Un système de neuronavigation stéréotaxique et d’ultrasons focalisés guidé par image à haut débit pour l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique chez les rongeurs

Résumé

La barrière hémato-encéphalique (BHE) peut être temporairement perturbée par des ultrasons focalisés médiés par microbulles (FUS). Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour l’ouverture BHE à haut débit in vivo à l’aide d’un système FUS modulaire accessible aux experts non-ultrasons.

Résumé

La barrière hémato-encéphalique (BHE) a été un obstacle majeur pour le traitement de diverses maladies du cerveau. Les cellules endothéliales, reliées par des jonctions serrées, forment une barrière physiologique empêchant les grosses molécules (>500 Da) de pénétrer dans le tissu cérébral. L’ultrason focalisé médié par microbulles (FUS) peut être employé pour induire une ouverture locale transitoire de BBB, permettant aux drogues plus grandes d’entrer dans le parenchyme de cerveau.

En plus des dispositifs cliniques à grande échelle pour l’application clinique, la recherche préclinique pour l’évaluation de la réponse au traitement des candidats médicaments nécessite des configurations d’échographie dédiées aux petits animaux pour l’ouverture ciblée de la BHE. De préférence, ces systèmes permettent des flux de travail à haut débit avec une précision spatiale élevée ainsi qu’une surveillance intégrée de la cavitation, tout en étant rentables en termes d’investissement initial et de coûts d’exploitation.

Ici, nous présentons un système FUS stéréotaxique de petit animal guidé par bioluminescence et par rayons X qui est basé sur des composants disponibles dans le commerce et répond aux exigences susmentionnées. Un accent particulier a été mis sur un degré élevé d’automatisation facilitant les défis généralement rencontrés dans les études précliniques d’évaluation des médicaments à volume élevé. Des exemples de ces défis sont la nécessité d’une normalisation afin d’assurer la reproductibilité des données, de réduire la variabilité intragroupe, de réduire la taille de l’échantillon et, par conséquent, de se conformer aux exigences éthiques et de réduire la charge de travail inutile. Le système BHE proposé a été validé dans le cadre d’essais d’administration de médicaments facilités par ouverture de BBB sur des modèles de xénogreffe dérivés du patient de glioblastome multiforme et de gliome diffus de midline.

Introduction

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est un obstacle majeur à l’administration de médicaments dans le parenchyme cérébral. La plupart des médicaments thérapeutiques qui ont été développés ne franchissent pas la BHE en raison de leurs paramètres physico-chimiques (par exemple, lipphilie, poids moléculaire, accepteurs de liaison hydrogène et donneurs) ou ne sont pas conservés en raison de leur affinité pour les transporteurs d’efflux dans le cerveau^1,2. Le petit groupe de médicaments qui peuvent traverser la BHE sont généralement de petites molécules lipophiles, qui ne sont efficaces que dans un nombre limité de maladies du cerveau^1,2. En conséquence, pour la majorité des maladies du cerveau, les options de traitement pharmacologique sont limitées et de nouvelles stratégies d’administration de médicaments sont nécessaires^3,4.

L’échographie thérapeutique est une technique émergente qui peut être utilisée pour différentes applications neurologiques telles que la perturbation de la BHE (BBBD), la neuromodulation et l’ablation^4,5,6,7. Afin d’obtenir une ouverture BBB avec un émetteur ultrasonoreal extracorporeal à travers le crâne, ultrasons focalisés (FUS) est combiné avec des microbulles. Fus microbulles-négociés entraîne une biodisponibilité accrue des médicaments dans le parenchyme cérébral^5,8,9. En présence d’ondes sonores, les microbulles commencent à osciller en initiant la transcytose et la perturbation des jonctions serrées entre les cellules endothéliales de la BHE, permettant le transport paracellulaire de molécules plus grosses^10. Des études antérieures ont confirmé la corrélation entre l’intensité de l’émission acoustique et l’impact biologique sur l’ouverture BBB^11,12,13,14. FUS en association avec des microbulles a déjà été utilisé dans des essais cliniques pour le traitement du glioblastome en utilisant le témozolomide ou la doxorubicine liposomale comme agent chimiothérapeutique, ou pour le traitement de la maladie d’Alzheimer et de la sclérose latérale amyotrophique^5,9,15,16.

Puisque l’ouverture de BBB négociée par ultrasons a comme conséquence des possibilités entièrement nouvelles pour la pharmacothérapie, la recherche préclinique pour l’application clinique est nécessaire pour évaluer la réponse de thérapie des candidats médicamenteux sélectionnés. Cela nécessite généralement un flux de travail à haut débit avec une précision spatiale élevée et de préférence une détection de cavitation intégrée pour la surveillance de l’ouverture BHE ciblée avec une reproductibilité élevée. Si possible, ces systèmes doivent être rentables en termes d’investissement initial et de coûts d’exploitation afin d’être évolutifs en fonction de la taille de l’étude. La plupart des systèmes FUS précliniques sont combinés avec l’IRM pour le guidage d’image et la planification du traitement^15,17,18,19. Bien que l’IRM donne des informations détaillées sur l’anatomie et le volume de la tumeur, il s’agit d’une technique coûteuse, qui est généralement effectuée par des opérateurs formés / qualifiés. De plus, l’IRM à haute résolution n’est pas toujours disponible pour les chercheurs dans les installations précliniques et nécessite de longs temps de balayage par animal, ce qui la rend moins adaptée aux études pharmacologiques à haut débit. Il convient de noter que, pour la recherche préclinique dans le domaine de la neuro-oncologie, en particulier les modèles tumoraux infiltrants, la possibilité de visualiser et de cibler la tumeur est essentielle pour la réussite du traitement²⁰. Actuellement, cette exigence n’est remplie que par IRM ou par des tumeurs transduites avec une photoprotéine, permettant la visualisation avec imagerie par bioluminescence (BLI) en combinaison avec l’administration du substrat photoprotéique.

Les systèmes FUS guidés par IRM utilisent souvent un bain-marie pour assurer la propagation des ondes ultrasonores pour les applications transcrâniennes, par lequel la tête de l’animal est partiellement immergée dans l’eau, les systèmes dits « ascendants »^15,17,18. Bien que ces conceptions fonctionnent généralement bien dans les études sur les petits animaux, elles constituent un compromis entre les temps de préparation des animaux, la portabilité et les normes d’hygiène réalistes et maintenables pendant l’utilisation. Comme alternative à l’IRM, d’autres méthodes de guidage pour la navigation stéréotaxique englobent l’utilisation d’un atlas anatomique de rongeur^{21,22, 23,}d’une observation visuelle assistée par pointeur laser^24,d’un dispositif de balayage mécanique assisté par sténopé^25,ou D’un BLI^26. La plupart de ces conceptions sont des systèmes « top-down » dans lesquels le transducteur est placé sur le dessus de la tête de l’animal, avec l’animal dans une position naturelle. Le flux de travail « descendant » consiste soit en un bain-marie^22,25,26, soit en un cône rempli d’eau^21,24. L’avantage d’utiliser un transducteur à l’intérieur d’un cône fermé est l’encombrement plus compact, le temps de configuration plus court et les possibilités de décontamination simples simplifiant l’ensemble du flux de travail.

L’interaction du champ acoustique avec les microbulles dépend de la pression et va des oscillations de faible amplitude (appelées cavitation stable) à l’effondrement transitoire des bulles (appelé cavitation inertielle)^27,28. Il existe un consensus établi selon lequel l’échographie-BBBD nécessite une pression acoustique bien supérieure au seuil de cavitation stable pour obtenir une BBBD réussie, mais inférieure au seuil de cavitation inertielle, qui est généralement associé à des dommages vasculaires / neuronaux^29. La forme la plus courante de surveillance et de contrôle est l’analyse du signal acoustique (rétro-)dispersé à l’aide de la détection de cavitation passive (PCD), comme le suggèrent McDannold et al.¹². PCD s’appuie sur l’analyse des spectres de Fourier des signaux d’émission de microbulles, dans lesquels la force et l’apparence des caractéristiques de cavitation stables (harmoniques, sous-harmoniques et ultraharmoniques) et des marqueurs de cavitation inertielle (réponse à large bande) peuvent être mesurées en temps réel.

Une analyse PCD « taille unique » pour un contrôle précis de la pression est compliquée en raison de la polydispersité de la formulation de microbulles (l’amplitude d’oscillation dépend fortement du diamètre de la bulle), des différences dans les propriétés de la coque de la bulle entre les marques et de l’oscillation acoustique, qui dépend fortement de la fréquence et de la pression^30,31,32. En conséquence, de nombreux protocoles de détection pcd différents ont été suggérés, qui ont été adaptés à des combinaisons particulières de tous ces paramètres et ont été utilisés dans divers scénarios d’application (allant de l’expérimentation in vitro sur des protocoles de petits animaux à PCD pour un usage clinique) pour la détection de cavitation robuste et même pour le contrôle rétroactif de rétroaction de la pression^{11,14,30, 31,32,33,34,35.} Le protocole PCD utilisé dans la portée de cette étude est dérivé directement de McDannold et al.¹² et surveille l’émission harmonique pour la présence d’une cavitation stable et d’un bruit à large bande pour la détection de la cavitation inertielle.

Nous avons développé un système FUS de neuronavigation guidé par l’image pour l’ouverture transitoire de la BHE afin d’augmenter l’administration de médicaments dans le parenchyme cérébral. Le système est basé sur des composants disponibles dans le commerce et peut être facilement adapté à plusieurs modalités d’imagerie différentes, en fonction des techniques d’imagerie disponibles dans l’installation pour animaux. Étant donné que nous avons besoin d’un flux de travail à haut débit, nous avons choisi d’utiliser les rayons X et le BLI pour le guidage d’image et la planification du traitement. Les cellules tumorales transduites avec une photoprotéine (par exemple, luciférase) conviennent à l’imagerie BLI²⁰. Après l’administration du substrat photoprotéique, les cellules tumorales peuvent être surveillées in vivo et la croissance et l’emplacement de la tumeur peuvent être^{déterminés 20,36}. BLI est une modalité d’imagerie à faible coût, il permet de suivre la croissance tumorale au fil du temps, il a des temps de balayage rapides et il est bien corrélé avec la croissance tumorale mesurée par IRM^36,37. Nous avons choisi de remplacer le bain-marie par un cône rempli d’eau fixé au transducteur pour permettre la flexibilité de déplacer librement la plate-forme sur laquelle le rongeur est monté^8,24. La conception est basée sur une plate-forme détachable équipée de l’intégration (I) de la plate-forme stéréotaxique des petits animaux (II) marqueurs fiduciaux avec compatibilité aux rayons X et à l’image optique (III) masque d’anesthésie rapide-détachable, et (IV) système de chauffage animal à température réglée intégrée. Après l’induction initiale de l’anesthésie, l’animal est monté dans une position précise sur la plate-forme où il reste pendant toute la procédure. Par conséquent, l’ensemble de la plate-forme passe toutes les stations du flux de travail de l’ensemble de l’intervention, tout en maintenant un positionnement précis et reproductible et une anesthésie soutenue. Le logiciel de contrôle permet la détection automatique des marqueurs fiduciaux et enregistre automatiquement tous les types d’images et de modalités d’image (c’est-à-dire micro-CT, rayons X, BLI et imagerie par fluorescence) dans le cadre de référence de la plate-forme stéréotaxique. À l’aide d’une procédure d’étalonnage automatique, la distance focale du transducteur à ultrasons est précisément connue à l’intérieur, ce qui permet la fusion automatique de la planification interventionnelle, de la livraison acoustique et de l’analyse d’imagerie de suivi. Comme le montrent les figures 1 et 2,cette configuration offre un degré élevé de flexibilité pour concevoir des flux de travail expérimentaux dédiés et permet une manipulation entrelacée de l’animal à différentes stations, ce qui facilite les expériences à haut débit. Nous avons employé cette technique pour la livraison réussie de drogue dans les xénogreffes de souris du glioma à haute teneur tel que le glioma diffus de midline.

Protocole

Toutes les expériences in vivo ont été approuvées par le comité d’éthique néerlandais (numéro de permis avd114002017841) et l’organisme de protection des animaux de la Vrije Universiteit Amsterdam, aux Pays-Bas. Les enquêteurs ont été formés aux bases du système FUS afin de minimiser l’inconfort des animaux.

1. Système d’ultrasons focalisés

REMARQUE: La configuration décrite est un système de perturbation BBB construit en interne basé sur des composants disponibles dans le commerce et comprend un cône sur mesure imprimé en 3D et une plate-forme stéréotaxique détachable. Le système est conçu modulaire, ce qui facilite les modifications en fonction de l’équipement disponible et de l’utilisation spécifique. Le protocole décrit la procédure pour la sonoporation d’une plus grande zone dans la région pontine du cerveau de souris. En ajustant l’emplacement de la cible, différentes parties du cerveau pourraient être ciblées. Dans cette étude, un transducteur mono-élément de 1 MHz avec une distance focale de 75 mm, une ouverture de 60 mm et une zone focale de 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM de pression de crête) a été utilisé. Le plan focal du transducteur est positionné à travers le crâne de l’animal dans le plan horizontal se croisant avec les barres d’oreille.

1. Sélectionnez un transducteur approprié pour l’ouverture de la BHE chez les rongeurs.
   NOTE: Sur la base des propriétés des microbulles et de la fréquence employée, les réglages acoustiques, en particulier l’indice mécanique (MI), sont sujets à changement^13,38.
2. Placez le transducteur dans le cône imprimé en 3D.
3. Utilisez une membrane mylar acoustiquement transparente à l’extrémité inférieure du cône pour obtenir un couplage acoustique du chemin de propagation du faisceau et remplissez le cône d’eau dégazée.
4. Monter le transducteur au-dessus de l’animal sur un étage linéaire motorisé comme le montre la figure 1 permettant un positionnement vertical automatique du transducteur.
5. Concevoir une plate-forme stéréotaxique détachable basée sur les exigences de l’étude, qui comprend le chauffage à température régulée, les barres de morsure et d’oreille, l’anesthésie et les marqueurs fiduciaux multimodaux, comme le montrent les figures 1 et 2. Le montage de la plate-forme stéréotaxique consiste en un système de scène linéaire 2D, qui permet un positionnement automatique précis (< 0,1 mm) de l’animal sous le faisceau.
6. Connectez le transducteur à la chaîne d’émission acoustique représentée sur la figure 1 constituée d’un transducteur, d’un générateur de fonctions et d’un amplificateur de puissance.
7. Concevoir un pipeline de traitement d’image pour détecter les marqueurs fiduciaux multi-modalité qui permet un ciblage précis de sonoporation de la zone d’intérêt du cerveau et la collecte des données de cavitation détectées par l’hydrophone de l’aiguille.
8. Calibrer le système et déterminer le point de focalisation du transducteur en correspondance avec le positionnement vertical de l’animal sur la plate-forme stéréotaxique.

2. Préparation des animaux

REMARQUE: Le protocole suivant est spécifié pour les souris, mais peut être adapté pour les rats. Pour ces expériences femelles athymiques nues Foxn1-/- souris (6-8 semaines) ont été utilisés.

1. Permettre à l’animal de s’acclimater pendant au moins une semaine dans l’installation pour animaux et peser l’animal régulièrement.
2. Administrer de la buprénorphine (0,05 mg/kg) par injection sous-cutanée (s.c.) 30 min avant le traitement FUS pour commencer le traitement analgésique.
3. Anesthésier l’animal avec 3% d’isoflurane, 2 L/min_O2 et vérifier que l’animal est profondément anesthésié. Gardez les animaux anesthésiés pendant toute la procédure et surveillez la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque pour ajuster la concentration d’isoflurane au besoin.
4. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire et éviter d’éventuelles blessures.
5. Retirez les cheveux sur le dessus de la tête avec un rasoir et une crème dépilatoire et lavez ensuite à l’eau pour éliminer les résidus afin d’éviter toute irritation de la peau.
6. Pour les expériences avec des modèles de tumeurs BLI, injecter 150 μL de D-luciférine (30 mg/mL) intrapéritonéale (i.p.) avec une seringue à insuline de 29 G pour le guidage de l’image BLI.
7. Insérez un cathéter de veine caudale de 26 à 30 G et rincez le cathéter et la veine avec un petit volume de solution d’héparine (5 UI/mL). Remplissez le cathéter avec une solution d’héparine pour éviter la coagulation du sang.
   REMARQUE: Un bon cathétérisme est observé lorsqu’il y a un reflux de sang dans le cathéter. Évitez les bulles d’air dans le cathéter pour prévenir les embolies. Pour éviter une pression d’injection excessive, assurez-vous que la longueur du cathéter est aussi courte que possible.
8. Placez l’animal sur la plate-forme stéréotaxique à température réglée pour éviter l’hypothermie.
   REMARQUE: L’hypothermie réduit la circulation sanguine, ce qui peut affecter l’injection / circulation des microbulles et la pharmacocinétique des médicaments³⁹.
9. Immobilisez et fixez la tête de l’animal sur la plate-forme stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille et d’une barre de morsure. Fixez le corps avec une sangle et collez la queue de l’animal sur la plate-forme.

3. Ultrasons focalisés guidés par l’image in vivo

REMARQUE: Pour ce protocole, un transducteur mono-élément de 1 MHz avec une impulsion de rafale de tonalité avec une durée de 10 ms, un MI de 0,4 et une fréquence de répétition d’impulsion de 1,6 Hz avec 40 cycles pendant 240 s a été utilisé. Le protocole est optimisé pour les microbulles stabilisées par des phospholipides contenant de l’hexafluorure de soufre_(SF6)comme gaz inoffensif, dont le diamètre moyen des bulles est de 2,5 μm et plus de 90% des bulles sont inférieures à 8 μm.

1. Placez la plate-forme stéréotaxique avec l’animal monté dans la modalité d’imagerie (p. ex. BLI ou rayons X) et prenez la ou les images de l’animal.
2. Utilisez les marqueurs fiduciaux multimodaux en combinaison avec le pipeline de traitement d’image pour marquer la position de l’animal en fonction du point de focalisation du transducteur.
3. Déterminer la zone cible en plaçant un contour du cerveau sur l’image radiographique acquise ou en utilisant des images BLI pour déterminer le centre de la tumeur(Figure 2). La position de parties spécifiques du cerveau est spécifiée dans l’Atlas cérébral Paxinos⁴⁰ en utilisant les marques du crâne bregma et lambda comme points de référence. Par exemple, le pont est situé x=-1.0, y=-0.8 et z=-4.5 de lambda.
4. Protégez les narines et la bouche de l’animal avec du ruban adhésif pour éviter que le gel à ultrasons n’interfère avec la respiration.
5. Appliquez du gel à ultrasons sur le dessus de la tête de l’animal.
6. Rétractez la peau du cou des animaux, lubrifiez l’hydrophone de l’aiguille avec du gel à ultrasons et placez l’hydrophone de l’aiguille à proximité directe de l’os occipital.
7. Guidez le transducteur à la bonne position à l’aide du pipeline de traitement d’image et du point de mise au point.
8. Appliquez les paramètres préconfigurés à tous les périphériques connectés et ciblez la région du cerveau qui vous intéresse.
   REMARQUE: Selon la question de recherche, les régions tumorales ou cérébrales peuvent être sonoporated comme un point focal unique ou comme forme volumétrique, comme le montre la figure 2.
9. Activer les microbulles comme décrit par le fabricant. Injecter un bolus de 120 μL (5,4 μg) de microbulles.
10. Rincer le cathéter de la veine caudale avec une solution saline pour vérifier l’ouverture du cathéter.
11. Injectez les microbulles et commencez l’insonation.
12. Enregistrer la cavitation de microbulles avec l’hydrophone à aiguille.
13. Administrer un agent de contraste intravasculaire ou un médicament après sonoporation. La dose, le moment et la planification dépendent de l’objectif de l’étude et du médicament.
    REMARQUE: Evans bleu est un agent de couleur commun pour évaluer l’ouverture BBB⁴¹.
14. Surveiller l’animal jusqu’au point de temps prédéterminé ou avant le paramètre sans cruauté.

4. Analyse de la cavitation des microbulles

REMARQUE: Ici, la procédure appliquée est décrite, quiconvient à l’expérimentation in vivo pour les microbulles de SF 6-phospholipides d’un diamètre moyen de 2,5 μm (80% des bulles inférieures à 8 μm) excitées avec une impulsion de rafale de 10 ms à une fréquence de 1 MHz, comme suggéré à l’origine par McDannold et al.^12.

1. Fourier-transformer le signal PCD enregistré du domaine temporel dans le domaine fréquentiel.
2. Intégrer la puissance spectrale résultante pour une détection de cavitation stable autour de la 2^ème et^3ème harmonique (± 50 kHz), comme le montre la figure 3 (boîte verte à 2 et 3 MHz).
3. Intégrer la puissance spectrale pour la détection de cavitation inertielle, entre la fréquence principale, la 2^ème,la^3ème harmonique, la 1^ème et 2^ème ultraharmonique et la première sous-harmonique (± 150 kHz), comme le montre la figure 3 (boîtes rouges).
4. Intégrer la puissance spectrale autour de la fréquence principale (1 MHz ± 50 kHz) pour la normalisation des deux signaux PCD précédemment obtenus.
   REMARQUE: Le signal PCD, pour les microbulles SF_{6-phospholipides}in vivo à 1 MHz, n’affiche pas d’ultraharmonie ou de sous-harmonie avant que la cavitation inertielle ne s’installe, comme le montre la figure 3.

Résultats

Le système FUS décrit(figure 1 et figure 2)et le flux de travail associé ont été utilisés chez plus de 100 animaux et ont produit des données reproductibles sur des souris saines et porteuses de tumeurs. Sur la base de la cavitation enregistrée et de la densité spectrale aux harmoniques au moment de crête de l’injection de bolus de microbulle, la puissance spectrale de chaque fréquence peut être calculée à l’aide de l’analyse de Fourier comme...

Discussion

Dans cette étude, nous avons développé un système FUS basé sur une image guidée rentable pour la perturbation transitoire de la BHE pour une administration accrue de médicaments dans le parenchyme cérébral. Le système a été en grande partie construit avec des composants disponibles dans le commerce et en conjonction avec les rayons X et BLI. La modularité de la conception proposée permet l’utilisation de plusieurs modalités d’imagerie pour la planification et l’évaluation dans les flux de travail à...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL luer-lock syringe	Becton Dickinson	309628	Plastipak
19 G needle	Terumo Agani	8AN1938R1
23 G needle	Terumo Agani	8AN2316R1
3M Transpore surgical tape	Science applied to life	7000032707	or similar
Arbitrary waveform generator	Siglent	n.a.	SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s
Automated stereotact	in-house built	n.a.	Stereotact with all elements were in-house built
Bruker In-Vivo Xtreme	Bruker	n.a.	Includes software
Buffered NaCl solution	B. Braun Melsungen AG	220/12257974/110
Buprenorfine hydrochloride	Indivior UK limitd	n.a.	0.324 mg
Cage enrichment: paper-pulp smart home	Bio services	n.a.
Carbon filter	Bickford	NC0111395	Omnicon f/air
Ceramic spoon	n.a	n.a.
Cotton swabs	n.a.	n.a.
D-luciferin, potassium salt	Gold Biotechnology	LUCK-1
Ethanol	VUmc pharmacy	n.a.	70%
Evans Blue	Sigma Aldrich	E2129
Fresenius NaCl 0.9%	Fresenius Kabi	n.a.	NaCl 0.9 %, 1000 mL
Histoacryl	Braun Surgical	n.a.	Histoacryl 0.5 mL
Hydrophone	Precision Acoustics	n.a.
Insulin syringe	Becton Dickinson	324825/324826	0.5 mL and 0.3 mL
Isoflurane	TEVA Pharmachemie BV	8711218013196	250 mL
Ketamine	Alfasan	n.a.	10 %, 10 mL
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet	Envigo	2918-11416M
Neoflon catheter	Becton Dickinson	391349	26 GA 0.6 x 19 mm
Oscilloscope	Keysight technologies	n.a.	InfiniiVision DSOX024A
Plastic tubes	Greiner bio-one	210261	50 mL
Power amplifier	Electronics & Innovation Ltd	210L	Model 210L
Preamplifier DC Coupler	Precision Acoustics	n..	Serial number: DCPS94
Scissors	Sigma Aldrich	S3146-1EA	or similar
Sedazine	AST Farma	n.a.	2%
SonoVue microbubbles	Bracco	n.a.	8 µl/ml
Sterile water	Fresenius Kabi	n.a.	1000 mL
Syringe	n.a.	n.a.	various syringes can be used
Temgesic	Indivior UK limitd	n.a.	0.3 mg/ml
Transducer	Precision Acoustics	n.a.	1 MHz
Tweezers	Sigma Aldrich	F4142-1EA	or similar
Ultrasound gel	Parker Laboratories Inc.	01-02	Aquasonic 100
Vidisic gel	Bausch + Lomb	n.a.	10 g