右心不全、早期死亡率^7,8。血管壁への変更は、動脈と右心室の圧力の増加、血流への抵抗を高めます。PAH の初期の段階で通常 MCT または Sugen、管理後 3 週間ラット開発された内側の肥大、外の肥厚や小動脈および細動脈の muscularization のような非特異的な所見。?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Blade	Bard-Parker	371215	Incision
Forane (Isoflurane, USP)	Baxter	NDC 10019-360-40	anesthesia
BD Angiocath 16 G	BD	381157	intubation tube, chest tube
BD 1 mL Insulin Syringe	BD	329652	administer buprinex post-operatively
Biogel Surgeons Surgical Gloves	Biogel	30460-01	sterile surgical gloves
Wahl BravMini+ Trimmer	Braintree Scientific	CLP-41590 P	shave surgical site
SU5416	Cayman Chemical	13342	Sugen
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	EW-41723-02	light for intubation
Surgipro II 4-0 Suture	Covidien	VP831X	Closing intercostal muscles
Polysorb 5-0 Suture	Covidien	GL-885	Closing skin
Medium Slide Top Induction Chamber	DRE Veterinary	12570	oxygen & isoflurane delivery
DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine	DRE Veterinary	373	oxygen & isoflurane delivery
Small Vessel Cauterizer Kit	Fine Science Tools	18000-00	cauterizer to minimize bleeding
VentElite Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	55-7040	ventilator
MouseSTAT Jr	Kent Scientific	MSTAT-JR	pulse oximeter & heart rate monitor
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific	SPO2-MSE	pulse oximeter & heart rate paw sensor
PhysioSuite RightTemp	Kent Scientific	PS-02	temperature pad
PVP Prep Solution	Medline	MDS093944	Cleaning surgical site
Poly-lined Drape	Medline	NON21002Z	cover animal
3 mL syringe	Medline	SYR103010	administer fluids post-operatively
Microsurgical Kits, Integra	Miltex	95042-540	surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors
Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito	Miltex	17-2602	mosquito
Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL	Par Pharmaceutical	NDC 42023-179-01	Pain relief
Cooley-Mayo curved scissors	Pilling	352090	Large scissors
Gerald Tissue forceps	Pilling	351900	forceps
Wangesnsteen Tissue Forceps	Pilling	342929	atraumatic forceps
Pilling Thin Vascular Needle Holder	Pilling	354962DG	needle holder
Crotaline	Sigma-Aldrich	C2401-1G	MCT
Surflash 20 G IV Catheter	Terumo	SR*FF2051	For pressure reading during organ harvest
ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter	Transonic Inc	ADV500	Record pulmonary artery and right ventricle pressure
Medium Hemoclip	Weck	523700	ligate vessels
Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved	Weck Horizon	237081	hemoclip applicator
Surgical Microscope	Zeiss OPMI MD	1808	magnification