Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью этого протокола является использование температуры для управления скоростью потока трехмерных активных жидкостей. Преимущество этого метода не только позволяет регулировать скорость потока на месте, но и позволяет динамический контроль, такие как периодические настройки скорости потока вверх и вниз.

Аннотация

Мы представляем метод использования температуры для настройки скорости потока кинезина, основанной на микротрубах трехмерных (3D) активных жидкостей. Этот метод позволяет для настройки скорости на месте без необходимости производства новых образцов для достижения различных желаемых скоростях. Кроме того, этот метод позволяет динамическое управление скоростью. Велоспорт температура приводит жидкости течь быстро и медленно, периодически. Эта управляемость основана на характеристике Arrheus реакции кинезин-микротрубуле, демонстрируя контролируемый средний диапазон скорости потока 4-8 мкм/с. Представленный метод откроет дверь к конструкции микрофлюидных устройств, где скорость потока в канале локально настраивается без необходимости клапана.

Введение

Активная материя отличается от обычной пассивной материи из-за его способности преобразовывать химическую энергию в механическую работу. Материал, обладающий такой способностью, может состоять из живых или неживых существ, таких как бактерии, насекомые, коллоиды, зерна и цитоскелетные нити1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Эти материальные сущности взаимодействуют со своими соседями. В более широком масштабе они самоорганизуются либо в турбулентные вихри (активная турбулентность), либо материальные потоки11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Понимание самоорганизации активной материи привело к различным применениям в молекулярных челноках, оптических приборах и параллельных вычислениях21,22,23. Для того, чтобы довести приложения до следующего уровня, требуется контроль, выходящие за рамки самоорганизации. Например, Palacci et al. разработали гематит-инкапсулированный коллоид, самоходный только при воздействии управляемого вручную синего света, что привело к появлению живых кристаллов24. Морин и др. установили контроль прокатки коллоиды Квинке с помощью настраиваемого внешнего электрического поля, в результате чего коллоидные стекаются в ипподроме, как канал25. Эти предыдущие работы демонстрируют роль местного контроля в приложениях и продвигают базу знаний активной материи.

В этой статье мы сосредоточимся на управляемости 3D-активных жидкостей на основе кинезина, микротубулы (МТ). Эти жидкости состоят из трех основных компонентов: МТ, молекулярных двигателей кинезина и истощения. Истощение индуцирует силу истощения в связке МТ, которые позже преодолены моторными кластерами. Эти двигатели ходить по MTstoward плюс конец. Когда пара мостовых MTsis антипараллельный, соответствующие двигатели ходить в противоположных направлениях. Тем не менее, двигатели связаны в кластере и не в состоянии ходить друг от друга, поэтому они совместно скольжения друг от друга пары MTs (интерфиламета скольжения, рисунок 1A). Эти скользящие динамики накапливаются, вызывая пучки MTsto продлить до достижения их пряжки точки нестабильности и перерыв (расширяющиеся расслоения, Рисунок 1B)26. Сломанные пучки запечатываются силой истощения, которая впоследствии расширяется снова, и динамика повторяется. В процессе повторяющейся динамики движения расслоения перемешивают близлежащую жидкость, вызывая потоки, которые могут быть визуализированы допингом с микрон-шкалой трассеров(рисунок 1C). Sanchez et al. и Henkin et al. охарактеризовали средние скорости трассировок, обнаружив, что скорости были tunable путем изменения концентраций аденозинтрифосфата (АТФ), истощения, моторных кластеров, и MTs19,27. Однако такая настройка существовала только до активного синтеза жидкости. После синтеза, настройка была потеряна, и жидкости самоорганизованы по-своему. Для контроля активности активной жидкости после синтеза, Ross.et al. сообщил метод с использованием светоактивированной димеризации моторных белков, что позволяет жидкости активность налажена и выключается с помощью света28. В то время как контроль света удобен с точки зрения локальной активации жидкостей, метод требует реорганизации структур моторных белков, наряду с изменением оптических путей в микроскопе. Здесь мы предоставляем простой в использовании метод локального контроля потоков жидкости без изменения микроскопа, сохраняя при этом структуру двигателя нетронутой.

Наш метод локальной настройки активного потока жидкости основан на законе Arrhenius, потому что реакция кинезин-МТ, как сообщается, увеличивается с температурой29,30,31,32. Наши предыдущие исследования показали, что температурная зависимость от средней скорости активного потока жидкости следовала уравнению Arrhenius: v a exp(-Ea/RT),где A является предварительно экспоненциальным фактором, R является газовой постоянной, Eявляется энергия активации, а T - температура системы33. Таким образом, активность жидкости чувствительна к температурной среде, и температура системы должна быть последовательной, чтобы стабилизировать производительность двигателя, и, следовательно, скорость потока жидкости34. В этой статье мы демонстрируем использование температурной зависимости двигателя для непрерывной настройки скорости потока активных жидкостей путем регулировки температуры системы. Мы также демонстрируем подготовку образца активной жидкости, а затем монтаж образца на стадии микроскопа, температура которого контролируется с помощью компьютерного программного обеспечения. Повышение температуры с 16 градусов по Цельсию до 36 градусов по Цельсию ускоряет средние скорости потока от 4 до 8 мкм/с. Кроме того, настройка обратима: постоянное повышение и снижение температуры последовательно ускоряет и замедляет поток. Продемонстрированный метод применим к широкому кругу систем, где основные реакции подчиняются закону Arrhenius, таким как MT скольжения анализ29,30,31,32.

протокол

1. Подготовка МТ

ПРЕДЕКТО: На этом этапе мы очищаем тубулины от ткани мозга крупного рогатого скота. Мозг крупного рогатого скота может вызвать вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (vCJD)35. Таким образом, отходы мозга и связанные с ними решения, бутылки и пипетки советы должны быть собраны в биоотходный мешок и утилизировать в качестве биоопасных отходов в соответствии с правилами учреждения.

  1. Очистите тубулины от бычьего мозга (изменено из Castoldi et al.36).
    1. Транспорт примерно 1,5 кг свежих мозгов крупного рогатого скота из местной скотобойни в университетской холодной комнате. Во время транспортировки храните мозги в фосфатном буфере (20 мМ2PO4,150 мМ NaCl, рН 7.2) на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы максимизировать окончательный выход тубулина, начальное количество функционального тубулина в свежей ткани мозга является ключевым. Свежие мозги содержат более функциональный тубулин. Чтобы получить самые свежие мозги с скотобойни, мы рекомендуем попросить мясника предоставить мозги от самых недавно забитых коров. Мозгдолжен не должен быть старше 3 ч при начале процедуры, так как сокращение времени между убоями и началом процедуры приведет к лучшим урожаям.
    2. Гомогенизировать и прояснить мозг.
      1. Очистите мозг с помощью скальпелей, чтобы разрезать кровеносные сосуды и соединительную ткань на более мелкие кусочки и удалить их из мозга вручную.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные мозги должны быть розовыми.
      2. Погрузите очищенную ткань мозга в 1 л буфера деполимеризации (DB: 50 мМ 2-(N-морфино) этанесульфоновой кислоты, 1 мМ CaCl2, рН 6,6) на килограмм мозга.
      3. Гомогенизировать мозг с помощью кухонного блендера.
      4. Центрифугиговый гомогенизированный раствор мозга при 10 000 х г и 4 кв. м в течение 150 мин.
    3. Полимеризация МТ (первая полимеризация).
      1. Соберите и смешайте супернатант с равными объемами следующих растворов при 37 градусах Цельсия: глицерол, буфер ВЫСОКОй молярности PIPES (HMPB: 1 M PIPES, 10 мМ MgCl2,20 мМ этиленгликоль-бис (З-аминоэхил эфир)-N, N, N,N', N',N'-тетраацетика кислота
      2. Добавьте в смесь 1,5 мМ АТФ и 0,5 мм гуанозина трифосфата (GTP).
      3. Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию на 1 ч.
    4. Деполимеризация МТ (первая деполимеризация МТ).
      1. Пеллет МТ по центрифугированию на 151 000 х г и 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
      2. Откажитесь от супернатанта и отрепримет каждый мэтр в 10 мл 4 КС DB.
      3. Инкубировать на льду 30 мин.
      4. Агитировать смесь каждые 5 минут с кончиком пипетки, чтобы избежать mt осадки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь должна стать ясной в 30 мин, что указывает на завершение мт деполимеризации.
    5. Полимеризация МТ (вторая мт полимеризация).
      1. Уточните раствор, центрифугиваем на уровне 70 000 х г и 4 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
      2. Соберите и смешайте супернатант с равными объемами в 37 глицерол и HMPB.
      3. Добавьте в смесь 1,5 мМ АТС и 0,5 мм GTP.
      4. Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    6. Повторите шаг 1.1.4, заменив HMPB буфером перезагрузки Бринкли (BRB) 80 (80 мм) PIPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, pH 6.8), затем уточнив очищенную смесь путем центрифугирования на 79 000 х г и 4 кв.
    7. Соберите супернатанта. Измерьте абсорбцию 280 нм с помощью спектрометра. Определить концентрацию тубулина с использованием закона Пиво-Ламберт (коэффициент вымирания тубулина: 1,15 (мг/мл)-1см-1)37,38.
    8. Храните белок при -80 градусах По Цельсию.
  2. Переработка тубулинов (модифицированных из Castoldi et al.36).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения чистоты тубулина, очищенный тубулин полимеризуется и снова деполимеризуется.
    1. Полимеризуйте МТ путем смешивания очищенного тубулина (шаг 1.1.7) с 500 мкм дитиотрийтол (DTT) и 20 ММ GTP, а затем 30 мин инкубации при 37 градусах Цельсия.
    2. Пелле МТ.
      1. Загрузите 1 мл глоцероловой подушки (80 мм труб, 1 мМ МГКл2,1 мМ EGTA, 60% v/v glycerol, pH 6.8) в нижней части центрифужной трубки.
      2. Положите полимеризованные МТ на верхней части подушки.
      3. Центрифуга при 172 000 х г в течение 90 мин при 37 градусах По цельсию.
    3. Деполимеризуется МТ.
      1. Снимите супернатант и подушку.
      2. Отдохните каждый мт-гранулвой в 150 qL 4 C MT буфера (M2B: 80 мм PIPES, 2 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, рН 6.8).
      3. Инкубировать смесь на льду в течение 30 мин.
      4. Агитировать смесь с пипеткой отзыв каждые 5 минут. Смесь должна быть ясной.
    4. Уточните смесь путем центрифуга на 172000 х г и 4 кв кв 30 мин.
    5. Соберите супернатанта. Измерьте концентрацию белка. Хранить при -80 градусах по Цельсию.
  3. Пометьте тубулин флуоресцентным красителем39.
    1. Полимеризуйте MTs. Смешайте очищенный тубулин (шаг 1.1.7) с 500 МКм DTT и 16.7 мкм GTP, и инкубировать смесь при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
    2. Пелле МТ.
      1. Поместите 1 мл из 37 градусов по Цельсию высокой рН подушки (0,1 М NaHEPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 60% v/v глицерол, рН 8.6) в центрифуге трубки.
      2. Положите полимеризованные МТ на подушку.
      3. Центрифуга при 327 000 х г в течение 50 мин при 37 градусах По цельсию.
    3. Этикетка тубулин.
      1. Отрептируйте каждый мт-гранулы с 700 qL из 37 C маркировки буфера (0,1 М NaHEPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 40% v/v глицерол, рН 8,6).
      2. Смешайте подвеску с 10-20 молярным избытком дальневосточного флуоресцентного красителя, функционализированного с секвинимидиль-эфиром.
      3. Инкубировать смесь при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут в темноте, чтобы позволить MTs реагировать с эфиром флуоресцентного красителя.
      4. Остановите реакцию маркировки, насыщая эфир подтяжного красителя 50 мМ К-глютаматом, инкубируя в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия.
    4. Пеллетка с маркировкой MTs: Повторите шаг 1.3.2, замена подушки с высоким рН с низкой рН-подушкой (трубы 80 мМ, 2 мМ MgCl2,1 мМ EGTA, 60% v/v глицерол, рН 6.8).
    5. Деполимеризу MTs.
      1. Отбросьте супернатант и подушку.
      2. Приостановите гранулы в 700 qL 4 C M2B.
      3. Инкубировать подвеску на льду.
      4. Агитировать каждые 5 минут с кончиком пипетки, пока решение не ясно.
    6. Уточните очищенный раствор путем центрифуга на 184000 x g и 4 c для 35 мин.
    7. Повысить чистоту помеченного тубулина раствором, повторив шаги 1.2.1-1.2.4.
    8. Измерьте концентрацию белков и флуоресцентного красителя. Используйте эти измерения для определения концентрации тубулина и фракций маркированного тубулина, определяемого как соотношение концентраций флуоресцентного красителя к тубулину.
    9. Храните маркированный раствор тубулина при -80 градусах По Цельсию.
  4. Полимеризация MTs (принята от Санчес ат.д. 19):
    1. Смешайте переработанный тубулин (шаг 1.2.5) с помеченным тубулином (шаг 1.3.9) в соотношении, которое дает 3% помеченную фракцию тубулина.
    2. Смешайте смесь тубулина 8 мг/мл с 1 мм DTT и 0,6 мм гуанозина-5'(я)-метилено-трифосфат (GMPCPP), а затем 30 мин инкубации при 37 градусах Цельсия.
    3. После инкубации, anneal MTs при комнатной температуре в темноте в течение 6 ч.
    4. Aliquot и хранить при -80 градусах по Цельсию.

2. Синтезировать кластеры кинезина

ПРИМЕЧАНИЕ: Бактерии существуют повсеместно и могут расти в средствах массовой информации и загрязнять процесс подготовки. Для предотвращения загрязнения, действия, связанные с контактом с клеточной культуры (например, пипетка) должны быть выполнены вблизи пламени. Такие инструменты, как колбы, пипетки, пипетки советы, средства массовой информации, и пластины должны быть autoclaved перед использованием.

  1. Экспресс кинезинные двигатели в Escherichia coli40.
    1. Преобразуйте клетки.
      1. Пипетка 1 кЛ плазмида K401-BCCP-H6 в 10 зл компетентных клеток.
      2. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
      3. Тепло-шок при температуре 42,5 градуса по Цельсию на 45 с.
      4. Инкубировать клетки на льду в течение 2 мин, чтобы позволить восстановление.
      5. Смешайте клетки с 300 л без антибиотиков 2XYT (5 г/л NaCl, 10 г/л дрожжевого экстракта, 16 г/л триптона).
      6. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию на 1 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано, мониторинг роста клеток не требуется во время инкубации.
    2. Прививать пластины средств.
      1. Распространение клеточной культуры на 2XYT пластины (10 г/L NaCl, 5 г / л дрожжевой экстракт, 10 г / л триптон, 15 г / l агар, 100 мкг /мЛ ампициллин, 25 мкг/мЛ хлорамфеникол).
      2. Инкубировать тарелку вверх дном при 37 градусах Цельсия на ночь.
    3. Прививать жидкие носители.
      1. Из ночной тарелки собираем одну изолированную колонию с наконечником пипетки.
      2. Вывешить наконечник в колбу, содержащую 50 мл 2XYT.
      3. Инкубировать и встряхнуть культуры средств массовой информации при 37 градусах Цельсия и 200 об/мин в течение 12-16 ч.
    4. Расширьте ячейки.
      1. Смешайте 2,5 мл клеточной культуры в 500 мл 2XYT.
      2. Инкубировать и встряхнуть 500 мл культуры при 37 градусах Цельсия и 250 об/мин в течение 3-6 ч.
    5. Индуцировать экспрессию белка.
      1. Во время инкубации, контролировать рост клеток путем измерения абсорбции на 600 нм, используя 2XYT в качестве эталона. Измерьте абсорбцию каждые 60 минут, пока он не достигнет OD600 и 0.3. Затем измерьте абсорбцию каждые 30 минут, пока он не достигнет 0,5-0,6.
      2. Позвольте клеткам расти до тех пор, пока абсорбция не достигнетOD 600 и 0,5-0,6
      3. Добавьте 24 мкг/мл биотина и 1 мМ изопропила -D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) к клеточной культуре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: IPTG используется для индуцирования белковой экспрессии кинезиновых двигателей, которые помечены биотин карбоксил несущим белком (BCCP) и шестью гистидинами (H6). Тег H6 используется в процессе очистки (шаг 2.2), в то время как BCCP связывается с добавленными молекулами биотина для биотинилата выраженных кинезинных двигателей.
      4. Инкубировать и встряхнуть клеточной культуры при 20 градусах Цельсия и 250 об/мин в течение 12-20 ч.
    6. Урожай клеток центрифуги при 5000 х г и 4 кв 10 мин. Отбросьте супернатант. Храните пеллеты для клеток при -80 градусах Цельсия.
  2. Очистите кинезин моторный белок (изменен от Spriestersbach et al.41):
    1. Приостановить пеллеты ячейки (шаг 2.1.6) с равным объемом буфера лисиса (50 мМ PIPES, 4 мМ MgCl2, 50 ММ АТФ, 10 мМ 2-меркаптоэтанол (ММ), 20 мМ имидазол, рН 7,2), затем добавление одной таблетки ингибитора протеазы, 2 мг фенилметилсульсила фтора (PMSF), и 2 мг лизозима.
    2. Лизет клетки путем флэш-замораживания в жидком азоте (LN) 3x и оттаивания клеточной смеси.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После лизирования смесь должна стать вязкой.
    3. Уточните лизинированную клеточную смесь путем центрифугации на 230000 х г и 4 кв 30 мин.
    4. Соберите супернатант и протечь его через гравитационную колонку, а затем промыть колонну с 10 мл буфера лисиса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белки с тегом H6, такие как кинезин K401-BCCP-H6, должны оставаться в столбце.
    5. Унижай текучее белок с 5 мл элюционного буфера (50 мм ТРУБ, 4 мМ ММ MgCl2,50 мкм АТФ, 500 мм имидазол, рН 7.2). Соберите поток через последовательно в 1 мл фракций. Чтобы определить белково-содержащие фракции, смешайте 3 злицы каждой фракции с 100 злителем трифенилметанового красителя. Белково-содержащие фракции должны посинеть. Смешайте эти фракции и разбавьте в 5 раз с буфером излишний.
    6. Сосредоточьтесь на белковом растворе.
      1. Загрузите раствор в центробежную фильтровальную трубку.
      2. Центрифуга при 3000 х г в течение 10 мин при 4 градусах По цельсию.
      3. Встряхните трубку осторожно и центрифуга снова, пока объем раствора не будет lt;3 mL.
    7. Измерьте концентрацию белка с помощью спектрометра (коэффициент вымирания: 0,549 (мг/мл)-1см-1)42,43. Разбавить белок до 1 мг/мл, добавляя 35% сахарозы w/v.
    8. Хранить при -80 градусах по Цельсию.
  3. Измерьте концентрации кинезина с помощью геля электрофорезис (изменено от Taylor et al.44).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения концентрации кинезина с электрофорезом гель, тубулин является идеальной лестницей концентрации из-за его высокой чистоты и его измеримой концентрации через спектрометр (Рисунок 2А)36.
    1. Подготовка проб тубулина с концентрациями 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 и 1,25 мг/мл л. Смешайте 15 л каждого образца тубулина и кинезин (шаг 2,2,8) отдельно с 5 qL образца буфера (200 мм Tris-HCl, 8% сульфат атрия dodecyl (SDS), 400 мМ DTT, 0,2% бромофенол синий, 40% глицерол, pH 6.8) и incubate на 90.
    2. Приготовьте электрофорез.
      1. Запереть гель электрофореза в коробку для геля.
      2. Заполните коробку бегущим буфером (50 мМ MOPS, 50 мм Tris базы, 0,1% SDS, 1 мМ этилэндениаминатетацетической кислоты (EDTA), рН 7,7).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что уровень буфера находится выше верхнего отверстия геля.
    3. Загрузите 10 qL стандартной лестницы протеина, образца tubulin, и образца кинезина в отдельные колодцы и нанесите 200 V через гель на 45 мин.
    4. Гель окрашивание.
      1. Инкубировать и накачивать гель вареным (приблизительно 95 градусов по Цельсию) пятновом раствором А (0,5 г/л трифенилметана красителя, 10% v/v уксусной кислоты, 25% изопропанола) в течение 5 мин, затем промыть гель деионированной (DI) водой.
      2. Повторите с пятном растворы B (0.05 г/L трифенилметана красителя, 10% v/v уксусной кислоты, 10% изопропанол), C (0.02 г/l трифенилметана красителя, 10% v/v уксусной кислоты), последовательно. Инкубировать и рок гель в воде DI на ночь.
    5. Сканирование геля. Преобразуйте изображение геля в серое изображение, за которым следует черно-белая инверсия и контрастное повышение, чтобы выявить яркие белковые полосы на черном фоне.
    6. Измерьте яркость каждой полосы, подводя значения пикселей. Примените линейную подгонку C и aB q b, где B является яркость полосы тубулина, C является соответствующей концентрацией, и a и b являются подходящими параметрами. Определите концентрацию кинезина Ck с помощью яркости кинезина полосы Bk для расчета линейного уравнения: Ck q aBk q b.
  4. Кластер кинезин двигателей.
    1. Смешайте 1,5 мкм кинезин (шаг 2.2.8) с 120 МКм DTT и 120 нм стрептавидин. Инкубировать на льду 30 мин.
    2. Хранить при -80 градусах по Цельсию.

3. Подготовка полиакриламидов покрытием стеклянные слайды и крышки (изменено из Лау и др.45)

  1. Загрузите новые стеклянные горки и стеклянные крышки в соответствующие контейнеры. Погрузите горки и крышки в 1% v/v моющее средство в воде DI, а затем кипятите воду в микроволновой печи.
  2. Сножай горки и крышки в течение 5 мин, а затем промыть с DI воды для удаления моющего средства.
  3. Погрузите и снопевите горки и крышки в этаноле в течение 5 мин. Промыть с водой DI.
  4. Погрузите и смягчить горки и крышки в гидроксидкали калия 100 мм (KOH) в течение 5 мин. Промыть с водой DI.
  5. Инкубировать горки и крышки в силановый раствор (1% уксусной кислоты и 0,5% 3-(триметоксизил) пропил метакрилат в этаноле) в течение 15 мин, а затем промыть водой DI.
  6. Инкубировать слайды и крышки в растворе акриламида (2% w/w акриламид, 0,7 мг/мл амгармония persulfate, и 0.0035% v/v tetramethylethylenediamine в воде DI) для 3 h.
  7. Храните слайды и крышки в растворе акриламида.

4. Подготовка кинезин-управляемых, Mt основе активных жидкостей

  1. Подготовка активных жидкостей (изменено из Санчес и др.19).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги демонстрируют процесс подготовки 100 зл активной жидкости с использованием примера запасов. Окончательный объем масштабируется, и концентрации запасов примера могут быть скорректированы до тех пор, пока сохраняется окончательная концентрация каждого компонента.
    1. Смешайте 16,7 л из 8 мг/мл МТ (шаг 1,4,4) с 6,7 л из 1,8 км кинезина моторных кластеров (шаг 2,4,2), и 1,1 л 500 мМ DTT в высокосолевой M2B (M2B 3,9 мМ МГК2).
    2. Комплект MTs, добавив 11,4 л 7% г/w полиэтиленгликоль (PEG).
    3. Активируйте кинезинные двигатели, добавляя 2,8 л 50 мМ АТП.
    4. Поддерживайте концентрацию АТФ, добавляя 2,8 л запасов пирувате киназы/лактата дигидрогеназы (PK/LDH) и 13,3 л 200 мм фосфенол пирувате (PEP).
    5. Уменьшите эффект фотоотбелевания, добавив 10 кл. 20 мМ Trolox, 1,1 л 3,5 мг/мл каталазы, 1,1 л 20 мг/мл оксидаза глюкозы, и 1,1 л глюкозы 300 мг/мл глюкозы.
    6. Отслеживайте движение жидкости, добавляя 1,6 л 0,025% v/v частиц трассировщика.
    7. Добавьте высокосолевой M2B, чтобы достичь общего объема в 100 л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заказы на смешивание в шагах 4.1.1-4.1.6 взаимозаменяемы. Однако, как только ATP, MTs, и двигатели смешиваются, двигатели начинают потреблять AtP при наступлении вдоль MTs. Образец активируется с ограниченным сроком службы из-за ограниченного вида топлива (АТФ и Pep), поэтому эксперимент следует начинать быстро. Конечная активная жидкость должна содержать 1,3 мг/мл МТ, 120 нм кинезиновых моторных кластеров, 5,5 мм ДТТ, 0,8% ж/ч ПЭГ, 1,4 мМ АТП, 2,8% v/v PK/LDH, 27 мМ ПЭП, 2 мМ Тролокс, 0,038 мг/мл каталазы, 0,22 мг/мЛ глюкозы оксидаза, 3,3 мг/мл глюкозы, и 0,0004% v/v colloid в высокой соли M2.
  2. Подготовьте образец в канале потока (изменено из Чандракара и др.46):
    1. Промыть полиакриламид покрытием стекла слайд и coverslip (шаг 3.7) с DI воды. Высушите стаканы под давлением. Место на чистой, плоской поверхности.
    2. Вырезать две полоски восковых пленок с шириной 3 мм и такой же длины, как стеклянный покрывало (20 мм). Вставьте полоски между слайдом и крышкой в качестве прокладки каналов.
    3. Придерживайтесь стекла к восковой пленке, поместив стеклянный воск овый комплекс на горячей пластине 80 градусов по Цельсию, чтобы расплавить воск. Во время плавления, нажмите coverslip мягко с пипеткой наконечник равномерно придерживаться восковой пленки на стеклянные поверхности. После сливки охладите стеклянный комплекс до комнатной температуры.
    4. Загрузите активные жидкости (шаг 4.1) в канал потока. Запечатать канал с УЛЬТРАВ-клей.

5. Контрольтемпературная температура образца

  1. Создайте установку контроля температуры (изменено из конструкций в Lowensohn и др. и Wu et al.47,48,49).
    1. Подготовьте алюминиевый охлаждающий блок.
      1. Мельница алюминиевая пластина с габаритами примерно 30 мм и 30 мм и 5 мм.
      2. Просверлите внутренний канал через пластину(рисунок 3A)и установите шланг фитинги на концах канала.
      3. Крюк каждой установки на воду трубки.
      4. Соедините одну трубку с насосом аквариума в водохранилище, расширяя другую трубку к резервуару.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Насос будет циркулировать воды резервуара через алюминиевые внутренние каналы для поддержания температуры блока при приблизительно комнатной температуре.
    2. Провод термоэлектрический охладитель (TEC) и термосенсор к регулятору температуры. Подключите контроллер к компьютеру с помощью USB-порта(рисунок 3B).
    3. Провода контроллера температуры к прямому току (DC) блок питания. Включите контроллер, подключив блок питания к электрической розетке.
    4. Выполните начальную настройку ТИК в соответствии с руководством производителя контроллера. Проверьте выход TEC. Рекомендуется контролировать температурный контроллер с помощью предоставленного производителем программного обеспечения, что позволяет термосенсорной записи данных и более легкого манипулирования контроллером температуры.
    5. Определите стороны нагрева и охлаждения ТИК.
    6. Прикрепите охлаждающую сторону ТИК к охлаждающей блоку (шаг 5.1.1) с помощью тепловой пасты.
    7. Прикрепите сапфировый диск к нагревательной стороне ТИК с помощью тепловой пасты.
    8. Настройка завершена. Поверхность сапфира и термосенсор могут контактировать с образцом, чтобы охладить и нагреть образец в зависимости от его температуры и целевой температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы TEC и охлаждающий блок имеют выровненное центральное отверстие для визуализации образцов с помощью ярко-поляной микроскопии(рисунок 3C).
  2. Используйте установку контроля температуры для управления температурой образца33.
    1. Установите образец к установке.
      1. Поместите образец активной жидкости (шаг 4.2.4) на поверхность сапфира, при этом сторона слайда прикасается к поверхности.
      2. Закрепите стеклянную горку бумажной лентой.
      3. Прикрепите термосенсор к поверхности крышки с помощью медной ленты.
    2. Установите установку на стадии микроскопа с стороны coverslip, обращенной к целям. Например, на перевернутом микроскопе сторона обкрытия должна лицом вниз. Закрепите установку с бумажной лентой и микроскопом этапи иглы зажимы, если это применимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный этап температуры должен работать с общими микроскопами, которые либо перевернуты, либо вертикально. Для того, чтобы в ходе эксперимента не было перенесено температурное время, лучше всего обеспечить температурную стадию к этапу микроскопа лентой.
    3. Контролируйте температуру образца.
      1. Включите контроллер температуры и насос аквариума.
      2. Следуйте руководству производителя, чтобы установить целевую температуру и включить контроль температуры. Контроллер будет регулировать нагревательную или охлаждающую мощность в зависимости от целевой температуры и температуры образца, оцениваемых термосенсором.
    4. Запись температуры образца.
      1. Следуйте руководству производителя для записи данных о температуре термосенса во время эксперимента.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Температура образца теперь должна контролироваться контроллером и записываться компьютером(рисунок 3D).

6. Характеризуй активную активность жидкости (измененную по методам Henkin et al. и Wu et al.20,27)

ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие разделы используются для подготовки образцов активной жидкости (разделы 1-4) и контроля их температуры (раздел 5). Чтобы продемонстрировать использование температуры для контроля активности активной жидкости, наблюдать за поведением жидкости, анализировать их деятельность и характеризовать их реакцию на температуру.

  1. Монитор трассировщиков.
    1. Изображение образца с постоянным интерваломt с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) флуоресценции, чтобы захватить движение частиц трассировщика.
      ПРИМЕЧАНИЕ:t должны быть выбраны, чтобы позволить отслеживание движения трассировщика. Большиезначения, такие как 100 с, приводят к потере траекторий трассировщика, в то время как короткиезначения, такие как 0,1 с, не позволяют алгоритму отслеживания обнаруживать движение трассировщика между кадрами. Рабочийт должен позволить смещению трассировщика между кадрами в пределах 9 пикселей. Для следов изображений, движущихся со счетом 10 мкм/с с использованием 4x-цели,рекомендуется составить 1-5 с.
    2. Сохранить изображения в виде файлов TIFF, назовить файлы на основе номера кадра и хранить их в отдельной папке. Эти процессы необходимы для того, чтобы полученные изображения были правильно проанализированы с помощью предоставленного скрипта MATLAB (шаг 6.2.2).
  2. Трек трассаторы принятия отслеживания программного обеспечения, разработанного Ouellette и др.50,51):
    1. Скачать программное обеспечение для отслеживания из лаборатории экологической сложности Стэнфордского университета (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Убедитесь, что каждый файл MATLAB находится в одной папке.
    2. Отслеживайте трассы с помощью пользовательского скрипта MATLAB: particle_tracking.m. Скрипт читает изображения трассировщика (шаг 6.1) и отслеживает движение трассировщика с помощью программного обеспечения Ouellette et al.50,51. Он выводит два файла: 1) фон.tif, представляющий фон изображения, и 2) Tracking.mat, содержащий траектории частиц и скорости в каждом кадре (Рисунок 4A).
  3. Проанализируйте средние скорости трассировщика с помощью пользовательского скрипта MATLAB: analysis.m. Скрипт читает файл отслеживания (Tracking.mat) и выводит среднюю скорость трассеров по сравнению со временем, наряду со средней скоростью времени с указанными окнами усреднения (Рисунок 4B)33.
  4. Запись средней скорости, усредненные по времени.
  5. Измерьте среднее время, повторяя эксперимент (шаги 4, 5,2 и 6,1-6,4) при 10-40 градусах Цельсия. Используйте записанные средние скорости, чтобы построить средняя скорость против температуры (Рисунок 4C)33.

Результаты

Подготовка кинезин-управляемых, Mt основе активных жидкостей требует как кинезин и MTs. МТ были полимеризованы из маркированных тубулинов (шаги 1,3 и 1,4), которые были очищены от бычьего мозга (шаг 1.1, Рисунок 2A),а затем переработки для повышения чистоты (шаг 1.2,

Обсуждение

Контроль активного вещества на месте открывает дверь для направленной самоорганизации активного вещества4,5,24,28,54. В этой статье мы представляем протокол для использования температуры для управле?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Пласмид K401-BCCP-H6 был подарок от доктора Звонимира Догича. Это исследование было поддержано стартап-фондом доктора Кун-Та Ву в Вустерском политехническом институте. Мы благодарим доктора Звонимира Догича за протоколы по очистке и маркировке тубулина и синтезу активных жидкостей. Мы благодарны доктору Марку Ридилье за его опыт в области экспрессии и очищения белков. Мы благодарим доктора Уильяма Бенджамина Роджера за помощь в строительстве контролируемой температурой стадии. Мы признаем Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) для использования в Фонде биологических материалов (BMF). Мы признаем, Королевское общество химии для адаптации цифры из Бейт и др. на мягкая материя33.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acidSigma-Aldrich238813Trolox
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603HACH2074038Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire windowEdmund Optics43-637Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551R.S. HUGHES054007-27551Copper tape
Acetic AcidSigma-AldrichA6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrateSigma-AldrichA8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher ScientificA20006Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitSigma-AldrichUFC801024Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP BiomedicalsFisher ScientificICN802829APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760Ampicillin
Antivibration TableNikon63-7590S
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD DiagnosticsVWR90000-760Agar
BiotinAlfa AesarA14207
Bucket-plastic white - 2 gallonBon84-715Water bucket
Calcium ChlorideSigma-Aldrich746495CaCl2
Catalase from bovine liverSigma-AldrichC40
CFI Plan Apo Lambda 4x ObjNikonMRD000454x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero ShiftNikon96372GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5TE TechnologyCH-109-1.4-1.5Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
Cooling blockN/AN/ACustom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400Bio-Rad1610400Triphenylmethane dye
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificD128DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340 Heat Sink CompoundDow1446622Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBEPharmco by Greenfield Global111000200CB05Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acidSigma-AldrichE3889EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-Aldrich798681EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: TryptoneFisher ScientificBP1421Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast ExtractFisher ScientificBP1422Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µmPolysciences18861Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus nigerSigma-AldrichG2133
GlycerolSigma-AldrichG5516
GpCppJena BioscienceNU-405LGuanosine-5'[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home TheaterAmazonB07428NBCWCopper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrateSigma-AldrichG8877GTP
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
High performance blender machineAIMORESAS-UP1250Blender
His GraviTrapGE Healthcare11003399Gravity Column
ImidazoleSigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99%Pharmco by Greenfield Global231000099Isopropanol
JA-10 rotorBeckman Coulter369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrateSigma-AldrichG1501K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg whiteSigma-AldrichL6876
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2670MgCl2•6H2O
MES sodium saltSigma-AldrichM50572-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPSSigma-AldrichM12543-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022TE TechnologyMP-3022Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC138450500TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS SpectrophotometerThermo Fisher ScientificE112352Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted MicroscopeNikonMEA54000
Norland Optical Adhesive 81Norland ProductsNOA81UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein StandardThermo Fisher ScientificLC5800Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-wellThermo Fisher ScientificNP0335BOXSDS gel
Optima L-90K UltracentrifugeBeckman Coulter365672
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/RollCole-ParmerEW-06720-40Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single
Band , 3mm Light Guide control Pod
power supply		NikonPE-300-UT-L-SB-40Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-Aldrich78830PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%BeanTown Chemical129745PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23200
Pierce Protease Inhibitor Mini TabletsThermo Fisher ScientificA32953
PIPESSigma-AldrichP67571,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
Poly(ethylene glycol)Sigma-Aldrich81300PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificP250-500KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)ThermoFisher ScientificPS0300DC power supply of the gel box
PS-12-8.4ATE TechnologyPS-12-8.4ADC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscleSigma-AldrichP-0294PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per HourAmazonB005JWA612Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - NovagenMillipore Sigma71403Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless SteelAmazonB01MT6JZMRMicrowave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificS271-500NaCl
Sodium dodecyl sulfateSigma-AldrichL3771SDS
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS8282NaH2PO4
Streptavidin ProteinThermo Fisher Scientific21122
SucroseSigma-AldrichS7903
TC-720TE TechnologyTC-720Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - CalbiochemSigma-Aldrich648310Tris-HCL
Type 45 Ti rotorBeckman Coulter339160
Type 70 Ti rotorBeckman Coulter337922
Type 70.1 Ti rotorBeckman Coulter342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling TapeVWR89097-916Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2VWR48366-227Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, PremiumVWR75799-268Glass slides
XCell SureLock Mini-CellThermoFisher ScientificEI0001Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 CameraNikonZYLA5.5-USB3Monochrome CCD camera

Ссылки

  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002 (2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102 (2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114 (2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375 (2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470 (2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688 (2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1 (2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246 (2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564 (2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486 (2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601 (2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037 (2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102 (2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142 (2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102 (2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333 (1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. . Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B., Lorsch, J. R. . Methods in enzymology. 559, 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. . The proteomics protocols handbook. , 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006 (2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304 (2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. . Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. . Disinnfection, sterilization, annd preservation. , (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. . Hydrogen peroxide. , (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

153Arrhenius

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены