Desreplicación de antibióticos utilizando la plataforma de resistencia a antibióticos

Resumen

Describimos una plataforma que utiliza una biblioteca de Escherichia coli isogénica resistente a antibióticos para la dereplicación de antibióticos. La identidad de un antibiótico producido por bacterias u hongos puede deducirse por el crecimiento de E. coli expresando su respectivo gen de resistencia. Esta plataforma es económicamente eficaz y eficiente en el tiempo.

Resumen

Uno de los principales desafíos en la búsqueda de nuevos antibióticos a partir de extractos de productos naturales es el redescubrimiento de compuestos comunes. Para hacer frente a este desafío, la desreplicación, que es el proceso de identificación de compuestos conocidos, se realiza en muestras de interés. Los métodos de desreplicación, como la separación analítica, seguido de la espectrometría de masas, consumen mucho tiempo y consumen muchos recursos. Para mejorar el proceso de desreplicación, hemos desarrollado la plataforma de resistencia a antibióticos (ARP). La ARP es una biblioteca de aproximadamente 100 genes de resistencia a antibióticos que han sido clonados individualmente en Escherichia coli. Esta colección de cepas tiene muchas aplicaciones, incluyendo un método rentable y fácil para la dereplicación de antibióticos. El proceso consiste en la fermentación de microbios productores de antibióticos en la superficie de platos rectangulares de Petri que contienen medio sólido, permitiendo así la secreción y difusión de metabolitos secundarios a través del medio. Después de un período de fermentación de 6 días, se elimina la biomasa microbiana, y se añade una fina superposición de agar a la placa Petri para crear una superficie lisa y permitir el crecimiento de las cepas indicadoras de E. coli. Nuestra colección de cepas ARP se fija a la superficie de la placa Petri que contiene antibióticos. La placa se incuba a continuación durante la noche para permitir el crecimiento de E. coli en la superficie de la superposición. Sólo crecen en esta superficie cepas que contienen resistencia a un antibiótico específico (o clase) permitiendo una rápida identificación del compuesto producido. Este método se ha utilizado con éxito para la identificación de los productores de antibióticos conocidos y como un medio para identificar aquellos que producen nuevos compuestos.

Introducción

Desde el descubrimiento de la penicilina en 1928, los productos naturales derivados de microorganismos ambientales han demostrado ser una rica fuente de compuestos antimicrobianos¹. Aproximadamente el 80% de los antibióticos de productos naturales se derivan de bacterias del género Streptomyces y otros actinomycetes, mientras que el 20% restante es producido por las especies de hongos^1. Algunos de los andamios antibiótico más comunes utilizados en la clínica, tales como los lactams, las tetraciclinas, las rifamicinas y los aminoglucósidos, fueron originalmente aislados de los microbios^2. Sin embargo, debido al aumento de las bacterias multirresistentes (MDR), nuestro panel actual de antibióticos se ha vuelto menos eficaz en el tratamiento^3,4. Estos incluyen los patógenos "ESKAPE" (es decir, enterococos resistentes a la vancomicina y Staphylococcus aureusresistentes a la lactam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii,y Enterobacter sp.), que son un subconjunto de bacterias consideradas asociadas al mayor riesgo por una serie de importantes autoridades de salud pública como la Organización Mundial de la Salud^3,4,5. La aparición y propagación global de estos patógenos MDR da lugar a una necesidad constante de nuevos antibióticos^3,4,5. Lamentablemente, las últimas dos décadas han demostrado que el descubrimiento de nuevos antibióticos de fuentes microbianas es cada vez más difícil⁶. Los enfoques actuales para el descubrimiento de fármacos incluyen el cribado de alto rendimiento de compuestos bioactivos, incluidas las bibliotecas de extractos de productos naturales, lo que permite probar miles de extractos en un momento dado^2. Sin embargo, una vez detectada la actividad antimicrobiana, el siguiente paso es analizar el contenido del extracto crudo para identificar el componente activo y eliminar aquellos que contienen compuestos conocidos o redundantes^7,8. Este proceso, conocido como desreplicación, es vital para prevenir y/o reducir significativamente el tiempo dedicado al redescubrimiento de antibióticos conocidos^7,9. Aunque es un paso necesario en el descubrimiento de fármacos de productos naturales, la dereplicación es notoriamente laboriosa y requiere muchos recursos¹⁰.

Desde que Beutler y otros acuñaron por primera vez el término "desreplicación", se han realizado amplios esfuerzos para desarrollar estrategias innovadoras para la rápida identificación de antibióticos conocidos^11,12. Hoy en día, las herramientas más comunes utilizadas para la desreplicación incluyen sistemas cromatográficos analíticos como cromatografía líquida de alto rendimiento, espectrometría de masas y métodos de detección basados en resonancia magnética nuclear^11,13. Desafortunadamente, cada uno de estos métodos requiere el uso de costosos equipos analíticos y una sofisticada interpretación de datos.

En un intento de desarrollar un método de desreplicación que se puede realizar rápidamente sin equipo especializado, establecimos la plataforma de resistencia a antibióticos (ARP)¹⁰. El ARP se puede utilizar para el descubrimiento de adyuvantes antibióticos, la elaboración de perfiles de nuevos compuestos antibióticos contra mecanismos de resistencia conocidos, y la dereplicación de antibióticos conocidos en extractos derivados de actinobacterias y otros microbios. Aquí, nos centramos en su aplicación en la dereplicación de antibióticos. El ARP utiliza una biblioteca de cepas isogénicas de Escherichia coli que expresan genes de resistencia individuales que son eficaces contra los antibióticos más comúnmente redescubiertos^14,15. Cuando la biblioteca de E. coli se cultiva en presencia de un organismo secundario productor de metabolitos, la identidad del compuesto puede deducirse por el crecimiento de cepas de E. coli que expresan su gen de resistencia asociado¹⁰. Cuando se informó por primera vez de la ARP, la biblioteca consistió en >40 genes que confieren resistencia a 16 clases de antibióticos. La plantilla de desreplicación original fue diseñada para abarcar un subconjunto de genes de resistencia por clase de antibióticos para proporcionar información sobre la subclase de antibióticos durante el proceso de desreplicación. Hoy en día, la ARP se compone de >90 genes que confieren resistencia a 18 clases de antibióticos. Utilizando nuestra extensa colección de genes de resistencia, se ha desarrollado una plantilla de desreplicación secundaria que se conoce como la plataforma de resistencia mínima a los antibióticos (MARP). Esta plantilla fue creada para eliminar la redundancia genética y simplemente proporcionar información sobre la clase general de antibióticos con la que está relacionado un metabolito desreplicado. Además, la plantilla MARP posee tanto el tipo salvaje como una cepa deficiente hiperpermeable/eflujo de E. coli BW25113 (E. coli BW25113 -bamB-tolC),en comparación con la encarnación original de la ARP, que sólo utiliza la cepa hiperpermeable. Este aspecto único crea fenotipos adicionales durante la dereplicación, lo que indica una capacidad de compuestos para cruzar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Aquí, describimos un protocolo robusto a seguir al dereplicar con el ARP y/o MARP, resaltamos los pasos más críticos a seguir, y discutimos los diversos resultados posibles.

Protocolo

1. Preparación de las existencias de glicerol de la biblioteca E. coli (a partir de inclinadores de agar)

1. Rayar las cepas ARP/MARP E. coli del caldo de lisabagenia (LB) inclina sobre platos de Petri que contienen agar LB y el marcador seleccionable apropiado (Tabla 1).
2. Preparar cultivos para cada una de las cepas de E. coli inoculando 3 ml de LB que contengan el marcador seleccionable apropiado con una sola colonia. Crecer durante la noche a 37oC con aireación (250 rpm).
3. Combinar 800 ml de cultivo y 200 ml de glicerol estéril al 80% en un criovial de 1,8 ml. Mezcle invirtiendo los tubos 3 x 4 veces y guárdelos a -80 oC.

2. Preparación de placas de biblioteca de stock congelado ARP/MARP

1. Raya las cepas ARP/MARP de las poblaciones de glicerol preparadas en la sección 1 sobre un nuevo conjunto de platos Petri que contienen agar LB y el marcador seleccionable adecuado. Crecer durante la noche a 37oC.
2. Utilizando una técnica aséptica, la pipeta 500 l de caldo Mueller Hinton ajustado por cationes (MHB) desde un depósito estéril a cada pocido de una placa de pozo de 96 profundidades estéril.
3. Con las placas preparadas en el paso 2.1, utilice un bastón aplicador para inocular la placa de pozo profundo 96 de acuerdo con el mapa ARP/MARP(Figura suplementaria 1 y Figura suplementaria 2). Asegúrese de que se agrega el marcador seleccionable adecuado a cada pozo. Coloque una membrana de sellado transpirable sobre la superficie de la placa de pozo profundo e incubar durante la noche a 37 oC (250 rpm).
4. Asegúrese de que no haya pozos contaminados refiriéndose al mapa ARP/MARP. Repita si está contaminado. Usando un pipeteador multicanal, transfiera 100 l de cada pocal de la placa de pozo profundo a una placa inferior redonda estéril de 96 pocillos. Repita este paso para crear varias placas de biblioteca de stock congeladas.
   NOTA: Lo mejor es preparar al menos 5 placas de biblioteca a la vez para evitar que se repitan los pasos 2.1-2.4 en caso de contaminación de la placa de la biblioteca de stock congelado.
5. Termine de hacer las placas de la biblioteca de stock congeladas ARP/MARP pipeteando 100 ml de glicerol estéril del 50% en cada pocayenyyel y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
6. Cubra las placas con sellos de aluminio estériles y asegúrese de que cada poca está sellado individualmente.
7. Numera las placas y dedica solo una placa de biblioteca de stock congelada para inocular nuevas plantillas en un momento dado. Mantenga el resto como respaldos en caso de contaminación de la placa de la biblioteca de existencias congeladas.
8. Coloque la tapa de la placa en la parte superior del sello de aluminio y guárdela a -80 oC.

3. Preparación de placas de cultivo y desreplicación de semillas

1. Usando un palillo aplicador, inocular 3 ml de Streptomyces antibiotic medium (SAM) (u otro medio apropiado para el organismo que se está probando) en un tubo de ensayo que contenga un cordón de vidrio estéril (para romper el micelio) con la cepa productora que debe ser replicado. Para Streptomyces, raspe suavemente las esporas de la superficie de una colonia.
2. Usando el mismo palillo aplicador de madera, raya un control de esterilidad en un plato de Petri que contiene el agar de Bennett.
3. Incubar el cultivo de semillas a 30oC con aireación durante 6 días (250 rpm) e incubar la placa de control de esterilidad a 30oC durante 6 días.
   NOTA: Consulte la Tabla 2 para conocer las recetas de medios de SAM y Bennett. Las instrucciones anteriores son adecuadas para la mayoría de los actinomycetes. Alterar los medios de crecimiento según sea necesario para otras bacterias y hongos.
4. Preparar las placas de desreplicación aspirando 23 ml de agar caliente de Bennett en una pipeta serológica y dispensar 20 ml uniformemente a través de la superficie de un plato rectangular de Petri(Tabla de Materiales),dejando el resto del medio en la pipeta para evitar formación de burbujas de aire.
   NOTA: Asegúrese de que la superficie que se utiliza para verter las placas está nivelada y realice este paso antes de que el agar se haya enfriado demasiado; una superficie plana es imprescindible para la fijación de bibliotecas en las siguientes etapas.
5. Gire suavemente la placa hasta que el medio cubra todas las áreas de la placa y no la moleste hasta que el agar se haya ajustado por completo.
6. Preparar láminas de membrana de nitrocelulosa(Tabla de Materiales)utilizando una tapa rectangular de la placa Petri como plantilla de trazado para que las hojas se ajusten a la superficie de la placa de desreplicación. Corta las sábanas y autoclave en una bolsa estéril.
   NOTA: Esta membrana permite que los organismos esporulen en su superficie, mientras que los metabolitos secundarios pueden excretarse en el medio inferior. Una vez cultivada, la membrana se retira para proporcionar una superficie limpia para la dereplicación. Cuanto más cerca esté el papel de membrana en la superficie del agar de Bennett, más limpio será el resultado de la desreplicación.
7. Compruebe la placa de control de esterilidad para asegurarse de que no hay contaminantes después de 6 días de incubación. Si no hay contaminación, retire la tapa de la placa rectangular Petri y la pipeta 200 l de cultivo de semillas sobre la superficie del agar de Bennett.
8. Extiéndase uniformemente el cultivo por toda la superficie de todo el plato utilizando un hisopo de algodón estéril.
9. Coloque la membrana de nitrocelulosa preparada en el paso 3.6 sobre el cultivo en la superficie de la placa Petri. Comience alineando el borde inferior de la membrana con el borde inferior de la placa Petri, y aplique lentamente la membrana desde el borde inferior hasta el borde superior de la placa.
10. Utilice un hisopo de algodón estéril para suavizar las burbujas de aire que puedan haberse formado entre la interfaz membrana-agar, asegurándose de que la membrana esté al ras del agar.
11. Vuelva a colocar la tapa en el plato rectangular de Petri y colóquela boca abajo en una bolsa de plástico sellada. Incubar a 30oC durante 6 días.

4. Superposición de placa de desreplicación MHB y preparación de placas de biblioteca ARP/MARP

1. Después de 6 días, retire la placa de desreplicación de la incubadora de 30 oC. Usando pinzas estériles (autoclavedas o rociadas a fondo con 70% de etanol), retire cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa de la superficie del agar de Bennett.
   NOTA: Este paso eliminará las esporas hidrófobas y los micelios cultivados en la superficie de la membrana para proporcionar una superficie limpia para la desreplicación, facilitando el paso 4.2.
2. Como se describe en el paso 3.4, asegúrese de que la superficie de trabajo esté nivelada y utilice una pipeta serológica para aspirar 23 ml de agar MHB ajustado por cationes calientes. Cree una superposición dispensando 20 ml uniformemente a través de la superficie de la placa de desreplicación, dejando el resto del medio en la pipeta para evitar la formación de burbujas de aire.
3. Gire suavemente la placa hasta que el medio cubra todas las áreas y no la moleste hasta que el agar se haya ajustado por completo. Una vez enfriada y solidificada, devuelva la placa de desreplicación a la bolsa de plástico sellada y guárdela boca arriba a 4 oC durante la noche.
   NOTA: Este paso permite la difusión de metabolitos secundarios desde el medio de Bennett fermentado en la superposición de agar MHB. Si la membrana de nitrocelulosa no se preparó correctamente, habrá crecimiento de esporas alrededor de los bordes de la placa, que tienen propiedades hidrofóbicas que repelen el agar MHB. No vierta la superposición encima de estas esporas porque puede resultar en la contaminación de la superposición.
4. El mismo día en que se vierte la superposición, inocular una nueva plantilla ARP/MARP pipeteando 100 l de cationes ajustado MHB en cada pocil de una placa de 96 pocillos.
   NOTA: Para reducir la posibilidad de propagación de la contaminación durante la dereplicación, utilice una sola placa de biblioteca ARP/MARP para dereplicar solo 2 x 3 placas de desreplicación. Por lo tanto, inocular suficientes placas ARP/MARP de 96 pocillos en función del número de cepas que se dereplicarán.
5. Saque la placa de la biblioteca ARP/MARP de material congelado del congelador de -80 oC. Retire el sello de aluminio antes de que la condensación comience a formarse en su parte inferior, disminuyendo así la posibilidad de contaminar los pozos vecinos en la placa de la biblioteca.
6. Usando herramientas de fijación estériles de 96 pocillos (u otras formas de equipo de inoculación), fija cuidadosamente la placa de la biblioteca ARP/MARP de stock congelado e inocula las placas frescas de 96 pocillos que contienen MHB. Para minimizar la contaminación durante la desreplicación, prepare tantas placas de biblioteca ARP o MARP necesarias para dereplicar solo 2 x 3 placas de desreplicación por placa de biblioteca. Esterilice las herramientas de fijación entre la inoculación de cada placa.
7. Ponga un nuevo sello de aluminio estéril en la plantilla congelada una vez completada y devuélvala al congelador de -80 oC. Colocar las placas inoculadas de 96 pocillos dentro de una bolsa de plástico sellada e incubar a 37oC con aireación (250 rpm) durante 18 h.
   NOTA: Las nuevas placas de la biblioteca de stock congelado se pueden preparar a partir de este paso después de asegurarse de que no haya contaminación. Añadir glicerol a la placa antes de almacenara a -80 oC como se describe en el paso 2.5.

5. Dereplicación usando el ARP/MARP

1. Retire la plantilla ARP/MARP de la incubadora y asegúrese de que no haya contaminantes. Siempre desreplicación usando una plantilla que esté recién preparada y no directamente desde el stock congelado.
2. Retirar las placas de desreplicación de 4oC y dejar equilibrar a temperatura ambiente. Si hay condensación, abra las tapas y deje secar en un ambiente estéril.
3. Usando herramientas de fijación estériles (u otro equipo de inoculación), ancle desde la placa de la biblioteca ARP/MARP a la superficie de la superposición de agar MHB de las placas de desreplicación. Tenga cuidado de no perforar el agar. Esterilice las herramientas de fijación entre inocular cada placa de desreplicación.
4. Después de fijar la plantilla en la superficie de las placas de desreplicación, deje que el inóculo de la plantilla se seque durante 3 x 5 minutos.
5. Analice los resultados de la desreplicación al día siguiente comparando el crecimiento de la placa de desreplicación con los pozos que corresponden al mapa ARP/MARP(Tabla 3 y Tabla 4).

Resultados

Los siguientes resultados se obtuvieron cuando se desató una colección de cepas de interés productoras de antibióticos utilizando el ARP y/o ELP.

En la Figura 1se muestra un diagrama del flujo de trabajo de desreplicación ARP/MARP y los mapas de placas de biblioteca se muestran en la Figura suplementaria 1 y en la Figura complementaria 2. La Figura 2 demuestra un resultado positivo de desreplicac...

Discusión

El protocolo descrito anteriormente puede aplicarse tanto al descubrimiento de nuevos compuestos antimicrobianos como a los adyuvantes que pueden utilizarse junto con los antibióticos existentes para rescatar su actividad. La plataforma aprovecha la alta especificidad del sustrato de los mecanismos de resistencia y sus antibióticos cognados, para desreplicar compuestos dentro de extractos de productos naturales crudos. Aunque el tiempo necesario para que las placas de desreplicación se preparen es largo (2 semanas), e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Calcium Carbonate	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous	Commercial Alcohols	P016EAAN
Glass Beads, Solid	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Instant sealing sterilization pouch	Fisher Scientific	01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB Broth Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Fisher Scientific	264728	with lid, sterile, non treated
Petri dish 92 mm x 16 mm with cams	Sarstedt	82.1473.001
Pinning tools	ETH Zurich	-	Custom order
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potato starch	Bulk Barn	279
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium Nitrate	Fisher Scientific	S343-500
Wood Applicators	Dukal Corporation	9000
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2