La pneumonectomia sinistra combinato con Monocrotaline o Sugen come un modello di ipertensione polmonare in ratti

Riepilogo

Il roditore pneumonectomy di sinistra è una tecnica importante nella ricerca di ipertensione polmonare. Qui, presentiamo un protocollo per descrivere la procedura di pneumonectomia di ratto e cura post-operatoria per garantire la mortalità e la morbosità minima.

Abstract

In questo protocollo, abbiamo dettaglio i passaggi procedurali corrette e le precauzioni necessarie per correttamente eseguire una pneumonectomia sinistra e indurre PAH in ratti con la somministrazione ulteriore di monocrotaline (MCT) o SU5416 (Sugen). Abbiamo anche confrontare questi due modelli per altri modelli PAH comunemente usati nella ricerca. Negli ultimi anni, lo stato attivo di modelli animali di PAH ha spostato verso lo studio del meccanismo di angioproliferation di lesioni plexiform, in cui il ruolo di flusso sanguigno polmonare aumentato è considerato come un importante trigger nello sviluppo di severa polmonare rimodellamento vascolare. Uno dei modelli più promettenti del roditore di flusso polmonare aumentato è il pneumonectomy di sinistra unilaterale combinato con un "secondo colpo" di MCT o Sugen. La rimozione del polmone di sinistra conduce a flusso sanguigno polmonare aumentato e turbolento e rimodellamento vascolare. Attualmente, non esiste alcuna procedura dettagliata della chirurgia pneumonectomia in ratti. Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo passo-passo della procedura chirurgica pneumonectomia e cure post-operatorie in ratti Sprague-Dawley maschi. Brevemente, l'animale è anestetizzato e viene aperto il torace. Una volta che l'arteria polmonare di sinistra, della vena polmonare e Bronco sono visualizzati, cui sono legati e il polmone di sinistra è stato rimosso. Quindi chiuso il petto e l'animale recuperato. Il sangue è costretto a circolare solo sul polmone di destra. Questo aumento della pressione vascolare conduce ad un progressivo rimodellamento ed occlusione delle piccole arterie polmonari. Il secondo colpo di MCT o Sugen è usata una settimana dopo l'intervento per indurre disfunzione endoteliale. La combinazione di aumento del flusso sanguigno nel polmone e nella disfunzione endoteliale produce gravi PAH. Il limite principale di questa procedura è che richiede abilità chirurgiche generali.

Introduzione

Ipertensione arteriosa polmonare (PAH) è una malattia progressiva e fatale, caratterizzata da un aumento nel flusso sanguigno polmonare, aumento della resistenza vascolare, l'infiammazione ed il ritocco di piccoli vasi sanguigni polmonari¹. Questo rimodellamento solitamente provoca lesioni vascolari che ostacolano e cancellare piccole arterie polmonari, provocando vasocostrizione e aumento di postcarico ventricolo di destra². Esistono pochi riusciti trattamenti farmacologici di IPA; di conseguenza, rimane elevato di mortalità correlata al PAH. Recentemente, il fuoco della ricerca il pathobiology di ipertensione polmonare si è spostato verso un meccanismo di angio-proliferazione in cui il ruolo di flusso sanguigno polmonare aumentato è considerato come un importante trigger nello sviluppo di polmonare vascolare rimodellamento^3,4.

Modelli animali di ipertensione polmonare hanno fornito le comprensioni critiche che aiutano a spiegare la patofisiologia della malattia e hanno servito come una piattaforma per droga, cella, gene e la proteina consegna. Tradizionalmente, il modello di ipertensione polmonare indotta da ipossia cronica e il modello di lesione polmonare MCT sono stati i modelli principali usati per studiare la patofisiologia PAH⁵. Tuttavia, essi non sono sufficienti per produrre pattern di flusso e neointimale sanguigno polmonare aumentato del rimodellamento rispetto ad alterazioni descritte in pazienti umani. Il modello di ipossia cronica nei roditori provoca ispessimento delle pareti del vaso con vasocostrizione ipossica senza angio-obliterazione dei vasi polmonari piccolo⁶. Inoltre, la condizione di ipossia è reversibile. Così, il modello di ipossia non è anche sufficiente a produrre gravi PAH. Il modello di lesione polmonare MCT suscitare qualche disfunzione endoteliale, ma le lesioni obliterative vascolari complesse trovate in esseri umani con PAH primario severo non si sviluppano in ratti². Inoltre, ratti trattati con MCT tendono a morire da tossicità MCT-indotta del polmone, malattia veno-occlusiva del fegato e miocardite anziché da PAH². Infine, la pneumonectomia da sola non è sufficiente a produrre lesioni neointimale nei piccoli vasi polmonari in un breve periodo di tempo. Dopo pneumonectomia, c'è la minima elevazione nella pressione arteriosa polmonare⁷. In esseri umani, la pneumonectomia è ben tollerato se il polmone controlaterale è sano⁷.

Tuttavia, la procedura di pneumonectomia sinistra combinata con MCT o Sugen è vantaggiosa poiché imita flusso sanguigno polmonare aumentato e risultati nel rimodellamento vascolare polmonare paragonabile a PAH clinico severo. La pneumonectomia è effettuata sul polmone di sinistra, che ha solo 1 lobo, piuttosto che sulla destra, che ha quattro lobi. Se il polmone di destra è stato rimosso, è possibile che l'animale sarebbe in grado di compensare l'insufficienza respiratoria. Nel modello di pneumonectomia-MCT neointimale modello di rimodellamento si sviluppa in oltre il 90% di animali operati trattati⁷. Allo stesso modo, la combinazione di risultati Sugen e pneumonectomia in PAH severa, caratterizzata da lesioni vascolari angio-obliterative, proliferazione, apoptosi e RV disfunzione⁸. La procedura di pneumonectomy di sinistra è anche vantaggiosa rispetto ad altre procedure chirurgiche per indurre PAH. In precedenza modelli descritti nei ratti per aumentare il flusso sanguigno polmonare ai polmoni includono dello shunt aorto-caval o anastomosi dell'arteria succlavia-polmonare. Questi modelli sono estremamente complicati^7,9,10,11. Per eseguire uno shunt aorto-cavale, addome dell'animale deve essere aperto. Lo shunt è posizionato nell'aorta addominale, che aumenta il flusso di sangue a tutti gli organi addominali invece solo i polmoni, quindi, PAH richiede molto più tempo per sviluppare. Inoltre, è difficile determinare il flusso di sangue attraverso lo shunt, considerando che con la pneumonectomia il flusso di sangue per le rimanenti doppie del polmone. L'anastomosi dell'arteria succlavia-polmonare ha anche molte complicazioni. Il flusso di sangue arterioso nella vena può condurre a trombosi di anastomosi e sanguinamento. Come lo shunt aorto-cavale, è difficile determinare il flusso di sangue attraverso l'anastomosi. Inoltre, è una tecnica costosa e difficile che richiede abilità chirurgiche vascolari. Il pneumonectomy di sinistra unilaterale raddoppia il flusso sanguigno e la sollecitazione di taglio nel polmone controlaterale e, in combinazione con MCT o Sugen, provoca i risultati emodinamici ed istopatologici tipici di PAH che è di danno delle cellule endoteliali^{8, 12}.

La novità di questo manoscritto è presentata nel protocollo chirurgico molto dettagliato ed esauriente del pneumonectomy di sinistra nel ratto e nella discussione delle sfide tecniche e fisiologiche di questi modelli. Perché questo protocollo non è attualmente disponibile, molti ricercatori credono che il modello è troppo difficile uso. Gli investigatori che si sono esibiti il pneumonectomy di sinistra hanno affrontato alta mortalità e tassi di morbosità connessi con l'inutile perdita di animali, compromettere la valutazione scientifica. Invece, molti utilizzerà modelli classici come MCT iniezione, ipossia cronica o appena la pneumonectomia per creare PAH. Tuttavia, questi modelli sono molto meno efficaci che la combinazione di MCT o Sugen con il pneumonectomy di sinistra. Lo scopo primario di questo articolo è di fornire il protocollo chirurgico prima dettagliato e riproducibile per la pneumonectomia sinistra unilaterale in ratti e fornire il migliore modello chirurgico di IPA. Combinando questo protocollo per pneumonectomy unilaterale di sinistra con MCT o SU5416 permetterà ai ricercatori di creare un modello molto più efficace e clinicamente rilevante di grave IPA per studiare la patogenesi di questa malattia mortale.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Le procedure descritte di seguito sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della scuola di medicina Icahn sul Monte Sinai. Tutti i ratti hanno ricevuto assistenza umana in conformità con il Monte Sinai "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio".

1. preparazione per la chirurgia

1. Autoclave Cooley-Mayo curvo: le forbici (grande), forbici Iris rette (piccole forbici), McPherson-Allerød Iris: le forbici (posteriore), Wangensteen tessuto forcipe (pinza atraumatica), pinze di Gerald, speculum filo normale (autoritenuta Retrattore), cauterizzatore piccolo vascello, garza, doppia sonda, vascolari sottili aghi e pinze emostatiche zanzara di Micro-Jacobson (zanzara).

2. preparazione e intubazione dei ratti

1. Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina analgesia (0,1 mg/kg) in ratti Sprague-Dawley maschi, di 6 – 8 settimane vecchio, 30 min prima della chirurgia.
2. Posizionare il ratto singolarmente in una camera esposta a isoflurano 4% e ossigeno (1 L/min) per 3 – 4 minuti fino a quando il ratto è adeguatamente anestetizzato (cioè, inconscio, respirare lentamente e non risponde al tocco o suono).
3. Intubazione di ratti
   1. Rimuovere il ratto dalla camera e nastro il topo a una tavola così il ratto adagiata sul dorso, con la bocca al bordo del bordo. Utilizzare stringa per contenere il ratto dai due denti davanti in modo che il collo rimane piatto/dritto.
   2. Posizionare una sorgente luminosa di fibra ottica oca sopra il collo sopra la laringe, sollevare e tenere la lingua con le dita e spostare l'epiglottide fino a visualizzare le corde vocali. La trachea dovrebbe essere illuminata dietro le corde vocali; regolare la posizione della luce fino a quando la trachea è luminosa.
   3. Intubare i ratti con l'inserimento di un catetere di 16 G nella laringe entro 60 s di rimozione ratto dalla camera come si svegliano rapidamente. Se il ratto si sveglia prima intubazione riuscita, rimettere il ratto e ripetere.
   4. Collegare immediatamente il ratto al ventilatore per riprendere il recapito di isoflurano e ossigeno. Confermare l'intubazione usando uno specchio freddo per osservare la condensazione dell'umidità in respiro esalato dal catetere. Assicurarsi che l'animale è ancora respirazione dall'espansione del torace.
4. Collegare il ratto al ventilatore. Impostare l'ossigeno al flusso a 1 L/min. impostata la frequenza di ventilazione su 70 respiri/min con un volume corrente di 0,35-0,45 mL. Impostare la pressione positiva di fine espirazione (PEEP) per 2 – 4 cm H₂O. Reduce isoflurano al 2 – 3%.
5. Posto il ratto sotto il microscopio in decubito destro su un rilievo di riscaldamento a 37 ° C. Le zampe anteriori del nastro verso il basso. Radere il torace di sinistra dietro la gamba anteriore fino alla fine della gabbia toracica con i clippers. Pulire l'area chirurgica con garza e 10% soluzione di povidone-iodio, seguiti da etanolo al 70% (tre volte).
6. Posizionare il pulsossimetro sul piede del ratto e monitorare la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno durante l'intervento chirurgico. Frequenza cardiaca dovrebbe essere tra i 200 – 500 bpm e saturazione dell'ossigeno deve essere > 95%.

3. preparazione dell'ambiente Sterile

1. Visualizzare l'area chirurgica al microscopio. Questo deve essere fatto prima perché il microscopio non può essere regolato una volta che l'ambiente è sterile.
2. Indossare guanti sterili, chirurgici. Non toccate nulla oltre a strumenti sterilizzati, teli chirurgici e l'area chirurgica del corpo del ratto.
3. Posizionare un telino sterile sul corpo del ratto e il ripiano di strumento per creare un ambiente sterile.
4. Con guanti sterili, collocare strumenti sterili sul vassoio strumento sterile.

4. procedura chirurgica pneumonectomia sinistra

1. Consente di tagliare un piccolo foro nel telo chirurgico Cooley-Mayo forbici e pinze di Gerald. Il foro deve essere circa 2 – 3 cm di diametro per visualizzare completamente l'incisione ma non troppo grande così che solo sterilizzato pelle è esposta.
2. Fare un'incisione lungo laterale di 2 cm nel torace sinistro utilizzando una lama chirurgica. Utilizzare la penna elettrocauterizzazione e garza per gestire sanguinamento/mantenere l'emostasi. Utilizzare le forbici di Cooley-Mayo per tagliare ogni strato di tessuto fino a quando le costole e muscoli intercostali sono esposti.
3. Inserimento spazio intercostale
   1. Utilizzare la zanzara per fare un buco attraverso il muscolo del terzo spazio intercostale.
   2. Utilizzare la sonda doppia per spostare il polmone fuori del modo di visualizzare l'arteria polmonare. Lo sperimentatore può immettere un altro spazio intercostale se l'arteria polmonare non è accessibile.
   3. Forbici iris uso e McPherson-Allerød iris: le forbici (posteriore) per aprire i muscoli intercostali a circa 1 – 2 cm. è possibile utilizzare la penna elettrocauterizzazione per bloccare qualsiasi emorragia.
   4. Posizionare un piccolo, autoritenuta riavvolgitore per contenere le costole e muscoli aprire.
4. Aprire solo la pleura di sinistra e spostare il polmone di sinistra in basso nell'addome per consentire l'accesso all'arteria polmonare e Bronco. Caricare un hemoclip medio nell'applicatore clip legatura.
5. Legatura del bronco principale di sinistra e dell'arteria polmonare sinistra
   1. Sollevare con cura la parte superiore del polmone sinistro con la pinza atraumatica Wangensteen per esporre l'arteria polmonare.
   2. Agganciare l'arteria polmonare chiudendo la clip e applicatore intorno all'arteria. Fare attenzione a non chiudere o rottura della vena azygos sinistra. Non stringere troppo energicamente in caso contrario, la nave può rompersi.
   3. Aprire l'incisione ulteriormente utilizzando la tonsilla per separare le fibre muscolari.
   4. Caricare un altro media hemoclip nell'applicatore clip legatura in modo che è pronto.
   5. Utilizzare la pinza atraumatica per sollevare la parte inferiore del polmone fuori l'incisione fino al bronco principale di sinistra e la vena polmonare di sinistra sono visualizzati. Atraumatica deve essere utilizzato tirare per spostare il polmone e fuori l'incisione. Poiché il polmone è troppo grande per essere tirato fuori in un unico movimento senza strappare il tessuto, il forcipe di problema sono necessario per tenere il polmone in posizione mentre la pinza atraumatica vengono utilizzati con attenzione per estrarre più del polmone.
   6. Legare insieme il bronco principale di sinistra e la vena polmonare principale sinistra chiudendo l'applicatore intorno a loro. Non stringete la vena ed il Bronco troppo energicamente altrimenti, la nave può rompersi.
6. Rimuovere il polmone con le forbici. Fare attenzione a non tagliare o strappare la clip. Utilizzare un piccolo pezzo di garza sterile per assorbire qualsiasi sangue e assicurarsi che non vi è alcun sanguinamento.
7. Chiusura delle costole e muscoli intercostali
   1. Prima di chiudere i muscoli intercostali, inserire un catetere 16g nella cavità toracica lontano l'incisione chirurgica e nel settimo spazio intercostale. Verificare che lo sperimentatore può visualizzare l'ago per non forare eventuali organi vitali o vasi.
   2. Rimuovere immediatamente l'ago, lasciando il catetere in posizione. Questo fungerà da un tubo della cassa.
   3. Chiudere le costole e muscoli intercostali con una sutura in prolene 4 / 0.
   4. Chiudere la pelle e spazio sottocutaneo con un suturare corrente 5-0 (Tabella materiali).
   5. Posto un 5-0 suturare (Tabella materiali) nella pelle e intorno alla cassa del tubo così quando viene rimosso il tubo della cassa, il foro sarà legato chiuso.
8. Evacuare l'aria dalla cavità pleurica con una siringa da 3 mL attraverso il catetere di riprendere la normale pressione negativa nel torace. Immediatamente Clampare il catetere con un porta-aghi per impedire l'aria che sta ritornando nella cavità toracica. Rimuovere il catetere rapidamente e legare la sutura per chiudere il foro.

5. post-operatorio recupero

1. Mettere l'animale in posizione sternale. Spegnere l'isoflurano, ma continuare a dare l'ossigeno di ratto tramite tubo endotracheale. Non lasciare l'animale incustodito in qualsiasi momento fino a quando ha riacquistato sufficiente coscienza per deambulare e l'animale è sicuro nella sua gabbia.
2. Somministrare per via sottocutanea 2 – 3 mL di soluzione sterile di Ringer lattato.
3. Monitorare la frequenza cardiaca (bpm ≈ 200 – 500), la saturazione dell'ossigeno (≥ 95%) e animale di colore per confermare l'animale è respirare bene.
4. Quando l'animale inizia a fare movimenti di respirazione spontanea e movimenti del collo e risponde a stimoli fisici (ad esempio, allargando gli occhi, naso in movimento e orecchie risponde al suono), estubare l'animale tirando fuori il catetere e scollega il ventilatore.
5. Restituire l'animale a una gabbia vuota, dalla compagnia di altri animali. L'animale dovrebbe essere solo per almeno 3 giorni.
6. Per il controllo del dolore, è necessario somministrare 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea ogni 12 h per 3 giorni.

6. amministrazione del "Secondo colpo" MCT o Sugen

1. Somministrare 1 mL di MCT (60 mg/kg) o 1 mL di Sugen (25 mg/kg) tramite iniezione sottocutanea, 1 settimana dopo l'intervento chirurgico.

7. terminale Harvest

1. Sette settimane dopo la somministrazione di MCT o Sugen, metti l'animale in una camera con ossigeno che scorre (1 L/min) e 4% isoflurane.
2. Collegare l'animale al ventilatore tramite cono di naso. Mantenere il flusso di ossigeno e abbassare l'isoflurano a 2,5-3%. Posare l'animale sulla sua schiena e il nastro verso il basso tutte le membra.
3. Radere l'animale lungo tutto l'addome.
4. Apertura sul petto
   1. Fare un'incisione lungo il petto con un bisturi dalla tacca subclavian per il xyphoid.
   2. Utilizzare le pinze per tenere il xyphoid. Tagliare lo sterno con le forbici di Cooley-Mayo fino a quando il cuore e l'arteria polmonare sono completamente accessibili. Utilizzare l'elettrocauterizzazione per fermare l'emorragia. Tenere che le costole aprire con un retrattore.
5. Identificare l'arteria polmonare. Se necessario, regolare l'orientamento del cuore, con l'aggiunta di garza sotto. Utilizzare un catetere IV 20 G per puntura dell'arteria polmonare fra la valvola polmonare e la biforcazione dell'arteria polmonare principale. Far avanzare solo il catetere 20g nell'arteria e rimuovere l'ago. Avanzare il catetere di pressione transonico Fr 1,2 in IV catetere in arteria polmonare. Una volta che la curva di PA è costante, registrare la pressione per almeno 10 s. Ripetere questi passaggi per registrare la pressione nel ventricolo destro.
6. Rimuovere il cuore ed i polmoni. Posto pezzi di polmone in formalina per essere riparato in paraffina e colorati con ematossilina ed eosina.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Secondo il sistema di classificazione accettata, l'ipertensione polmonare è caratterizzata da una pressione media dell'arteria polmonare (mPAP) che superano i limiti superiori di pressione normale dell'arteria polmonare (cioè, 25 mm Hg). Nel gruppo MCT + pneumonectomia, PAH severo sviluppato da giorno 21 con un'aumentata mPAP (Figura 1). Il mPAP è calcolata mediante la formula:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

In polmoni affetti da PAH, proliferazione vascolare con formazione di neointima e l'obliterazione delle arterie polmonari causare gravi alterazioni emodinamiche, insufficienza ventricolare destra e precoce mortalità^7,8. Le modifiche alle pareti del vaso aumentano la resistenza al flusso del sangue, aumento della pressione arteriosa e ventricolare destra. Nelle fasi iniziali della PAH, solitamente 3 settimane dopo la somministrazione di MCT o Sugen, ratti hanno s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Blade	Bard-Parker	371215	Incision
Forane (Isoflurane, USP)	Baxter	NDC 10019-360-40	anesthesia
BD Angiocath 16 G	BD	381157	intubation tube, chest tube
BD 1 mL Insulin Syringe	BD	329652	administer buprinex post-operatively
Biogel Surgeons Surgical Gloves	Biogel	30460-01	sterile surgical gloves
Wahl BravMini+ Trimmer	Braintree Scientific	CLP-41590 P	shave surgical site
SU5416	Cayman Chemical	13342	Sugen
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	EW-41723-02	light for intubation
Surgipro II 4-0 Suture	Covidien	VP831X	Closing intercostal muscles
Polysorb 5-0 Suture	Covidien	GL-885	Closing skin
Medium Slide Top Induction Chamber	DRE Veterinary	12570	oxygen & isoflurane delivery
DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine	DRE Veterinary	373	oxygen & isoflurane delivery
Small Vessel Cauterizer Kit	Fine Science Tools	18000-00	cauterizer to minimize bleeding
VentElite Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	55-7040	ventilator
MouseSTAT Jr	Kent Scientific	MSTAT-JR	pulse oximeter & heart rate monitor
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific	SPO2-MSE	pulse oximeter & heart rate paw sensor
PhysioSuite RightTemp	Kent Scientific	PS-02	temperature pad
PVP Prep Solution	Medline	MDS093944	Cleaning surgical site
Poly-lined Drape	Medline	NON21002Z	cover animal
3 mL syringe	Medline	SYR103010	administer fluids post-operatively
Microsurgical Kits, Integra	Miltex	95042-540	surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors
Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito	Miltex	17-2602	mosquito
Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL	Par Pharmaceutical	NDC 42023-179-01	Pain relief
Cooley-Mayo curved scissors	Pilling	352090	Large scissors
Gerald Tissue forceps	Pilling	351900	forceps
Wangesnsteen Tissue Forceps	Pilling	342929	atraumatic forceps
Pilling Thin Vascular Needle Holder	Pilling	354962DG	needle holder
Crotaline	Sigma-Aldrich	C2401-1G	MCT
Surflash 20 G IV Catheter	Terumo	SR*FF2051	For pressure reading during organ harvest
ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter	Transonic Inc	ADV500	Record pulmonary artery and right ventricle pressure
Medium Hemoclip	Weck	523700	ligate vessels
Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved	Weck Horizon	237081	hemoclip applicator
Surgical Microscope	Zeiss OPMI MD	1808	magnification