Surveillance de la survie du virus de la grippe à l’extérieur de l’hôte à l’aide d’une analyse cellulaire en temps réel

Résumé

Il est rapporté ici un protocole pour la quantification des particules virales infectieuses en utilisant la surveillance en temps réel de l’impédance électrique des cellules infectées. Une application pratique de cette méthode est présentée en quantifiant la désintégration du virus de la grippe A sous différents paramètres physicochimiques imitant les conditions environnementales.

Résumé

Les méthodes de quantification des particules virales représentent un aspect essentiel de nombreuses études virologiques. Bien qu’il existe plusieurs techniques fiables, elles prennent beaucoup de temps ou sont incapables de détecter de petites variations. Présenté ici est un protocole pour la quantification précise du titre viral en analysant les variations d’impédance électrique des cellules infectées en temps réel. L’impédance cellulaire est mesurée à l’aide de biocapteurs à microélectrodes d’or situés sous les cellules dans des microplaques, dont l’ampleur dépend du nombre de cellules ainsi que de leur taille et de leur forme. Ce protocole permet une analyse en temps réel de la prolifération, de la viabilité, de la morphologie et de la migration cellulaires avec une sensibilité accrue. Un exemple d’application pratique est également fourni en quantifiant la désintégration du virus de la grippe A (VAI) soumise à divers paramètres physicochimiques affectant l’infectiosité virale au fil du temps (c.-à-d. température, salinité et pH). Pour de telles applications, le protocole réduit la charge de travail nécessaire tout en générant des données de quantification précises des particules virales infectieuses. Il permet de comparer les pentes d’inactivation entre différents IAV, ce qui reflète leur capacité à persister dans un environnement donné. Ce protocole est facile à réaliser, est hautement reproductible et peut être appliqué à tout virus produisant des effets cytopathiques en culture cellulaire.

Introduction

La transmission d’un virus repose sur la combinaison de plusieurs facteurs. Pour un virus sécrété dans l’environnement, sa transmission dépend également de sa capacité à persister dans des conditions extérieures à l’hôte. L’étude de l’inactivation virale en général est donc une étape cruciale pour aider les autorités sanitaires nationales et les décideurs politiques à mettre en œuvre des mesures de contrôle et de biosécurité.

Les connaissances sur la persistance du virus dans les milieux naturels et de laboratoire ont considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. Dans le cas des virus de la grippe A (IAV), leurs voies de trans

Protocole

Manipuler tous les virus de la grippe selon les exigences appropriées en matière de niveau de biosécurité (BSL-2 ou plus selon le sous-type). Utilisez des souches IAV avec un faible historique de passage (moins de 5x sur les cellules MDCK) pour assurer une faible variation entre les expériences.

1. Préparation des réactifs et des matières premières

1. Préparation de cellules MDCK et d’un milieu de culture cellulaire stérile
   1. Cultiver des cellules du rein canin Madin-Darby (MDCK) dans un milieu d’Eagle modifié (MEM) complété par du sérum de veau fœtal inactivé à la chaleur (FCS) et des antibiotiques (100 unités / mL de pénicill

Résultats

Les données brutes obtenues après 120 h avec différentes concentrations de cellules MDCK, de 15 000 à 120 000 cellules par puits, sont présentées à la figure 1. Après 24 h, les mesures de l’IC montrent que les cellules dans les puits ensemencés avec 30 000 cellules étaient encore dans la phase exponentielle de croissance, et cette concentration cellulaire a été utilisée pour d’autres expériences. La figure 2 illustre la corrélation linéaire e...

Discussion

RtCA est une technologie basée sur l’impédance qui est de plus en plus utilisée pour la surveillance en temps réel des propriétés cellulaires, telles que l’adhérence cellulaire, la prolifération, la migration et la cytotoxicité. Dans cette étude, la capacité de cette technologie à évaluer la survie de la VAI à l’extérieur de l’hôte est démontrée en mesurant la pente d’inactivation du virus. Les techniques fastidieuses telles que _TCID50 et les tests de plaque sont remplacées par une...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25%Trypsin	ThermoFisher	25200056
75 cm2 tissue culture flask	Falcon	430641U
E-Plate 16 (6 plates)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	E-plates are avalible in different packaging
FCS	Life technologies (gibco)	10270-106
MEM 1X	Life technologies (gibco)	31095029
PBS 1X	Life technologies (gibco)	14040091
Penicillin-Streptomycin	Life technologies (gibco)	11548876
TPCK-Trypsin	Worthington	LS003740
xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)