A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Контроль скорости потока microtubule основе 3D активных жидкостей с использованием температуры
In This Article
Summary
Целью этого протокола является использование температуры для управления скоростью потока трехмерных активных жидкостей. Преимущество этого метода не только позволяет регулировать скорость потока на месте, но и позволяет динамический контроль, такие как периодические настройки скорости потока вверх и вниз.
Abstract
Мы представляем метод использования температуры для настройки скорости потока кинезина, основанной на микротрубах трехмерных (3D) активных жидкостей. Этот метод позволяет для настройки скорости на месте без необходимости производства новых образцов для достижения различных желаемых скоростях. Кроме того, этот метод позволяет динамическое управление скоростью. Велоспорт температура приводит жидкости течь быстро и медленно, периодически. Эта управляемость основана на характеристике Arrheus реакции кинезин-микротрубуле, демонстрируя контролируемый средний диапазон скорости потока 4-8 мкм/с. Представленный метод откроет дверь к конструкции микрофлюидных устройств, где скорость потока в канале локально настраивается без необходимости клапана.
Introduction
Активная материя отличается от обычной пассивной материи из-за его способности преобразовывать химическую энергию в механическую работу. Материал, обладающий такой способностью, может состоять из живых или неживых существ, таких как бактерии, насекомые, коллоиды, зерна и цитоскелетные нити1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Эти материальные сущности....
Protocol
1. Подготовка МТ
ПРЕДЕКТО: На этом этапе мы очищаем тубулины от ткани мозга крупного рогатого скота. Мозг крупного рогатого скота может вызвать вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (vCJD)35. Таким образом, отходы мозга и связанные с ними решения, бутылки и пипетки советы должны быть собраны в биоотходный мешок и утилизировать в качестве биоопасных отходов в соответствии с правилами учреждения.
- Очистите тубулины от бычьего мозга (изменено из Castoldi et al.36).
- Транспорт примерно 1,5 кг свежих мозгов крупного рогатого скота из местной скотобойни в университетской холодной комна....
Representative Results
Подготовка кинезин-управляемых, Mt основе активных жидкостей требует как кинезин и MTs. МТ были полимеризованы из маркированных тубулинов (шаги 1,3 и 1,4), которые были очищены от бычьего мозга (шаг 1.1, Рисунок 2A),а затем переработки для повышения чистоты (шаг 1.2,
Discussion
Контроль активного вещества на месте открывает дверь для направленной самоорганизации активного вещества4,5,24,28,54. В этой статье мы представляем протокол для использования температуры для управле?.......
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgements
Пласмид K401-BCCP-H6 был подарок от доктора Звонимира Догича. Это исследование было поддержано стартап-фондом доктора Кун-Та Ву в Вустерском политехническом институте. Мы благодарим доктора Звонимира Догича за протоколы по очистке и маркировке тубулина и синтезу активных жидкостей. Мы благодарны доктору Марку Ридилье за его опыт в области экспрессии и очищения белков. Мы благодарим доктора Уильяма Бенджамина Роджера за помощь в строительстве контролируемой температурой стадии. Мы признаем Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) для использования в Фонде биологических материалов (BMF). Мы признаем, Королевское общество химии для адаптации цифры из Бейт и др. на мягкая м....
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid | Sigma-Aldrich | 238813 | Trolox |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC216550050 | |
| 3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 | HACH | 2074038 | Water tubes |
| 31.75 mm diameter uncoated, sapphire window | Edmund Optics | 43-637 | Sapphire disc |
| 3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 | R.S. HUGHES | 054007-27551 | Copper tape |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1402-1 | |
| Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8937 | ATP |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.) |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801024 | Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa |
| Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals | Fisher Scientific | ICN802829 | APS |
| Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1760 | Ampicillin |
| Antivibration Table | Nikon | 63-7590S | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics | VWR | 90000-760 | Agar |
| Biotin | Alfa Aesar | A14207 | |
| Bucket-plastic white - 2 gallon | Bon | 84-715 | Water bucket |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | CaCl2 |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C40 | |
| CFI Plan Apo Lambda 4x Obj | Nikon | MRD00045 | 4x air objective |
| C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift | Nikon | 96372 | GFP filter cube |
| CH-109-1.4-1.5 | TE Technology | CH-109-1.4-1.5 | Thermoelectric Cooler (TEC) |
| Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | C0378 | |
| Cooling block | N/A | N/A | Custom milled aluminum |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 | Bio-Rad | 1610400 | Triphenylmethane dye |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | D128 | DMSO |
| DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC165680050 | DTT |
| DOWSIL 340 Heat Sink Compound | Dow | 1446622 | Thermal paste |
| ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE | Pharmco by Greenfield Global | 111000200CB05 | Ethanol |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E3889 | EGTA |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 798681 | EDTA |
| Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone | Fisher Scientific | BP1421 | Tryptone |
| Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | Yeast extract |
| Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm | Polysciences | 18861 | Tracer particles |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| GpCpp | Jena Bioscience | NU-405L | Guanosine-5'[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP) |
| GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater | Amazon | B07428NBCW | Copper wire |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | Detergent |
| HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP410 | NaHEPES |
| High performance blender machine | AIMORES | AS-UP1250 | Blender |
| His GraviTrap | GE Healthcare | 11003399 | Gravity Column |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside |
| Isopropyl Alcohol 99% | Pharmco by Greenfield Global | 231000099 | Isopropanol |
| JA-10 rotor | Beckman Coulter | 369687 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | G1501 | K-Glutamate |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | MgCl2•6H2O |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid |
| MP-3022 | TE Technology | MP-3022 | Thermocouple |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC138450500 | TEMED |
| Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | E112352 | Spectrometer |
| Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope | Nikon | MEA54000 | |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA81 | UV glue |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | Thermo Fisher Scientific | LC5800 | Protein standard ladder |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | SDS gel |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 365672 | |
| Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/Roll | Cole-Parmer | EW-06720-40 | Wax film |
| Pe 300 ultra Illumination System Single Band , 3mm Light Guide control Pod power supply | Nikon | PE-300-UT-L-SB-40 | Cool LED Illuminator |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | PMSF |
| Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% | BeanTown Chemical | 129745 | PEP |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Fisher Scientific | A32953 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300 | PEG. Average molecular weight 20,000 Da |
| Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | P250-500 | KOH |
| PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) | ThermoFisher Scientific | PS0300 | DC power supply of the gel box |
| PS-12-8.4A | TE Technology | PS-12-8.4A | DC power supply of the temperature controller |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma-Aldrich | P-0294 | PK/LDH |
| Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour | Amazon | B005JWA612 | Fish tank pump |
| Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen | Millipore Sigma | 71403 | Competent cells |
| Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel | Amazon | B01MT6JZMR | Microwave for boiling the water |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | S271-500 | NaCl |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | SDS |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S8282 | NaH2PO4 |
| Streptavidin Protein | Thermo Fisher Scientific | 21122 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| TC-720 | TE Technology | TC-720 | Temperature controller |
| Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem | Sigma-Aldrich | 648310 | Tris-HCL |
| Type 45 Ti rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman Coulter | 342184 | |
| VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-916 | Paper tapes |
| VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 | VWR | 48366-227 | Glass coverslips |
| VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium | VWR | 75799-268 | Glass slides |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Gel box |
| ZYLA 5.5 USB3.0 Camera | Nikon | ZYLA5.5-USB3 | Monochrome CCD camera |
References
- Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002 (2016).
- Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved