げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

要約

血液脳関門(BBB)は、マイクロバブル媒介性集中超音波(FUS)で一時的に破壊することができる。ここでは、非超音波専門家がアクセス可能なモジュラーFUSシステムを使用して、高スループットBBBのインビボでの開口のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。

要約

血液脳関門(BBB)は、様々な脳疾患の治療のための主要なハードルとなっています。狭い接合によって連結された内皮細胞は、大きな分子(>500 Da)が脳組織に入るのを防ぐ生理的障壁を形成する。マイクロバブル媒介型集中超音波(FUS)は、一過性の局所BBB開口部を誘導するために使用することができ、より大きな薬物が脳の気質に入ることを可能にする。

臨床翻訳のための大規模な臨床装置に加えて、薬剤候補の治療応答評価のための前臨床研究は、標的BBB開口部のための専用の小動物超音波セットアップを必要とする。これらのシステムは、高空間精度と統合キャビテーションモニタリングの両方でハイスループットのワークフローを可能にする一方で、初期投資コストとランニングコストの両方でコスト効率が良いものです。

ここでは、市販成分に基づき、前述の要件を満たす生物発光及びX線誘導体系小型動物FUSシステムを提示する。特に、大量の前臨床薬物評価研究で一般的に遭遇する課題を促進する高度な自動化に重点が置かれている。これらの課題の例として、データの再現性を確保し、グループ内変動を低減し、サンプルサイズを削減し、倫理的要件に準拠し、不要な作業負荷を軽減するために標準化が必要です。提案されたBBBシステムは、多形性神経膠芽腫およびびまん性正中性神経膠腫の患者由来異種移植片モデルに対するBBB開封促進薬物送達試験の範囲で検証された。

概要

血液脳関門(BBB)は、脳のパレンチマへの薬物送達のための主要な障害です。開発されたほとんどの治療薬は、その物理化学的パラメータ(例えば、親油性、分子量、水素結合アクセプターおよびドナー)のためにBBBを横断しないか、^{または脳内}の流出輸送体に対する親和性のために保持されない^1、2。BBBを横断できる薬物の小さなグループは、典型的には小さな親油性分子であり、これは限られた数の脳疾患^1,2にのみ有効である。その結果、大多数の脳疾患では、薬理学的治療の選択肢が限られており、新しい薬物送達戦略が^3,4に必要である。

治療超音波は、BBB破壊(BBBD)、神経変調、およびアブレーション^{4、5、6、7}などの異なる神経学的用途に使用することができる新たな技術である。頭蓋骨を介して体外超音波エミッタを有するBBB開口部を達成するために、集中超音波(FUS)は、マイクロバブルと組み合わされる。マイクロバブル媒介FUSは、脳のパレンチマ^5、8、9における薬物の生物学的利用能の増加^{をもたらす}。音波の存在下では、マイクロバブルがBBBの内皮細胞間の緊密な接合部の開始と破壊を開始し、より大きな分子¹⁰の細胞内輸送を可能にする。これまでの研究では、音響放射の強度とBBB開口部11、12、13、14に及ぼす生物学的影響との相関が確認された。FUSは、マイクロバブルと組み合わせて、化学療法剤としてテモゾロミドまたはリポソームドキソルビシンを用いた神経膠芽腫の治療、またはアルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症^{5、9、15、16}の治療に対する臨床試験で既に使用されている。

超音波は、薬物療法のための全く新しい可能性のBBB開口部を介して仲介するので、臨床翻訳のための前臨床研究は、選択された薬物候補の治療応答を評価するために必要とされる。通常、高空間精度の高スループット ワークフローと、高い再現性を備えたターゲット BBB 開口部の監視用の統合キャビテーション検出が必要です。可能であれば、これらのシステムは、研究規模に応じてスケーラブルにするために、初期投資とランニングコストの両方でコスト効率が高い必要があります。ほとんどの前臨床FUSシステムは、画像誘導および治療計画^{15、17、18、19}のためにMRIと組み合わされる。MRIは腫瘍の解剖学と容積に関する詳細な情報を提供するが、それは一般的に訓練を受けた/熟練したオペレータによって行われる高価な技術である。さらに、高精細MRIは、常に前臨床施設の研究者が利用できるとは限らず、動物1匹あたりのスキャン時間が長く必要であり、高スループットの薬理学的研究にはあまり適していません。注目すべきは、神経腫瘍学の分野における前臨床研究、特に浸潤性腫瘍モデルのために、腫瘍を可視化し標的にする可能性が治療の成功²⁰に不可欠である。現在、この要件はMRIまたは光タンパク質を導入した腫瘍によってのみ満たされ、光タンパク質基質の投与と組み合わせて生物発光イメージング(BLI)による可視化を可能にする。

MRI誘導FUSシステムは、多くの場合、経頭蓋適用のための超音波の伝播を確実にするために水浴を使用し、それによって動物の頭部は部分的に水中に沈み、いわゆる'ボトムアップ'システム^{15、17、18。}これらの設計は一般的に小さな動物実験でうまく機能しますが、使用中の動物の準備時間、移植性、現実的に維持可能な衛生基準の間の妥協点です。MRIの代替として、立体的ナビゲーションのための他の誘導方法は、げっ歯類解剖学的アトラス^{21、22、23、}レーザーポインタ支援視覚目撃^24、ピンホール支援機械スキャン装置^25、またはBLI²⁶の使用を包含する。これらの設計のほとんどは、トランスデューサーが動物の頭の上に置かれ、動物が自然な位置に置かれる「トップダウン」システムです。'トップダウン'のワークフローは、水浴^22、25、26または水で満たされたコーン^21、24のいずれかで構成されています。閉じたコーンの内部のトランスデューサーを使用することの利点は、よりコンパクトなフットプリント、セットアップ時間の短縮、簡単な除染の可能性がワークフロー全体を簡素化することです。

マイクロバブルとの音響場の相互作用は圧力依存性であり、低振幅振動(安定キャビテーションと呼ばれる)から過渡的な気泡崩壊(慣性キャビテーションと呼ばれる^)27,28に及ぶ。超音波BBBDは、BBBDを成功させるために安定キャビテーション閾値をはるかに上回る音響圧力を必要とするが、慣性キャビテーション閾値を下回るが、一般的に血管/神経損傷²⁹に関連しているという確立されたコンセンサスがある。監視および制御の最も一般的な形態は、McDannoldらが示唆する(バック)散乱音響信号の分析である受動的キャビテーション検出(PCD)である。PCDは、安定キャビテーションの特徴(高調波、低調波、超高調波)と慣性キャビテーションマーカー(ブロードバンド応答)の強度と外観をリアルタイムで測定できるマイクロバブル放出信号のフーリエスペクトルの分析に依存しています。

精密な圧力制御のためのPCD解析は、マイクロバブル製剤の多分散性(振動振幅はバブル径に強く依存する)、ブランド間の気泡殻特性の違い、および音響振動の周波数と圧力^30、31、32に強く依存する音響振動のために、正確な圧力制御のためのPCD分析が複雑である。その結果、多くの異なるPCD検出プロトコルが提案されており、これらのすべてのパラメータの特定の組み合わせに適応し、様々なアプリケーションシナリオ(小動物プロトコルを介したインビトロ実験から臨床用PCDまで)で使用され、堅牢なキャビテーション検出、さらには圧力^{11、14、30、31、32、33、34の}遡及フィードバック制御に使用されています。本研究の範囲で用いられるPCDプロトコルはMcDannoldら¹²に直接由来し、慣性キャビテーション検出のための安定キャビテーションおよび広帯域ノイズの存在のために高調波放出を監視する。

脳のパレンチマへの薬物送達を増加させるBBBの一過性開口のための画像誘導神経ナビゲーションFUSシステムを開発しました。このシステムは、市販のコンポーネントに基づいており、動物施設で利用可能なイメージング技術に応じて、いくつかの異なるイメージングモダリティに容易に適応することができます。高スループットのワークフローが必要なため、画像誘導と治療計画にはX線とBLIを使用することを選択しました。光タンパク質を用いてトランスニューされる腫瘍細胞(例えば、ルシメラーゼ)はBLIイメージング²⁰に適している。光タンパク質基質の投与後、腫瘍細胞は生体内でモニタリングすることができ、腫瘍の成長および位置は^20,36と判定することができる。BLIは、低コストのイメージングモダリティであり、経時の腫瘍の成長に従うことを可能にし、高速なスキャン時間を有し、MRI^36、37で測定された腫瘍増殖と良好に相関する。私たちは、げっ歯類が取り付けられているプラットフォームを自由に動かすための柔軟性を可能にするために、トランスデューサーに取り付けられた水で満たされたコーンで水浴を置き換えることを選びました^8,24.この設計は、X線と光学画像の両立性(III)急速着脱可能な麻酔マスク、および(IV)統合された温度調節された動物加熱システムを備えた(I)小動物立体立体性プラットフォーム(II)受託者マーカーの統合を備えた取り外し可能なプラットフォームに基づいています。麻酔の最初の誘導の後、動物は全体のプロシージャの間に残るプラットホームの精密な位置に取付けられる。その結果、プラットフォーム全体が、正確で再現可能な位置決めと持続麻酔を維持しながら、介入全体のワークフローのすべてのステーションを通過します。この制御ソフトウェアは、受託者マーカーの自動検出を可能にし、すべてのタイプの画像と画像モダリティ(マイクロCT、X線、BLIおよび蛍光イメージング)を、立体的プラットフォームの基準フレームに自動的に登録します。自動較正手順の助けを借りて、超音波トランスデューサの焦点距離は正確に内部に知られており、介入計画、音響送達およびフォローアップ画像分析の自動融合を可能にする。図 1と図 2に示すように、このセットアップは、専用の実験ワークフローを設計する高い柔軟性を提供し、さまざまなステーションでの動物のインターリーブ処理を可能にし、ハイスループット実験を容易にします。我々は、この技術を用い、びまん性正中神経膠腫などの高悪性神経膠腫のマウス異種移植片における薬物送達に成功した。

プロトコル

すべてのin vivo実験は、オランダの倫理委員会(ライセンス許可番号AVD114002017841)と、オランダのアムステルダム大学の動物福祉団体によって承認されました。研究者は、動物の不快感を最小限に抑えるためにFUSシステムの基礎訓練を受けました。

1. 集中超音波システム

注:記載されているセットアップは、市販のコンポーネントに基づいて社内構築されたBBBディスラプションシステムであり、3Dプリントされたカスタムメイドのコーンと取り外し可能な立体戦術プラットフォームが含まれています。システムは、利用可能な機器と特定の用途に応じて変更を容易にするモジュラー設計されています。プロトコルは、マウス脳のポンチン領域におけるより大きな領域のソノポレーションの手順を記述する。ターゲットの位置を調整することにより、脳の異なる部分を標的とすることができます。この研究では、焦点距離75mmの1MHz単元素トランスデューサ、60mmの絞り、1.5 x 1.5 x 5mm(ピーク圧力のFWHM)の焦点領域を使用しました。トランスデューサの焦点面は、耳の棒と交差する水平面で動物の頭蓋骨を通って配置されます。

1. げっ歯類のBBBの開口部のための適切なトランスデューサを選択してください。
   注:マイクロバブルの特性と採用周波数に基づいて、音響設定、特に機械的指数(MI)は^、13、38に変更される場合があります。
2. 3D プリントされたコーンにトランスデューサを置きます。
3. ビーム伝搬経路の音響結合を達成するために、コーンの底端に音響的に透明なマイラー膜を使用し、脱気水でコーンを満たす。
4. 図1に示すように、トランスデューサを動物の上に取り付け、トランスデューサの自動垂直位置を設定します。
5. 図 1および図 2に示すように、温度調節された加熱、咬傷および耳棒、麻酔およびマルチモダリティ受託マーカーを含む、研究の要件に基づいて取り外し可能な立体性プラットフォームを設計する。立体的プラットフォームの取り付けは、ビームの下で動物の正確な自動位置決め(<0.1mm)を可能にする2D線形段階システムで構成されています。
6. トランスデューサを、トランスデューサ、ファンクションジェネレータ、パワーアンプからなる 図1 に示す音響発光チェーンに接続します。
7. 画像処理パイプラインを考案して、針ハイドロフォンによって検出された脳領域の正確なソノポレーションターゲティングとキャビテーションデータの収集を可能にするマルチモダリティ受託マーカーを検出します。
8. システムを較正し、立体性プラットフォーム上の動物の垂直位置に対応してトランスデューサの焦点点を決定する。

2. 動物の準備

注: 次のプロトコルは、マウスに対して指定されていますが、ラットに適合させることができます。これらの実験のために、雌の高胸腺ヌードFoxn1--マウス(6-8週齢)が使用された。

1. 動物施設で少なくとも1週間順応し、定期的に動物の重量を量ることを許可します。
2. FUS治療を開始する30分前に皮下(.c)注射を介してブプレノルフィン(0.05mg/kg)を投与する。
3. 3%のイソフルラン、2 L/分O₂ で動物を麻酔し、動物が深く麻酔されていることを確認します。動物を全手順中に麻酔を付け、呼吸頻度と心拍数を監視してイオブルランの濃度を必要に応じて調整します。
4. ドライアイを防止し、可能な怪我を避けるために、眼軟膏を適用します。
5. かみそりと脱毛クリームで頭の上の髪を取り除き、皮膚への刺激を避けるために任意の残留物を取り除くために水で後で洗います。
6. BLI腫瘍モデルの実験では、BLI画像誘導用に29Gインスリン注射器を用いて、D-ルシフェリン(30mg/mL)腹腔内(i.p.)を150μL注入します。
7. 26-30 Gの尾静脈カテーテルを挿入し、少量のヘパリン溶液(5 UI/mL)でカテーテルと静脈を洗い流します。血液凝固を避けるためにヘパリン溶液でカテーテルを充填します。
   注意:カテーテルに血液が還流すると、良好なカテーテル法が見られます。塞栓を防ぐためにカテーテルの気泡を避けてください。過度の射出圧力を避けるために、カテーテルの長さができるだけ短くしてください。
8. 低体温症を避けるために、温度調整された立体性プラットフォーム上に動物を置きます。
   注:低体温は、マイクロバブルの注射/循環および薬物の薬物動態に影響を与える血液循環を減少させる³⁹。
9. イヤーバーと一口バーを使用して、立体性プラットフォーム上で動物の頭を固定し、固定します。ストラップで体を固定し、プラットフォームに動物の尾をテープ。

3. 生体内画像誘導集中超音波

注:このプロトコルでは、10 msの持続時間を持つトーンバーストパルスを備えた1MHzのモノ要素トランスデューサ、0.4のMI、240秒の40サイクルの1.6 Hzのパルス繰り返し周波数が使用されました。このプロトコルは、硫化物六フッ化物_(SF6)を含むリン脂質を無害なガスとして安定化させたマイクロバブルに最適化されており、それによって平均気泡径は2.5μm、泡の90%以上が8μm未満である。

1. 取り付けられた動物と一緒に立体性プラットフォームをイメージングモダリティ(例えば、BLI またはX線)に配置し、動物の画像を撮ります。
2. 画像処理パイプラインと組み合わせてマルチモダリティの受容マーカーを使用して、トランスデューサのフォーカスポイントに従って動物の位置をマークします。
3. 獲得したX線画像の上に脳の輪郭を配置するか、BLI画像を使用して腫瘍の中心を決定することによって、ターゲット領域を決定する(図2)。脳の特定の部分の位置は、頭蓋骨のマーキングブレグマとラムダを基準点として使用して、パキシノス脳アトラス⁴⁰ で指定されます。例えば、ポンはラムダからx=-1.0、y=-0.8、z=-4.5の位置にあります。
4. 動物の鼻孔と口を粘着テープで保護し、超音波ゲルが呼吸を妨げるのを防ぎます。
5. 動物の頭の上に超音波ゲルを適用します。
6. 動物の首の皮膚を引き込み、針ハイドロフォンを超音波ゲルで潤滑し、針ハイドロフォンを後頭骨の直接近傍に置く。
7. 画像処理パイプラインとフォーカスポイントを使用して、トランスデューサを正しい位置に導きます。
8. あらかじめ構成された設定を接続されているすべてのデバイスに適用し、対象となる脳領域をターゲットにします。
   注: 研究の質問に応じて、腫瘍または脳領域は、単一の焦点として、または容積形状としてソノポポできます( 図2を参照)。
9. メーカーの説明に従ってマイクロバブルをアクティブにします。120 μL (5.4 μg) のマイクロバブルを 1 個注入します。
10. 尾静脈カテーテルを生理食い物で洗い流し、カテーテルの開口部を確認します。
11. マイクロバブルを注入し、インソネーションを開始します。
12. 針ハイドロフォンでマイクロバブルキャビテーションを記録します。
13. 血管内造影剤または薬物を、ソノポレーション後に投与する。用量, タイミングと計画は、研究の目的と薬に依存します。
    注:エヴァンスブルーはBBBの開口部⁴¹を評価するための一般的なカラーエージェントです。
14. 所定の時間ポイントまで、または人道的エンドポイントの前まで動物を監視します。

4. マイクロバブルキャビテーションの解析

注:ここでは、MDannoldらが最初に示唆したように、1MHzの周波数で10msの持続時間のバーストトーンパルスで励起された平均直径2.5μm(8μm以下の気泡の80%)を有する_SF6-リン脂質微小気泡の生体内実験に適した適用手順を^{説明する。}

1. フーリエは、記録されたPCD信号を時間領域から周波数領域に変換します。
2. 図 3 (2 MHz と 3 MHz の緑色のボックス) に示すように、得られたスペクトルパワーを統合して、2^番目と 3^番目の高調波 (± 50 kHz) の周囲で安定したキャビテーション検出を行います。
3. 図3(赤いボックス)に示すように、慣性キャビテーション検出のためのスペクトルパワーを、主周波数、2^番目、3^番目の高調波、第1^および第^2の超高調波および第1の低調波(±150kHz)の間に統合します。
4. 従来取得した PCD 信号の両方の正規化のために、原理周波数(1 MHz ± 50 kHz)の周囲にスペクトルパワーを統合します。
   注:PCDシグナルは、1MHzでの生体内実験における_SF6-リン脂質微小気泡の場合、 図3に示すように、慣性キャビテーションが設定される前に超高調波またはサブハーモニクスを表示しない。

結果

記載のFUSシステム(図1 および 図2)および関連ワークフローは100匹以上の動物に使用され、健常マウスおよび腫瘍軸受マウスの両方で再現可能なデータを生成した。マイクロバブルボーラス噴射のピークモーメントにおける記録キャビテーションと高調波におけるスペクトル密度に基づいて、各周波数のスペクトルパワーは、プロトコルのステップ4...

ディスカッション

本研究では、脳のパレンチマへの薬物送達増加のための一過性BBB破壊のための費用対効果の高い画像誘導ベースのFUSシステムを開発した。このシステムは、主に市販のコンポーネントとX線およびBLIと組み合わせて構築されました。提案された設計のモジュール性は、高スループットワークフローでの計画と評価のためのいくつかのイメージングモダリティの使用を可能にします。このシステ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL luer-lock syringe	Becton Dickinson	309628	Plastipak
19 G needle	Terumo Agani	8AN1938R1
23 G needle	Terumo Agani	8AN2316R1
3M Transpore surgical tape	Science applied to life	7000032707	or similar
Arbitrary waveform generator	Siglent	n.a.	SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s
Automated stereotact	in-house built	n.a.	Stereotact with all elements were in-house built
Bruker In-Vivo Xtreme	Bruker	n.a.	Includes software
Buffered NaCl solution	B. Braun Melsungen AG	220/12257974/110
Buprenorfine hydrochloride	Indivior UK limitd	n.a.	0.324 mg
Cage enrichment: paper-pulp smart home	Bio services	n.a.
Carbon filter	Bickford	NC0111395	Omnicon f/air
Ceramic spoon	n.a	n.a.
Cotton swabs	n.a.	n.a.
D-luciferin, potassium salt	Gold Biotechnology	LUCK-1
Ethanol	VUmc pharmacy	n.a.	70%
Evans Blue	Sigma Aldrich	E2129
Fresenius NaCl 0.9%	Fresenius Kabi	n.a.	NaCl 0.9 %, 1000 mL
Histoacryl	Braun Surgical	n.a.	Histoacryl 0.5 mL
Hydrophone	Precision Acoustics	n.a.
Insulin syringe	Becton Dickinson	324825/324826	0.5 mL and 0.3 mL
Isoflurane	TEVA Pharmachemie BV	8711218013196	250 mL
Ketamine	Alfasan	n.a.	10 %, 10 mL
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet	Envigo	2918-11416M
Neoflon catheter	Becton Dickinson	391349	26 GA 0.6 x 19 mm
Oscilloscope	Keysight technologies	n.a.	InfiniiVision DSOX024A
Plastic tubes	Greiner bio-one	210261	50 mL
Power amplifier	Electronics & Innovation Ltd	210L	Model 210L
Preamplifier DC Coupler	Precision Acoustics	n..	Serial number: DCPS94
Scissors	Sigma Aldrich	S3146-1EA	or similar
Sedazine	AST Farma	n.a.	2%
SonoVue microbubbles	Bracco	n.a.	8 µl/ml
Sterile water	Fresenius Kabi	n.a.	1000 mL
Syringe	n.a.	n.a.	various syringes can be used
Temgesic	Indivior UK limitd	n.a.	0.3 mg/ml
Transducer	Precision Acoustics	n.a.	1 MHz
Tweezers	Sigma Aldrich	F4142-1EA	or similar
Ultrasound gel	Parker Laboratories Inc.	01-02	Aquasonic 100
Vidisic gel	Bausch + Lomb	n.a.	10 g