АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает метод визуализации поведения макрофагов и смерти у эмбриональных зебры во время инфекции Mycobacterium marinum. В стоимость включены меры по подготовке бактерий, инфицированию эмбрионов и интравитальной микроскопии. Этот метод может быть применен к наблюдению клеточного поведения и смерти в аналогичных сценариях, связанных с инфекцией или стерильным воспалением.

Аннотация

Зебрафиш является отличной моделью организма для изучения врожденного поведения иммунных клеток из-за его прозрачной природы и полагаться исключительно на его врожденную иммунную систему во время раннего развития. Модель инфекции «Зебрафиш Микобактерия» (M. marinum)была хорошо зарекомендована при изучении иммунного ответа хозяина против микобактериальной инфекции. Было высказано предположение, что различные макрофage клеточных типов смерти приведет к различным исходам микобактериальной инфекции. Здесь мы описываем протокол с использованием интравитальной микроскопии для наблюдения макрофаговной клеточной смерти в эмбрионах зебры после инфекции М. Маринум. Трансгенные линии зебрафиш, которые специально маркируют макрофаги и нейтрофилы, заражаются внутримышечной микроинъекцией флуоресцентно помеченного M. marinum в среднем мозге или стволе. Зараженные эмбрионы зебры впоследствии устанавливаются на низкорасплавленную агарозу и наблюдаются с помощью конфокальной микроскопии в измерениях X-Y---T. Поскольку долгосрочная живая визуализация требует использования низкой мощности лазера, чтобы избежать фотоотбеления и фототоксичности, настоятельно рекомендуется сильно выражающее трансгенное вещество. Этот протокол облегчает визуализацию динамических процессов in vivo, включая миграцию иммунных клеток, взаимодействие патогенов-хозяев и гибель клеток.

Введение

Микобактериальная инфекция была продемонстрирована, чтобы вызвать смерть иммунных клеток хозяина1. Например, ослабленный штамм вызовет апоптоз у макрофагов и содержит инфекцию. Тем не менее, вирулентный штамм вызовет литическую гибель клеток, вызывая бактериальное распространение1,2. Учитывая влияние этих различных типов клеточной смерти на принимающей анти-микобактериальной реакции, подробное наблюдение макрофаг клеток смерти во время микобактериальной инфекции in vivo необходимо.

Обычные методы измерения смерти клеток используют пятна мертвых клеток, такие как Annnexin V, TUNEL, или acridine оранжевый / пропидий йодид окрашивания3,4,5. Однако эти методы не в состоянии пролить свет на динамичный процесс гибели клеток in vivo. Наблюдение смерти клеток in vitro уже способствовало живой визуализации6. Однако, являются ли результаты точно имитировать физиологические условия остается неясным.

Зебрафиш были отличной моделью для изучения принимающих анти-микобактерии ответов. Он имеет высоко консервированную иммунную систему, похожую на иммунную систему человека, легко манипулировать геном, и ранние эмбрионы прозрачны, что позволяет жить изображения7,8,9. После заражения M. marinum, взрослые зебра образуют типичные зрелые структуры гранулы, а эмбриональные зебры образуют раннюю гранулему, как структуры9,10. Динамический процесс взаимодействия врожденных иммунных клеток-бактерий был изучен ранее в модели инфекции зебрафиш M. marinum 11,12. Однако, из-за высокой пространственно-временной потребности в разрешении, детали, связанные со смертью врожденных иммунных клеток остаются в значительной степени неопределенными.

Здесь мы описываем, как визуализировать процесс макрофаговлистической клеточной смерти клеток, вызванной микобактериальной инфекцией in vivo. Этот протокол также может быть применен к визуализации клеточного поведения in vivo во время развития и воспаления.

протокол

Зебрафиш был воспитан в стандартных условиях в соответствии с лабораторными руководящими принципами для животных для этического обзора благополучия животных (GB/T 35823-2018). Все эксперименты по зебрафиш в этом исследовании были одобрены (2019-A016-01) и проведены в Шанхайском клиническом центре общественного здравоохранения, Университет Фудан.

1. М. Маринум Одноклеточная Инокулум Подготовка(Рисунок 1)

  1. Оттепель Церулеан-флуоресцентный M. marinum глицерол бульон от -80 кВ и прививать 7H10 агар пластины с 10% (v/v) OADC, 0,25% глицерола и 50 мкг /мЛ гигромицин. Инкубировать тарелку при 32 градусах По Цельсию в течение 10 дней.
  2. Выберите колонию, выражающую положительную флуоресценцию и привить 3 мл среды 7H9 с 10% OADC, 0,5% глицерола и 50 мкг/мл гигромицина.
    1. Инкубировать прививку при 32 градусах Цельсия и 100 оборотах в минуту (об/ ч) в течение 4-6 дней, пока культура не достигнет логарифмической фазы (OD600 и 0,6-1.0).
    2. Субкультура (1:100) в 30 мл свежей среды 7H9 с 10% OADC, 0,5% глицерола, 0,05% Tween-80, и 50 мкг/мл до OD600 достигает 1,0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для высочайшего качества культуры рекомендуется шаг субкультуры. По нашему опыту, добавление клона непосредственно в большой объем среды приведет к образованию бактериальных сгустков.
  3. Соберите клетки M. marinum, описанные ниже.
    1. Центрифуга на 3000 х г в течение 10 минут, чтобы собрать M. marinum как гранулы. Откажитесь от всех, кроме 300 л супернатанта, и используйте его для повторной приостановки гранул.
    2. Добавьте 3 мл 7H9 среды с 10% глицерола для дальнейшего повторного повторного повторного гранулы, а затем sonicate подвески в водяной бане на 100 Вт на 15 с ON, 15 с OFF в общей сложности 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель sonication является достижение одной клетки гомената для инокулума, который предотвратит блокировку иглы микроинъекции.
  4. Перенесите бактериальную суспензию в шприц 10 мл, затем пройдите через фильтр номинала 5 мкм, чтобы удалить любые бактериальные комки.
  5. Измерьте оптическую плотность (OD) подвески с помощью спектрофотометра и разбавьте ее до OD600 и 1.0 с 7H9 носителями, содержащими 10% глицерола. Разделите подвеску на 10 аликотов и храните при -80 градусов морозильник для использования в будущем.
  6. Подтвердите бактериальную концентрацию инокулума (cfu/mL) путем последовательного разбавления и покрытия бактериального бульона на агарной пластине 7H10, содержащей 10% (v/v) ОАдК, 0,5% глицерола и 50 мкг/мл гигромицина.

2. Подготовка эмбрионов зебрафиш

  1. За день до нереста, создать зебры разведения пар в камере размножения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте только одну пару к каждой камере размножения.
  2. Сбор эмбрионов на следующее утро в течение 1 ч после оплодотворения (hpf). Тщательно промыть эмбрионы дистиллированной водой и перенести до 100 эмбрионов в 100 мм чашку Петри, содержащую 30 мл среды E3. Инкубировать при 28,5 градуса х х х.
  3. После 12 ч наблюдайте под микроскопом и отбрасывайте неоплодотворенные или поврежденные яйца.
  4. На 24 л.с., изменить средний на свежий E3 среды с N-фенилтиуреа (PTU, 0,2 нм конечной концентрации), чтобы предотвратить развитие пигмента. Инкубировать эмбрионы при 28,5 градуса х до тех пор, пока эмбрионы не будут готовы к микроинъекциям.

3. Инфекция с помощью бактериальной микроинъекции

  1. Подготовка borosilicate стекла микрокапиллярных игл инъекций, как ранее описано в ссылке13.
  2. Эмбрионы зебры, растущие для инфекции
    1. Микроволновая печь 100 мл 1% (w/v) и 100 мл 0,5% (w/v) низкоплавленная агароза в автокклавизированной среде E3 до полного расплавленного агарозы. Разделите на 1 мл аликвотных труб и храните при 4 градусах по Цельсию для использования в будущем.
    2. Перед использованием нагрейте агарозу в нагревательном блоке 95 градусов по Цельсию до тех пор, пока он полностью не расплавлен. Поддерживайте агарозу в жидкой форме, поместив его в нагревательный блок 45 градусов по Цельсию(рисунок 2).
    3. Монтаж для внутримышечной инфекции в области ствола
      1. Создайте нижний слой агарозы, вылив 0,5 мл 1% (w/v) агарозы равномерно на стеклянную горку. Поместите на ледяную коробку или холодную поверхность в течение 3 мин, чтобы затвердеть.
      2. Анестезия эмбрионов зебры (48-72 л.с.) в яичной воде с трикаином (200 мкг/мл) и ПТУ в течение 5 минут до монтажа. Поместите до 60 эмбрионов зебры на нижний слой агарозы и аккуратно выложите их в два ряда(рисунок 2B).
      3. Удалите оставшуюся воду на нижнем слое агарозы с помощью салфетки, прежде чем добавить 0,3 мл 0,5% (w/v) агарозы для создания верхнего слоя. Убедитесь, что эмбрионы полностью встроены в агарозу. Вернуть стеклянную горку в ледяную коробку снова, чтобы укрепить агарозу и предотвратить обезвоживание.
      4. Держите верхний слой агарозы влажным, покрывая поверхность дополнительной водой e3 яйцо.
    4. Монтаж для инфекции среднего мозга
      1. Обложка паз одного вогнутости стеклянной микроскопии слайд с 1% (w/v) агарозы, а затем передать 4-6 трикаин-анестезируется эмбрионов в агарозу.
      2. Расположите голову каждого эмбриона вверх осторожно с 10 G иглы(Рисунок 2C).
      3. Как только все положения эмбрионов будут зафиксированы, перенесите стеклянную горку на ледяную коробку или холодную поверхность, чтобы агароуз затвердевал.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте разбавления агарозы низкого плавления, минимизируя объем переноса яичной воды с эмбрионами.
  3. Препарат бактерий для инфекции
    1. Добавьте 1 qL стерильного фильтрованного фенола красного (10x) к аликвуту бактериального запаса (сделанному в шаге 1) и смешайте путем краткого вихря.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация может быть скорректирована с помощью стерильных PBS.
    2. Sonicate препарат с использованием 100 Вт на 10 с ON, 10 с OFF в течение 1 мин, чтобы разбить любые сгустки, которые, возможно, сформировали14.
  4. Инфекция с помощью микроинъекций
    1. Отрегулируйте микроинжектор и микроманипулятор в нужное положение и настройки для микроинъекции, как сообщалось ранее13.
    2. Передача 3 Зл бактериального препарата с помощью микропогрузчика в подготовленную иглу (см. шаг 3.1). Пипетка медленно и осторожно, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
    3. Для инфекции области ствола, введите 100 cfu в область ствола(рисунок 3A). Избегайте инъекций бактерий в нотохорд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Cfu для инъекции оценивается по формуле cfu и бактериальной концентрации запасов х фактор разбавления х объем капли инъекции. Фактический cfu подтверждается покрытием одной капли бактериального инокулума на агарной пластине 7H10, содержащей 10% (v/v) ОАдК, 0,5% глицерола и 50 мкг/мл гигромицина.
    4. Для инфекции среднего мозга, вводить около 500 cfu в области среднего мозга(Рисунок 3B).
    5. После микроинъекции тщательно промыть эмбрионы зебры в пресноячную яичную воду с помощью пластиковой пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гора эмбрионов в стеклянной нижней блюдо как можно скорее, чтобы покрыть наблюдение очень рано врожденной иммунной реакции клеток.

4. Live Изображение инфекции

  1. Рыба монтаждля для живой визуализации
    1. Перенесите до 10 трикаин-анестезиированных эмбрионов к середине стеклянной нижней 35-мм тарелки. Откажитесь от дополнительной среды E3.
    2. Обложка блюдо с 1% низкой точки плавления агарозы и ориентировать эмбрионы зебры тщательно с помощью 10 G иглы. Инкубировать стеклянное дно блюдо на льду в течение 10 с, чтобы укрепить агарозу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекции среднего мозга, эмбрионы должны быть установлены в агарозе с головой, направленной вверх(Рисунок 4A). Для внутримышечной инфекции области ствола эмбрионы должны быть установлены боково в агарозе(рисунок 4В).
    3. После того, как он полностью затвердел, накройте агарозу слоем яичной воды (плюс 1 х трикаин и ПТУ).
  2. Трехцветная с высоким разрешением промежуток времени конфокальной микроскопии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги оперируются на конфокальной микроскопии, оснащенной ультрафиолетовой линзой 63.0x 1.40.
    1. Установите температуру экологической камеры до 28,5 градусов по Цельсию. Поместите немного влажной бумаги ткани внутри камеры, чтобы обеспечить влажность и предотвратить испарение яичной воды(Дополнительная рисунок 1).
    2. Поместите 35-мм стеклянное дно блюдо с зебрафишем в экологической камере.
    3. Откройте конфокическое программное обеспечение и инициализировать сцену. Переключитесь на уф-объектив 63.0 x 1.40 oil UV и найдите зебры с помощью яркого полевого канала с контрастным дифференциальным интерференцией (DIC).
    4. Откройте лазер 405 Diode, Argon (20% мощности) и DPSS 561 нм. Настройка соответствующих параметров лазерной мощности и спектра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие настройки спектра для cerulean (возбуждение 405 нм; выбросы - 456-499 нм), eGFP (возбуждение 488 нм; выбросы - 500-550 нм), DsRed2 (возбуждение - 561 нм; выбросы - 575-645 нм).
    5. Выберите режим приобретения"XY"иустановите формат изображений на512 x 512 пикселей"(Дополнительная диаграмма 2A).
    6. Переключитесь на режим«Живых данных». Целевой позиции первого зебры и пометить "Начало" и "Конец" Повторите этот процесс для каждого из оставшихся эмбрионов. "Пауза"может быть добавлена в конце программы(Дополнительная цифра 2С).
    7. Определите цикл и цикл программы.
    8. Сохранить файл.

5. Одноклеточное ультрафиолетовое облучение, чтобы вызвать апоптоз и живое изображение

  1. Маунт рыбы, как описано в шаге 4.1.
  2. Изображение средней области мозга 3 дней после оплодотворения (dpf) макрофаг конкретных трансгенных Tg (mfap4-eGFP) эмбрион15
  3. Выберите область, представляющий интерес для одного флуоресцентно помечены макрофаг и сканирования на скорости 400 Гц и 6% УФ лазерной мощности для 50 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость сканирования и время должны быть оптимизированы на основе индивидуального микроскопа. Время сканирования должно быть оптимизировано, чтобы вызвать обширные повреждения ДНК, которые впоследствии вызовут апоптоз клеток, но не фотоотрах всей клетки.
  4. Повторите вышеуказанный шаг, чтобы облучить больше целевых ячеек.
  5. Выполните промежуток времени изображения области среднего мозга, как описано в разделе 4.

6. Обработка изображений

  1. Выполните "Максимальная проекция" для приобретенных изображений.
  2. Найдите и пометьте положение XY и время целевых ячеек под представлением«Максимальная проекция».
  3. Вернитесь к стандартному представлению, чтобы найти и отметить положение целевых ячеек.
  4. Обрезать однослойное изображение целевых ячеек.
  5. Экспорт накладной канал и яркое поле в виде видео в формате AVI.
  6. Обрезать область интереса канала наложения и яркое поле в ImageJ.
  7. Объедините два видео на последнем шаге вертикально и сохраните как одно видео формата AVI в ImageJ.

Результаты

Микобактерия инфекции может вызвать различные реакции хозяина в зависимости от маршрутов инфекции. В этом протоколе, эмбрионы зебры инфицированы внутримышечной микроинъекции флуоресцентно помечены бактерии в среднем мозге или стволе(Рисунок 3) и наблюдается конфокал...

Обсуждение

Этот протокол описывает визуализацию макрофагов смерти во время микобактериальной инфекции. На основе таких факторов, как целостность клеточной мембраны, инфекция обусловлена клеточной смерти можно разделить на апоптоз и литическом смерти клеток24,25. Л...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Зилонга Вэня за обмен штаммами зебры, д-ра Стефана Охлерса и д-ра Дэвида Тобина за совместное использование ресурсов, связанных с М. Маринумом, Yuepeng He за помощь в подготовке фигур. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81801977) (B.Y.), Выдающейся программой подготовки молодежи Шанхайской муниципальной комиссии по здравоохранению (2018Y-54) (B.Y.), Шанхайской парусной программой (18YF1420400) (B.Y.), а также Открытым фондом Шанхайской ключевой лаборатории туберкулеза (2018KF02)...

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Tween-80SigmaP1379
10 mL syringeSolarbioYA0552
10% OADCBD211886
3-aminobenzoic acidSigmaE10521
5 μm filterMille XSLSV025LS
50 μl/ml hygromycinSangon BiotechA600230
7H10BD262710
7H9BD262310
A glass bottom 35 mm dishIn Vitro ScientificD35-10-0-N
AgaroseSangon BiotechA60015
Confocal microscopeLeicaTCS SP5 II
Enviromental ChamberPecontemp control 37-2 digital
Eppendorf microloaderEppendorfNo.5242956003
Glass microscope slideBioland Scientific LLC7105P
GlycerolSangon BiotechA100854
IncubatorKeelreinPH-140(A)
M.marinumATCC BAA-535
Microinjection needleWorld Precision InstrumentsIB100F-4
MicroinjectorEppendorfFemtojet
MicromanipulatorNARISHIGEMN-151
msp12:ceruleanRef.: PMID 25470057; 27760340
Phenol redSigmaP3532
PTUSigmaP7629
Single concavity glass microscope slideSail Brand7103
SonicatorSCICNTZJY92-IIDN
Spectrophotometer (OD600)Eppendorf AG22331 Hamburg
Stereo MicroscopeOLYMPUSSZX10
Tg(mfap4:eGFP)Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)Ref.: PMID 27424497; 17477879

Ссылки

  1. Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
  2. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
  3. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
  4. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
  5. Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
  6. Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
  7. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
  8. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  9. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  10. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
  11. Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  14. Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
  15. Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
  16. Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
  17. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  18. Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
  19. Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
  20. Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
  21. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
  22. Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
  23. Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
  24. Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
  25. Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены