A pneumonectomia esquerda combinado com Monocrotaline ou Sugen como modelo de hipertensão pulmonar em ratos

Resumo

A roedor pneumonectomia esquerda é uma técnica valiosa na investigação de hipertensão pulmonar. Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o procedimento de pneumonectomia de rato e cuidados pós-operatórios para garantir mínima morbidade e mortalidade.

Resumo

Neste protocolo, detalhamos os passos processuais corretos e precauções necessárias para com êxito executar uma pneumonectomia esquerda e induzir PAH em ratos com a administração adicional de monocrotaline (MCT) ou SU5416 (Sugen). Podemos também comparar esses dois modelos para outros modelos PAH comumente utilizados na investigação. Nos últimos anos, o foco dos modelos animais PAH mudou-se para estudar o mecanismo de angioproliferation de lesões plexiforme, no qual o papel do fluxo sanguíneo pulmonar aumentado é considerado como um gatilho importante no desenvolvimento da severa pulmonar remodelação vascular. Um dos mais promissores modelos de roedores de hiperfluxo pulmonar é a pneumonectomia esquerda unilateral, combinada com um hit"segundo" do MCT ou Sugen. A remoção do pulmão esquerdo leva ao fluxo sanguíneo pulmonar aumentado e turbulento e remodelação vascular. Atualmente, não há nenhum procedimento detalhado da cirurgia pneumonectomia em ratos. Este artigo detalha um protocolo passo a passo do procedimento cirúrgico pneumonectomia e cuidados pós-operatórios em ratos Sprague Dawley masculinos. Resumidamente, o animal é anestesiado e o peito é aberto. Uma vez que a artéria pulmonar esquerda, veia pulmonar e brônquio são visualizados, eles são ligados e o pulmão esquerdo é removido. Em seguida, fechado no peito e o animal recuperado. O sangue é forçado a circular apenas no pulmão direito. Este aumento da pressão vascular leva a uma remodelação progressivo e oclusão de pequenas artérias pulmonares. O segundo hit do MCT ou Sugen é usado uma semana depois da cirurgia para induzir disfunção endotelial. A combinação do aumento do fluxo sanguíneo no pulmão e disfunção endotelial produz grave PAH. A principal limitação deste procedimento é que ele requer habilidades cirúrgicas gerais.

Introdução

Hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença progressiva e fatal, caracterizada por um aumento no fluxo sanguíneo pulmonar, aumento da resistência vascular, inflamação e remodelação de pequenos vasos sanguíneos pulmonares¹. Esta remodelação geralmente resulta em lesões vasculares que obstruam e obliterar pequenas artérias pulmonares, causando vasoconstrição e aumento de pós-carga do ventrículo direito². Existem alguns tratamentos farmacológicos bem sucedidos de PAH; Como consequência, restos de mortalidade PAH altas. Recentemente, o foco da pesquisa sobre a Patobiológico da hipertensão pulmonar mudou-se para um mecanismo de angio-proliferação, em que o papel do fluxo sanguíneo pulmonar aumentado é considerado como um gatilho importante no desenvolvimento da pulmonar vascular remodelação de^3,4.

Modelos animais de hipertensão pulmonar forneceram introspecções críticas que ajudam a explicar a fisiopatologia da doença e têm servido como uma plataforma para a droga, celular, gene e entrega de proteína. Tradicionalmente, o modelo de hipertensão pulmonar induzida pela hipóxia crônica e o modelo de lesão pulmonar MCT têm sido os principais modelos utilizados para estudar PAH fisiopatologia⁵. No entanto, eles não são suficientes para produzir o padrão de fluxo e neointimal de sangue pulmonar aumentada de remodelação em relação às alterações descritas em pacientes humanos. O modelo de hipóxia crônica em roedores resulta em espessamento das paredes de vasos com vasoconstrição hipóxica sem angio-obliteração dos pequenos vasos pulmonares⁶. Além disso, a condição de hipóxia é reversível. Assim, o modelo de hipóxia não também é suficiente para produzir grave PAH. O modelo de lesão pulmonar MCT provocar alguma disfunção endotelial mas complexas vasculares obliterative lesões encontradas em humanos com HAP primária grave não desenvolvem no²ratos. Além disso, os ratos tratados com MCT tendem a morrer de toxicidade pulmonar induzida pelo MCT, doença hepática veno-oclusiva e miocardite em vez de PAH². Finalmente, a pneumonectomia sozinha não é suficiente para produzir lesões neointimal em pequenos vasos pulmonares em um curto período de tempo. Depois a pneumonectomia, há mínima elevação na pressão arterial pulmonar⁷. Em humanos, a pneumonectomia é bem tolerada quando o pulmão contralateral é saudável⁷.

No entanto, o procedimento de pneumonectomia esquerda combinado com MCT ou Sugen é vantajoso uma vez que imita o fluxo sanguíneo pulmonar aumentado e resulta em remodelação vascular pulmonar comparável à Hap clínica grave. A pneumonectomia é executada no pulmão esquerdo, que tem apenas 1 lobo, em vez do direito, que possui quatro lóbulos. Se o pulmão direito foi removido, o animal seria incapaz de compensar a insuficiência respiratória. No modelo de pneumonectomia-MCT, neointimal padrão de remodelação desenvolve-se em mais de 90% dos animais operados tratados⁷. Da mesma forma, a combinação dos resultados Sugen e pneumonectomia em HAP grave, caracterizada por lesões vasculares angio-obliterative, proliferação, apoptose e RV disfunção⁸. O procedimento de pneumonectomia esquerda também é vantajoso em comparação com outros procedimentos cirúrgicos para induzir PAH. Anteriormente descritos modelos em ratos para aumentar o fluxo sanguíneo pulmonar para os pulmões incluem o aorto-caval shunt ou anastomose da artéria subclávia-pulmonar. Estes modelos são extremamente complicado^7,9,10,11. Para realizar uma derivação aorto-caval, abdômen do animal tem que ser aberto. O shunt é colocado na aorta abdominal, que aumenta o fluxo sanguíneo para os órgãos abdominais em vez de apenas os pulmões, assim, PAH leva muito mais tempo para desenvolver. Além disso, é difícil determinar o fluxo de sangue através do shunt, Considerando que com a pneumonectomia, o sangue flui para as restantes duplas de pulmão. A anastomose da artéria subclávia-pulmonar também tem muitas complicações. O fluxo de sangue arterial na veia pode levar a trombose da anastomose e sangramento. Como a derivação aorto-caval, é difícil determinar o fluxo de sangue através da anastomose. Além disso, é uma técnica difícil e cara que requer habilidades cirúrgicas vasculares. A pneumonectomia esquerda unilateral duplica o fluxo sanguíneo e da tensão de cisalhamento no pulmão contralateral e, em combinação com MCT ou Sugen, faz com que os resultados típicos de hemodinâmicos e histopatológicos de PAH, que é a célula endotelial dano^{8, 12}.

A novidade deste manuscrito é apresentada no protocolo cirúrgico muito detalhado e abrangente da pneumonectomia esquerda em ratos e na discussão dos desafios técnicos e fisiológicos destes modelos. Porque este protocolo não está atualmente disponível, muitos investigadores acreditam que o modelo é muito difícil usar. Os investigadores que tenham realizado a pneumonectomia esquerda têm enfrentado alta mortalidade e taxas de morbidade associadas com a perda desnecessária de animais, comprometendo a avaliação científica. Em vez disso, muitos vai usar modelos clássicos como MCT injeção, hipóxia crônica ou apenas a pneumonectomia criar PAH. No entanto, estes modelos são muito menos eficazes do que a combinação de MCT ou Sugen com a pneumonectomia esquerda. O objetivo principal deste artigo é fornecer o protocolo cirúrgico primeiro detalhado e reproduzível para a pneumonectomia esquerda unilateral em ratos e fornecer o melhor modelo cirúrgico de PAH. Combinar este protocolo para pneumonectomia unilateral à esquerda com MCT ou SU5416 permitirá que os investigadores criar um modelo muito mais eficaz e clinicamente relevante de grave PAH para estudar a patogênese desta doença fatal.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da faculdade de medicina da Icahn no Monte Sinai. Todos os ratos receberam atendimento humano em conformidade com o Monte Sinai "Guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório".

1. preparação para a cirurgia

1. Autoclave Cooley-Mayo curvo tesoura (grande tesoura), tesoura de íris reta (tesoura pequena), tesoura Iris McPherson-Vannas (tesoura de costas), fórceps de tecido Rehbein (Pinças atraumáticas), fórceps do tecido do Gerald, espéculo fio liso (auto de retenção retractor), cauterizador de pequeno vaso, gaze, duas extremidades sonda, da fina agulha vascular e pinça hemostática de Micro-Jacobson mosquito (mosquito).

2. preparação e intubação de ratos

1. Administre uma injeção subcutânea de analgesia de buprenorfina (0,1 mg/kg) em ratos de Sprague-Dawley machos, 6 – 8 semanas de idade, 30 min antes da cirurgia.
2. Coloque o rato individualmente em uma câmara exposta a 4% de isoflurano e oxigênio (1 L/min) por 3 – 4 min até que o rato está devidamente anestesiado (ou seja, inconsciente, respirando lentamente e não responde ao toque ou som).
3. Intubação de ratos
   1. Remover o rato da câmara e o rato para uma placa de fita para que o rato plana deita de costas, com a boca na borda da placa. Use a sequência de caracteres para segurar o rato pelos dois dentes da frente para que o pescoço permanece plana-hetero.
   2. Coloque uma fonte de luz da fibra óptica ganso acima do pescoço sobre a laringe, levantar e segurar a língua com os dedos e mover a epiglote para visualizar as cordas vocais. A traqueia deve ser iluminada por trás das cordas vocais; ajuste a posição da luz até a traqueia é brilhante.
   3. Entubar os ratos inserindo um cateter 16G a laringe dentro 60 s de remoção o rato da câmara como acordam rapidamente. Se o rato acorda antes da intubação bem sucedida, volte a colocar o rato e repita.
   4. Imediatamente, ligue o rato ao ventilador para retomar a entrega de isoflurano e oxigênio. Confirme a intubação usando um espelho frio para observar a condensação da umidade no ar exalado do cateter. Certifique-se que o animal ainda é respirar pela expansão do tórax.
4. Ligue o rato ao ventilador. Definir o oxigênio flua em 1 L/min. definir a taxa de ventilação de 70 respirações por minuto com um volume tidal de 0,35 – 0,45 mL. Conjunto de pressão expiratória final positiva (PEEP) para 2-4 cm H₂o isoflurano O. reduzir para 2-3%.
5. Coloque o rato sob o microscópio na posição de decúbito direito sobre uma almofada de aquecimento a 37 ° C. Tape as pernas dianteiras para baixo. Depilar o tórax esquerdo para trás a perna da frente até o final da caixa torácica com clippers. Limpe a área cirúrgica com gaze e 10% solução de iodo-povidona, seguida por 70% de etanol (três vezes).
6. Coloque o oxímetro de pulso no pé do rato e monitorar a frequência cardíaca e saturação de oxigênio durante a cirurgia. Frequência cardíaca deve estar entre 200-500 bpm e oxigênio de saturação deve ser > 95%.

3. preparação do ambiente estéril

1. Visualize a área cirúrgica sob o microscópio. Isto deve ser feito primeiro, porque não pode ser ajustado ao microscópio, uma vez que o ambiente é estéril.
2. Colocar luvas estéreis, cirúrgicas. Não toque em nada além dos instrumentos esterilizados, a e cirúrgicos da área cirúrgica do corpo do rato.
3. Coloque um pano estéril sobre o corpo do rato e na bandeja do instrumento para criar um ambiente estéril.
4. Com luvas estéreis, coloque instrumentos esterilizados sobre a bandeja de instrumentos esterilizados.

4. esquerdo pneumonectomia procedimento cirúrgico

1. Use tesoura Cooley-Mayo e Gerald tecido fórceps cortar um furo pequeno no cirúrgico drapeja. O furo deve estar a cerca de 2 – 3 cm de diâmetro para visualizar totalmente a incisão, mas não muito grande para que apenas esterilizados a pele é exposta.
2. Fazer uma incisão longa lateral de 2 cm no tórax esquerdo usando uma lâmina cirúrgica. Use gaze e a caneta eletrocautério para gerenciar hemostasia sangramento/manter. Use a tesoura de Cooley-Mayo para cortar cada camada de tecido até as costelas e músculos intercostais são expostos.
3. Entrando no espaço Intercostal
   1. Use o mosquito para fazer um furo através do músculo do terceiro espaço intercostal.
   2. Use a sonda de dupla ponta para mover o pulmão do caminho para visualizar a artéria pulmonar. O investigador pode entrar outro espaço intercostal se a artéria pulmonar não é acessível.
   3. Tesoura de íris uso e McPherson-Vannas tesoura de íris (tesoura de costas) para abrir os músculos intercostais para aproximadamente 1 – 2 cm. Use a caneta eletrocautério para parar qualquer sangramento.
   4. Coloque um pequeno, auto retenção afastador para segurar as costelas e músculos abra.
4. Abra apenas a pleura esquerda e mova o pulmão esquerdo baixo no abdômen para permitir o acesso à artéria pulmonar e brônquio. Carrega um hemoclip médio para o aplicador de clip ligating.
5. Ligadura do brônquio principal esquerdo e artéria pulmonar esquerda
   1. Levante a parte superior do pulmão esquerdo cuidadosamente com a pinça atraumática de Rehbein para expor a artéria pulmonar.
   2. Clip a artéria pulmonar, fechando o clipe e o aplicador em torno da artéria. Tenha cuidado para não fechar ou romper a veia Ázigos à esquerda. Não fixar demasiada força caso contrário, a embarcação pode romper.
   3. Abra a incisão mais usando a tonsila para separar as fibras musculares.
   4. Carrega outro hemoclip médio para o aplicador de clip ligating para que está pronto.
   5. Use a pinça atraumática para levantar a parte inferior do pulmão fora a incisão até o brônquio principal esquerdo e a veia pulmonar esquerda são visualizados. Pinça atraumática deve ser usado puxar para mover o pulmão, cima e para fora da incisão. Desde que o pulmão é muito grande para ser puxado para fora em um movimento sem rasgar o tecido, a pinça de emissão é necessária para manter o pulmão no lugar enquanto a pinça atraumática é usada com cuidado para retirar mais pulmão.
   6. Ligam o brônquio principal esquerdo e a veia pulmonar principal esquerda juntos, fechando o aplicador em torno deles. Não fixar a veia e brônquio também com força de caso contrário, a embarcação pode romper.
6. Remova o pulmão com uma tesoura. Tenha cuidado para não cortar ou arrancar o clipe. Use um pequeno pedaço de gaze esterilizada para absorver qualquer sangue e certifique-se de que não há nenhuma hemorragia.
7. Encerramento das costelas e músculos intercostais
   1. Antes de fechar os músculos intercostais, inserir um cateter 16G na cavidade torácica, longe da incisão cirúrgica e no sétimo espaço intercostal. Certifique-se que o investigador pode visualizar a agulha para não perfurar qualquer órgãos vitais ou vasos.
   2. Retire imediatamente a agulha, deixando o cateter no lugar. Isso será usado como um dreno de tórax.
   3. Feche as costelas e músculos intercostais com uma sutura de prolene 4-0.
   4. Feche a pele e subcutâneo espaço com uma sutura de execução 5-0 (Tabela de materiais).
   5. Lugar uma sutura de 5-0 (Tabela de materiais) na pele e em torno do peito do tubo, então quando o tubo é removido, o buraco vai ser amarrado fechar.
8. Evacue o ar da cavidade pleural com uma seringa de 3 mL através do cateter para recuperar a pressão negativa normal no tórax. Imediatamente, prenda o cateter com um porta-agulha para evitar o ar de volta na cavidade torácica. Remover o cateter rapidamente e amarrar a sutura para fechar o buraco.

5. no pós-operatório recuperação

1. Coloque o animal na posição esternal. Desligar o isoflurano, mas continue dando o oxigênio do rato através do tubo endotraqueal. Não deixe o animal sem vigilância em qualquer ponto até que ele recuperou a consciência suficiente para deambular e o animal com segurança em sua jaula.
2. Administre 2-3 mL de solução de Ringer lactato estéril por via subcutânea.
3. Monitorar a frequência cardíaca (bpm ≈200 – 500), saturação de oxigênio (≥ 95%), e animal cor para confirmar o animal está a respirar bem.
4. Quando o animal começa a fazer movimentos de respiração espontânea e movimentos do pescoço e responde a estímulos físicos (tais como olhos alargando, movendo-se de nariz e orelhas respondendo ao som), os tubos do animal, puxando para fora o cateter e desconectar o ventilador.
5. Devolver o animal para uma gaiola vazia, longe da companhia de outros animais. O animal deve ficar sozinho pelo menos 3 dias.
6. Para controle da dor, administre 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea a cada 12 h por 3 dias.

6. administração do "Segundo golpe" MCT ou Sugen

1. Administre 1 mL de MCT (60 mg/kg) ou 1 mL de Sugen (25 mg/kg) via subcutânea, 1 semana após a cirurgia.

7. terminal colheita

1. Sete semanas após a administração de MCT ou Sugen, coloque o animal em uma câmara com fluxo de oxigênio (1 L/min) e 4% de isoflurano.
2. Conecte o animal ao ventilador através do cone de nariz. Manter o fluxo de oxigênio e abaixar o isoflurano para 2,5-3%. Coloque o animal em suas costas e fita para baixo todos os membros.
3. Raspe o animal ao longo do abdômen inteiro.
4. Abrindo o peito
   1. Fazer uma incisão no peito com um bisturi do notch subclávia para o xyphoid.
   2. Use a pinça de tecido para manter o xyphoid. Corte o esterno com a tesoura de Cooley-Mayo até o coração e a artéria pulmonar são totalmente acessíveis. Use o eletrocautério para parar o sangramento. Segure que as costelas abrir com um afastador.
5. Identifica a artéria pulmonar. Ajuste a orientação do coração, se necessário, pela adição de gaze por baixo. Use um cateter IV de 20g para punção da artéria pulmonar entre a válvula pulmonar e a bifurcação da artéria pulmonar principal. Avançar apenas o cateter 20G na artéria e retire a agulha. Avance o cateter de pressão Transônica de Fr 1.2 no cateter IV que é a artéria pulmonar. Uma vez que a curva de PA é constante, grave a pressão pelo menos 10 s. Repita estes passos para registar a pressão no ventrículo direito.
6. Remova o coração e os pulmões. Coloque pedaços do pulmão em formol para ser fixado em parafina e corados com hematoxilina e eosina.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

De acordo com o sistema de classificação aceites, hipertensão pulmonar caracteriza-se por uma pressão média de artéria pulmonar (PAPm) excedeu os limites superiores da pressão normal de artéria pulmonar (i.e., 25 mm Hg). No grupo MCT + pneumonectomia, grave PAH desenvolvido por dia 21, com um aumento PAPm (Figura 1). A PAPm é calculado pela fórmula:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Nos pulmões afetados PAH, proliferação vascular com formação neointimal e obliteração das artérias pulmonares resultar em graves alterações hemodinâmicas, insuficiência ventricular direita e precoce mortalidade^7,8. As alterações às paredes do vaso aumentam a resistência ao fluxo sanguíneo, aumentando a pressão arterial e ventrículo direito. Nas fases iniciais de PAH, geralmente 3 semanas após a administração de MCT ou Sugen, ratos desenvolve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Blade	Bard-Parker	371215	Incision
Forane (Isoflurane, USP)	Baxter	NDC 10019-360-40	anesthesia
BD Angiocath 16 G	BD	381157	intubation tube, chest tube
BD 1 mL Insulin Syringe	BD	329652	administer buprinex post-operatively
Biogel Surgeons Surgical Gloves	Biogel	30460-01	sterile surgical gloves
Wahl BravMini+ Trimmer	Braintree Scientific	CLP-41590 P	shave surgical site
SU5416	Cayman Chemical	13342	Sugen
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	EW-41723-02	light for intubation
Surgipro II 4-0 Suture	Covidien	VP831X	Closing intercostal muscles
Polysorb 5-0 Suture	Covidien	GL-885	Closing skin
Medium Slide Top Induction Chamber	DRE Veterinary	12570	oxygen & isoflurane delivery
DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine	DRE Veterinary	373	oxygen & isoflurane delivery
Small Vessel Cauterizer Kit	Fine Science Tools	18000-00	cauterizer to minimize bleeding
VentElite Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	55-7040	ventilator
MouseSTAT Jr	Kent Scientific	MSTAT-JR	pulse oximeter & heart rate monitor
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific	SPO2-MSE	pulse oximeter & heart rate paw sensor
PhysioSuite RightTemp	Kent Scientific	PS-02	temperature pad
PVP Prep Solution	Medline	MDS093944	Cleaning surgical site
Poly-lined Drape	Medline	NON21002Z	cover animal
3 mL syringe	Medline	SYR103010	administer fluids post-operatively
Microsurgical Kits, Integra	Miltex	95042-540	surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors
Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito	Miltex	17-2602	mosquito
Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL	Par Pharmaceutical	NDC 42023-179-01	Pain relief
Cooley-Mayo curved scissors	Pilling	352090	Large scissors
Gerald Tissue forceps	Pilling	351900	forceps
Wangesnsteen Tissue Forceps	Pilling	342929	atraumatic forceps
Pilling Thin Vascular Needle Holder	Pilling	354962DG	needle holder
Crotaline	Sigma-Aldrich	C2401-1G	MCT
Surflash 20 G IV Catheter	Terumo	SR*FF2051	For pressure reading during organ harvest
ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter	Transonic Inc	ADV500	Record pulmonary artery and right ventricle pressure
Medium Hemoclip	Weck	523700	ligate vessels
Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved	Weck Horizon	237081	hemoclip applicator
Surgical Microscope	Zeiss OPMI MD	1808	magnification